鹽酸克倫特羅單克隆抗體的制備和鑒定

，，，，，，，，，

（1. 山東省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，山東濟南 250100；2. 山東省畜禽疫病防治與繁育重點實驗室，山東濟南 250100；3. 濟南市動物衛(wèi)生監(jiān)督所，山東濟南 250011）

鹽酸克倫特羅單克隆抗體的制備和鑒定

張玲玲1，2，戰(zhàn) 翔3，彭 喆1，2，時建立1，2，吳曉燕1，2，徐勝男1，2，鄭書軒1，2，徐紹建1，2，黃保華1，2，李 俊1，2

（1. 山東省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，山東濟南 250100；2. 山東省畜禽疫病防治與繁育重點實驗室，山東濟南 250100；3. 濟南市動物衛(wèi)生監(jiān)督所，山東濟南 250011）

為進一步建立克倫特羅（CL）殘留檢測方法，給制備CL殘留檢測試劑盒打下基礎(chǔ)，進行了CL單克隆抗體（McAb）的制備研究。以重氮反應，將CL與牛血清白蛋白（BSA）、雞卵清白蛋白（OVA）偶聯(lián)，分別制備免疫原和檢測原，并通過雜交瘤技術(shù)，獲得了5株能穩(wěn)定分泌特異結(jié)合CL小分子的單克隆抗體雜交瘤細胞株（1E9A9、2A9C1、3F2E9、6G2E9、6E10D9）。這5株細胞株經(jīng)過體外傳代培養(yǎng)和凍存復蘇后均能穩(wěn)定分泌抗體。用間接酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）測定的這5株細胞上清液抗體效價分別為1:1.28×105、1:5.12×105、1:1.28×105、1:5.12×105、1:2.56×105；選用3F2E9、6E10D9細胞株，制備CL單克隆抗體腹水并純化，其純化后的腹水抗體效價分別為1:1.28×105、1:2.56×105，BCA（2，2-聯(lián)喹啉-4，4-二甲酸二鈉）方法檢測的濃度分別為1.60 mg/mL、1.54 mg/mL；最終通過斑點ELISA（Dot-ELISA）方法測定CL抗原與這2株抗體有較強的結(jié)合力。在上述方法的制備及驗證下，成功獲得了特異性較高的CL單克隆抗體，為進一步研制CL殘留檢測試劑盒奠定了基礎(chǔ)。

鹽酸克倫特羅；單克隆抗體；殘留檢測

鹽酸克倫特羅（Clenbuterol Hydrochloride，CL）商品名稱鹽酸雙氯醇胺、克喘素、氨哮素、氨必妥、氨雙氯喘通、氨雙氯醇胺，俗稱“瘦肉精”，化學名稱為2-[（叔丁胺基）甲基]-4-氨基-3，5-二氯苯甲醇鹽酸鹽[1，2]，分子式為C12H18Cl2N2O· HCl。CL是一種平喘藥，既不是飼料添加劑，也不是獸藥，而是一種β2-腎上腺素受體激動劑，因具有營養(yǎng)再分配、促進蛋白質(zhì)合成、增加動物酮體瘦肉率、提高飼料轉(zhuǎn)化率的作用，在家畜和人體內(nèi)吸收好，而且與其它β-受體激動劑相比，其生物利用度高，經(jīng)常被非法用作飼料添加劑，用于畜產(chǎn)品的生產(chǎn)，以至于人類食用了含有CL的畜產(chǎn)品后出現(xiàn)嚴重的中毒情況，對人類健康存在非常大的潛在危害。盡管我國要求自2002年9月10日起在動物飼料和飲用水中禁止使用CL，但是近幾年CL在動物飼料中的違禁添加現(xiàn)象依然存在，使得CL在畜禽肉制品及其尿液和毛發(fā)中的殘留檢測得到廣泛的關(guān)注和研究。

