黑龍江省一起牛曼氏桿菌病疫情的暴發(fā)調查

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（1. 中國農業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所，獸醫(yī)生物技術國家重點實驗室，黑龍江哈爾濱 150069；2. 河南省動物疫病預防控制中心， 河南鄭州 450008；3. 中國動物衛(wèi)生與流行病學中心，山東青島 266032）

黑龍江省一起牛曼氏桿菌病疫情的暴發(fā)調查

劉春國1，郭東春1，劉大飛1，曹偉偉2，王靖飛1，韋欣捷3，曲連東1

（1. 中國農業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所，獸醫(yī)生物技術國家重點實驗室，黑龍江哈爾濱 150069；2. 河南省動物疫病預防控制中心， 河南鄭州 450008；3. 中國動物衛(wèi)生與流行病學中心，山東青島 266032）

2015年11月14日至12月14日，黑龍江省某縣多個村從外縣購入的牛發(fā)生不明原因的急性死亡。發(fā)病牛主要表現(xiàn)呼吸道癥狀，從發(fā)病到死亡的時間為幾小時到數(shù)天不等，病死牛剖檢可見嚴重肺炎病變。為揭示疫病暴發(fā)的主要病因，提供防控建議，結合現(xiàn)場流行病學調查和實驗室診斷，對該次疫情開展了調查。調查結果顯示：此次疫情波及6個村，發(fā)病牛多為1歲左右；時值氣候寒冷；疫情發(fā)生前1周左右，有牛調運史。實驗室診斷結果顯示，采集的樣本中均含有未分類的曼氏桿菌，其對氨芐西林和環(huán)丙沙星耐藥，而對頭孢曲松敏感。最終確認本次疫情是由牛群調運、寒冷氣候和年齡等風險因素相互作用，誘發(fā)曼氏桿菌的內源性感染所致。

牛；曼氏桿菌；流行病學；暴發(fā)調查；耐藥性

2015年11—12月，黑龍江省某縣多個村發(fā)生1歲左右牛病死事件。病牛主要表現(xiàn)呼吸道癥狀，從發(fā)病到死亡時間為幾小時到數(shù)天不等，病死牛剖檢可見嚴重肺炎病變。為查明發(fā)病原因，提出防控措施，12月19日，在當?shù)剜l(xiāng)鎮(zhèn)獸醫(yī)的陪同下，對此次疫情開展了回顧性調查，以期為養(yǎng)殖場戶預防類似事件的再次發(fā)生提供借鑒。

1 材料與方法

1.1倫理審查

本次調查研究經中國農業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所實驗動物倫理審查委員會許可，并征得養(yǎng)殖場戶的同意。

1.2病例定義

2015年11月14日至12月14日期間，在黑龍江省某縣下轄村養(yǎng)殖的育肥牛出現(xiàn)咳嗽、流涕、呼吸困難和死亡等癥狀之一的，即判定為疑似病例。PCR檢測和基因分析結果陽性的，即確診為陽性病例。

1.3調查方法

2015年12月19日，在當?shù)孬F醫(yī)陪同下，到疫情所在地某個村（以下簡稱A村）與最先發(fā)病并且疫情最為嚴重的養(yǎng)殖場戶（以下簡稱養(yǎng)殖場戶A）進行現(xiàn)場訪談，了解當?shù)氐酿B(yǎng)殖基本情況和疫病發(fā)生的具體經過等信息，并進行現(xiàn)場流行病學調查和實驗室檢測。

1.4樣本采集

從2個養(yǎng)殖場戶的發(fā)病牛中各采集2份鼻腔拭子。其中，一部分置于30%甘油中，4 ℃保存，待做細菌和支原體鑒定；另一部分置于50%甘油中，-20 ℃保存，待做牛呼吸道疾病相關病毒的鑒定。

1.5實驗室診斷

將采集的4份病牛鼻腔拭子液，接種于血液瓊脂平板上進行細菌學培養(yǎng)鑒定；將純培養(yǎng)的細菌，用梅里埃VITEK 2 Compact 全自動細菌鑒定及藥敏分析系統(tǒng)進行生化和藥敏分析。提取純培養(yǎng)細菌的DNA，用細菌16S rRNA通用引物Bac16sF：5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3'和Bac16sR：5'-GTGTGACGGGCGGTGTGTAC-3'進行PCR鑒定；用牛支原體和牛呼吸道疾病相關病原（包括牛副流感病毒3型、牛傳染性鼻氣管炎病毒、牛病毒性腹瀉病毒和牛呼吸道合胞體病毒）的特異性檢測引物進行PCR檢測。

2 結果

2.1現(xiàn)場流行病學調查結果

2.1.1養(yǎng)殖管理概況。A村地理位置處于東經126°03'，北緯46°75'，距離主干公路202國道3 km。A村共有30戶人家，其中有11戶飼養(yǎng)育肥牛，每戶養(yǎng)殖數(shù)量從十幾頭到四十幾頭不等，共計飼養(yǎng)300余頭。每戶的飼養(yǎng)模式基本相同，即每年10月至11月份從外縣購入1歲左右的牛，育肥至下年的9月份全部出欄。養(yǎng)殖場戶A從2004年開始從事育肥牛養(yǎng)殖，養(yǎng)殖品種主要為西門塔爾牛，少數(shù)為夏洛萊牛。養(yǎng)殖場占地面積約300 m2，養(yǎng)殖數(shù)量為41頭，1歲左右。養(yǎng)殖場內有家犬、老鼠和麻雀出入，偶爾有外來人員來訪，畜主基本不到其他養(yǎng)殖場戶走動。所用的飼料均為正規(guī)飼料公司生產，早晚各飼喂一次。飲用水為自家井水，未經消毒處理，直接飲用。未聘用飼養(yǎng)員，畜主自己飼養(yǎng)。周邊沒有大型活牛交易市場，僅在5 km外有一小型私人屠宰場。之前，該村每年偶爾會出現(xiàn)兩三頭表現(xiàn)嚴重呼吸道癥狀并死亡的牛。牛舍內外沒有生物安全防護設施，糞便每天清理，堆放在門前道路兩邊。沒有養(yǎng)殖檔案，也沒有無害化處理設施。

2.1.2疫情描述。2015年11月5日至9日，A村養(yǎng)殖場戶A從60 km外的B縣不同養(yǎng)殖場戶分3批購入41頭1歲左右的牛，直接混群飼養(yǎng)。最后一批牛引進后第3天進行了口蹄疫疫苗免疫，除此之外，未進行其他疫苗的免疫接種。牛引進后數(shù)日開始表現(xiàn)呼吸道癥狀，初期呈現(xiàn)急性死亡，隨后病期延長。牛發(fā)病后，養(yǎng)殖場戶自行采取抗生素治療，但效果不佳，發(fā)病后第5天，畜主尋求當?shù)孬F醫(yī)診治，效果亦不理想。隨后，自行用多種抗病毒和抗細菌藥物治療。死亡或瀕死的牛只，由私人屠宰場上門拉走，無任何消毒防范措施。12月14日之后，未再出現(xiàn)牛死亡情況。此次疫情中，該養(yǎng)殖場戶共有23頭牛發(fā)病，其中10頭死亡，襲擊率為56.1%，病死率為43.5%。

2.1.3時間分布。2015年11月14日牛群中出現(xiàn)首個病例，第2天死亡；至第5天，發(fā)病數(shù)量增加到4頭；隨后每天發(fā)病數(shù)在0～3頭之間。11月29日牛群停止發(fā)病。12月14日，無新死亡病例。流行曲線見圖1。

2.1.4空間分布。根據養(yǎng)殖場戶和鄉(xiāng)鎮(zhèn)獸醫(yī)描述，此次疫情共波及6個村（分別為A、B、C、D、E、F村）。其中A村最先發(fā)病，并且疫情最為嚴重。A村的11個養(yǎng)殖場戶均發(fā)生疫情，共死亡40余頭牛。其他5個村疫情情況為：B村有5個養(yǎng)殖場戶的小牛發(fā)病；C村3頭小牛發(fā)病死亡；D村有2個養(yǎng)殖場戶的成年牛和小牛發(fā)病，其中死亡小牛3頭 ；E村和F村各有1個養(yǎng)殖場戶的小牛發(fā)病。發(fā)病牛均具有相似的臨床癥狀。這些養(yǎng)殖場戶近期均有從外地引進牛的經歷。養(yǎng)殖場戶A的牛飼養(yǎng)于2個牛棚中（圖2）。A棚舍中的1頭牛首先發(fā)病，隨后發(fā)病的牛在棚舍內隨機分布。