目前可以分析瘦肉精及β2-腎上腺素受體激動劑殘留的主要方法包括高效液相色譜法（HPLC）[3-4]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（GC/MS）[5-6]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（LC/MS）[7]、免疫分析法等。免疫分析法具有單次處理樣本數(shù)多、易于商品化供應和檢測靈敏度高的優(yōu)點，目前得到廣泛使用。目前市場上已有許多以免疫分析法為基礎(chǔ)的商品化試劑盒，用于檢測飼料及動物體內(nèi)的CL殘留，但檢測用到的抗體大多數(shù)為多克隆抗體，其特異性不高。因此，研制高特異性CL單克隆抗體，并以此為基礎(chǔ)研制快速檢測試劑盒，成為當前的研究熱點。

為了建立一種快速、敏感、特異的CL化學發(fā)光免疫檢測方法，采用重氮反應，將CL與牛血清白蛋白（BSA）偶聯(lián)，獲得免疫原，用其免疫BALB/c小鼠，應用雜交瘤技術(shù)，制備高特異性單克隆抗體，為研制CL快速檢測試劑盒提供特異的材料，也為試劑盒的研發(fā)打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1試驗動物和細胞株。雌性BALB/c小鼠，購自上海市第一人民醫(yī)院（松江）動物實驗中心；小鼠Sp2/0骨髓瘤細胞，上海生工生物股份有限公司抗體部保存。

1.1.2主要試劑。RPMI-1640培養(yǎng)液、胎牛血清（FBS），購自GIBCO公司；鹽酸克倫特羅（CL）標準品、8-氮鳥嘌呤、HT、HAT、PEG、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑，均購自Sigma公司；HRP標記的驢抗鼠IgG，購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；牛血清白蛋白（Bovine serum albumin，BSA）、卵清蛋白（Ovalbumin，OVA），購自上海生工公司。其它化學試劑均為分析純以上級別。

1.1.3主要設備。生物安全柜，購自蘇凈集團安泰公司；CO2細胞培養(yǎng)箱，購自美國Therom公司；酶標儀，購自美國 BIO-RAD伯樂公司。

1.2試驗方法

1.2.1抗原制備。綜合文獻[8-9]方法，進行條件優(yōu)化，制備抗原：稱取3.295 mg 約（0.01 mmol）CL溶于400 μL 0.1 M預冷鹽酸中（0.04 mmol），邊震蕩邊向其中緩緩加入10 mg/mL 的NaNO2（約0.01 mmol），并不斷用微量移液器蘸取少許，用淀粉碘化鉀試紙檢測，直到試紙顏色剛好變?yōu)樗{紫色時，停止加入NaNO2。繼續(xù)震蕩，使反應充分進行，從而使CL偶氮化，然后將偶氮化的CL 分別加入到牛血清白蛋白（BSA）和卵清蛋白（OVA）溶液中，置4 ℃冰箱過夜，第二天取出后透析。上述操作均在4 ℃避光環(huán)境中進行，透析完成后，于-20 ℃凍存?zhèn)溆?，其中CL-BSA 作為免疫原用，CL-OVA 為ELISA 包被抗原。期間會觀察到偶氮后的CL滴入到BSA和OVA時，顏色先變黃色，最后變成明亮的黃色，透析和冷凍過程中顏色均未褪去。這說明CL已結(jié)合了BSA和OVA，初步確定偶聯(lián)成功，省去了SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳[10]和紫外掃描的鑒定步驟。

1.2.2小鼠免疫及效價測定。選用6周齡的BALB/c雌性小鼠，取偶聯(lián)成功的免疫原（CLBSA），用適量PBS稀釋后，與等量弗氏完全佐劑乳化（抗原乳化狀態(tài)判定：取1滴混合乳化液，滴入水平面，輕輕晃動，長時間不擴散），皮下分點注射。之后以相同方式，每隔兩周，以弗氏不完全佐劑乳化加強免疫，共免疫3次。在最后一次免疫7天后，尾靜脈采集血液樣本，分離血清，以CL-OVA包被酶標板，用間接ELISA方法檢測分析血清抗體效價。選取免疫效價檢測值最高的小鼠，于細胞融合前3天進行沖擊免疫1次，3天后取沖擊免疫過的小鼠脾臟細胞進行細胞融合。

1.2.3雜交瘤細胞株的建立

1.2.3.1骨髓瘤細胞（Sp2/0）的準備。細胞融合前兩周，對Sp2/0進行復蘇，并于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。培養(yǎng)過程中向培養(yǎng)液加入8-氮鳥嘌呤（8-Azaguanine）連續(xù)處理3次，使Sp2/0細胞對HAT培養(yǎng)液更加敏感。融合前一天進行傳代，以便使融合當天的骨髓瘤細胞處于對數(shù)生長期。

1.2.3.2飼養(yǎng)細胞的準備。細胞融合前一天，取3～4周齡健康的BALB/c小鼠腹腔巨噬細胞作為飼養(yǎng)細胞，調(diào)整細胞濃度至（l～5）×105個/mL，之后轉(zhuǎn)入96孔細胞培養(yǎng)板中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，18～24小時后觀察細胞生長狀態(tài)。細胞形態(tài)規(guī)則、明亮、貼壁緊密時，可供細胞融合使用。

1.2.3.3脾細胞的準備。取融合前加強免疫過的小鼠，摘除眼球，采集血液樣本并分離血清作為陽性對照。采血后斷頸處死小鼠，浸沒于75%乙醇中2～3 min，無菌摘取脾臟，制備并收集脾細胞懸液，用臺酚蘭染液做活細胞計數(shù)后備用。

相互間進行數(shù)據(jù)交換時，Coreldraw可以打開版本CS5及其以下任何版本的文件，文字不會變成亂碼，圖層不保留，所有要素合并到一個圖層內(nèi)，可以另存為AI文件；Illustrator 能打開Coreldraw版本10及其以下的CDR文件，圖層完全保留，但文字極易出現(xiàn)亂碼，無法存儲為CDR文件。其他項對比見表4。

1.2.3.4細胞的融合。將Sp2/0骨髓瘤細胞和免疫脾細胞按1:5的比例加入到50 mL離心管中，充分混勻制成懸液，1 000 r/min，離心7 min，盡量棄去上清，輕彈離心管，使沉淀細胞呈分散狀。加入聚乙二醇（PEG）促進細胞融合，之后加入不完全培養(yǎng)液，使PEG稀釋失去促融合作用。將終止反應后的細胞懸液離心，棄上清液并加入適量的HAT培養(yǎng)液，輕輕吹吸沉淀的細胞，使其混勻懸浮，然后加至鋪有飼養(yǎng)細胞的96孔細胞培養(yǎng)板中，5% CO237 ℃恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)1周，期間定期觀察細胞生長情況。

1.2.3.5雜交瘤細胞的篩選及克隆化培養(yǎng)。融合后注意觀察雜交瘤細胞的生長狀況，視情況決定是否換液。一般只需更換1次液體或勿需換液。換液時，先吸去原有培養(yǎng)孔1/2的培養(yǎng)液，再加入等量新鮮培養(yǎng)液即可。本試驗融合后1周內(nèi)未換液，融合后第8天開始換HT培養(yǎng)液，同時進行陽性雜交瘤細胞株篩選。待細胞長到孔底的1/4～1/3時，吸出上清液100 μL進行間接ELISA抗體檢測，以CL-OVA 為ELISA 包被抗原。以P/N≥2.5作為陽性判斷標準，用未免疫小鼠的血清作陰性對照，用抗體稀釋液做空白對照。對檢測為陽性的細胞進行擴大培養(yǎng)，同時進行克隆化培養(yǎng)。

克隆化培養(yǎng)采用有限稀釋法，待細胞長到孔底的l/4～1/3時，對細胞上清進行間接ELISA檢測。選擇克隆數(shù)少、OD450nm值高的陽性孔，將其再次克隆。3～4次克隆化后，當所有克隆化細胞孔陽性率檢測值達100%時，確定并獲得5株分泌特異性單抗的雜交瘤細胞株，及時擴大培養(yǎng)并凍存。