圖1 養(yǎng)殖場戶A的病例時間分布

圖2 養(yǎng)殖場戶A的病例空間分布

2.1.5群間分布。此次疫情中，發(fā)病死亡的牛大多為1歲左右，成年牛較少，未見死亡。

2.1.6臨床及剖檢變化。病牛主要表現(xiàn)為高熱、咳嗽、噴嚏、流黏膿性鼻涕。根據養(yǎng)殖場戶和鄉(xiāng)鎮(zhèn)獸醫(yī)描述，病牛主要表現(xiàn)為嚴重肺炎病變，呈現(xiàn)纖維素性肺炎和漿液纖維素性胸膜炎。肺組織肉樣變，切面呈大理石樣，表現(xiàn)嚴重的肺充血、出血、腫脹、壞死、萎縮，顏色呈暗紅或黑紅色；淋巴結腫大，呈紫色。

2.2實驗室診斷結果

2.2.1細菌分離培養(yǎng)及生化鑒定。將采集的拭子液接種于血液瓊脂平板，37 ℃培養(yǎng)24小時后，可見有灰白色、圓形、光滑、濕潤的，具有溶血特征的露珠樣菌落呈優(yōu)勢生長。革蘭氏染色鏡檢，可見革蘭氏陰性兩端鈍圓短小桿菌。用梅里埃VITEK 2 Compact 全自動細菌鑒定及藥敏分析系進行生化和藥敏鑒定，結果顯示該菌屬于曼氏桿菌屬；該菌對氨芐西林和環(huán)丙沙星耐藥，而對頭孢曲松敏感。

2.2.2鑒別診斷。采用支原體以及牛呼吸道相關病毒性疾病的病原特異性引物進行PCR檢測，結果均為陰性。

2.2.3分子鑒定。提取純培養(yǎng)細菌的DNA，用16S rRNA引物進行PCR鑒定。測序結果用Lasergene7.0中的Seqman拼接后，用Mega5軟件進行遺傳發(fā)育樹構建，結果發(fā)現(xiàn)4個分離菌株（QG1-4）與未分類的曼氏桿菌處于同一進化分支（圖3）。

圖3 基于16S rRNA部分序列的進化樹

3 討論

曼氏桿菌屬包括溶血性曼氏桿菌（Mannkimia haemolytic）[1-2]、肉芽腫曼氏桿菌（Mannkimia granulomatis）[3-4]、反芻獸曼氏桿菌（Mannkimia ruminalis）、多源曼氏桿菌（Mannkimia varigena）[5]和葡萄糖苷曼氏桿菌（Mannkimia glucosida）[6]，以及一部分未分類的曼氏桿菌[7-8]。研究表明，牛曼氏桿菌病主要病原是溶血性曼氏桿菌，但肉芽腫曼氏桿菌、反芻獸曼氏桿菌和多源曼氏桿菌也可導致牛呼吸道疾病。溶血性曼氏桿菌是健康牛上呼吸道中的常在菌，與宿主呈共棲狀態(tài)[9]，在應激因素作用下，可引起內源性感染。本病多呈地方流行或散發(fā)，發(fā)病動物以幼齡為主，病死率較高。本病的發(fā)生一般無明顯的季節(jié)性，但在冷熱交替、氣候劇變、悶熱、潮濕、多雨的時期發(fā)生較多。體溫失調、抵抗力降低也是本病的主要誘因之一。研究表明，溶血性曼氏桿菌作為“運輸熱肺炎”的病原，經常從船運和轉移展覽牛、新購進育肥牛中分離出來[10]。受到應激的牛一般在1～2周后出現(xiàn)典型的肺炎癥狀，潛伏期最短為1～3天。

實驗室診斷結果表明：此次疫情是由未分類曼氏桿菌引起的內源性感染。流行病學調查發(fā)現(xiàn)，此次疫情中，由于病牛調運，導致牛產生應激反應。另外，由于北方11月份天氣寒冷，所引進的都是1歲左右的小牛，而且牛只引進后未觀察隔離即進行口蹄疫疫苗免疫接種。這些因素增加了應激反應的程度，諸多因素共同作用，導致牛抵抗力下降，內源性曼氏桿菌大量增殖，從而誘發(fā)了呼吸道疾病的暴發(fā)。

此次調查比較滯后，而且由于時間原因，僅選擇疫情最嚴重村、最先發(fā)生疫情且最為嚴重的養(yǎng)殖場戶進行調查，而其他養(yǎng)殖場戶和其他村的牛發(fā)病信息，主要來源于被調查養(yǎng)殖場戶和鄉(xiāng)鎮(zhèn)獸醫(yī)的回憶性描述。因此，未能獲得全部的詳實數(shù)據，存在一定的信息偏倚，也未能對疾病進行有效地追蹤和溯源。但選擇的被調查對象具有較好的代表性，在整體上也能還原疫情的經過，流行病學調查和實驗室診斷結果能有效支持所獲得的結論。

4 結論及建議

根據臨床癥狀、病理變化和實驗室檢測結果，并結合流行病學調查數(shù)據，可以判斷此次疫情是由于冬季調運等應激因素導致的1歲左右牛的內源性曼氏桿菌感染。根據該地區(qū)的養(yǎng)殖特點，除了加強常規(guī)的飼養(yǎng)管理和衛(wèi)生防疫以外，對養(yǎng)殖場戶提出如下幾點具體建議：（1）在引進動物時應該選擇良好的天氣，裝車和卸車以及運輸途中盡量減少動物的應激；（2）加強對引進動物的隔離觀察，1周后無臨床癥狀方可混群；（3）牛只引進后2周方可進行疫苗接種；（4）動物一旦發(fā)病，馬上隔離，及時尋求專家?guī)椭M早確診和對癥治療；（5）對病死牛進行無害化處理，避免疫情擴散。

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（責任編輯：朱迪國）

An Outbreak Investigation on Bovine Mannheimiosis in Heilongjiang Province

Liu Chunguo1，Guo Dongchun1，Liu Dafei1，Cao Weiwei2，Wang Jingfei1，Wei Xinjie3，Qu Liandong1
（1. State Key Laboratory of Veterinary Biotechnology，Harbin Veterinary Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Harbin，Heilongjiang 150069；2. Henan Animal Diseases Control & Prevention Center，Zhengzhou，Henan 450008；3. China Animal Health and Epidemiology Center，Qingdao，Shandong 266032）

During November 14th to December 14th，2015，an acute death of unknown origin occurred in cattle purchased from another county in several villages of Heilongjiang province. These diseased cattle mainly showed respiratory symptoms and the time periods of morbidity to death were various（ranging from several hours to a couple of days）. By autopsy diagnosis，severe pneumonia was found. In order to fi nd out the cause and provide suggestions for its prevention and control，an investigation was conducted by fi eld epidemiological survey in combination with laboratory diagnosis. Investigation results showed this outbreak covered 6 villages，most diseased cattle were around the age of 1. In addition，the weather was cold during the epidemic period. And about a week before outbreak，the cattle had been allocated and transported. Based on the results of laboratory diagnosis，it was found that unclassi fi ed Mannkimia existed in all the collected samples，these strains were resistant to both Ampicillin and Cipro fl oxacin，but sensitive to Ceftriaxone. Eventually，the cause of death was con fi rmed as endogenous infection of Mannkimia，which was induced by interaction of major risk factors，including allocation and transportation of the cattle，their ages and the cold weather，etc.

cattle；Mannkimia；epidemiology；outbreak investigation；drug resistance

S851.31+3

：A

：1005-944X（2017）02-0001-04

10.3969/j.issn.1005-944X.2017.02.001

聯(lián)合國糧農組織-中國獸醫(yī)現(xiàn)場流行病學培訓項目；科技部科技基礎性工作專項（2012FY111000）

韋欣捷、曲連東