1.2.4雜交瘤細胞擴大培養(yǎng)及凍存。單克隆細胞株經(jīng)過幾次克隆后，陽性率達到100%。這時將細胞從96孔培養(yǎng)板轉(zhuǎn)入24孔培養(yǎng)板中，再由24孔板轉(zhuǎn)入細胞培養(yǎng)瓶進行擴大培養(yǎng)。雜交瘤細胞擴大培養(yǎng)后，取部分細胞按照常規(guī)方法凍存。

1.2.5單克隆抗體的鑒定

1.2.5.1單克隆細胞上清效價測定。對已經(jīng)建株的雜交瘤細胞進行擴大培養(yǎng)，凍存保留部分細胞后，將剩余細胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期，1 000 r/min，離心5 min，收集培養(yǎng)細胞的上清液后進行間接ELISA效價測定。將上清液進行梯度稀釋，以陰性小鼠血清作為陰性對照，以融合小鼠血清作為陽性對照。

1.2.5.2單克隆抗體腹水的制備純化及效價測定。按照文獻[11]的方法，選取其中2株單克隆雜交瘤細胞（3F2E9、6E10D9），制備單克隆抗體腹水并進行純化，對純化的抗體用BCA測定濃度，間接ELISA測定效價。梯度稀釋抗體，以陰性小鼠血清作為陰性對照，以融合小鼠血清作為陽性對照。

2 結(jié)果

2.1鹽酸克倫特羅免疫抗原和檢測抗原的合成

經(jīng)重氮反應，分別制成了免疫原CL-BSA和檢測原CL-OVA。反應過程中，偶氮后的CL滴入BSA和OVA時，顏色立即變黃色，最后變成明亮的黃色，透析和冷凍干燥過程中，均未見褪去，說明偶氮化克倫特羅與載體蛋白偶聯(lián)成功。

2.2小鼠免疫

小鼠第三次免疫后1周，采尾靜脈血，用間接ELISA方法檢測抗體效價。結(jié)果顯示1#、2#、3#小鼠的血清抗體效價較高，其中1#小鼠血清效價最高，大約為1:6.4×104（表1），滿足細胞融合的要求。因此細胞融合前，對1#小鼠進行沖擊免疫，并于3天后取其脾細胞，與對數(shù)生長期的Sp2/0細胞融合。

2.3單克隆細胞株的篩選及雜交瘤細胞株的建立

將免疫的BALB/c小鼠脾細胞和Sp2/0小鼠骨髓瘤細胞經(jīng)PEG方法融合，1周后可見孔內(nèi)呈葡萄串狀分布的小型克隆集落生長，細胞渾圓透亮。采用間接ELISA方法，以未免疫的BALB/c小鼠血清作陰性對照，適當倍數(shù)稀釋的小鼠血清為陽性對照測定OD450nm值，選擇其中陽性值最高的雜交瘤細胞株，經(jīng)亞克隆篩選，最終獲得5株能穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞株，分別命名為1E2A9、2A9C1、3F2E9、6G2E9和6E10D9。

2.4單克隆雜交瘤細胞上清效價檢測

系列倍比稀釋雜交瘤細胞培養(yǎng)上清，用間接ELISA法測定OD450nm值，同時設立陽性、陰性血清對照。以P/N比值≥2.5時單克隆抗體的最大稀釋度（即其抗體效價），測定5株陽性雜交瘤細胞上清效價（表2）。

2.5單克隆抗體腹水效價檢測和斑點免疫法（Dot-ELISA）檢測結(jié)果

利用間接ELISA法和BCA法，對純化后的抗體效價和濃度進行檢測，結(jié)果見表3、表4。 斑點免疫法（Dot-ELISA）檢測結(jié)果見圖1。

表1 用于細胞融合的免疫BALB/c小鼠血清效價（OD450nm）

表2 單克隆雜交瘤細胞上清效價（OD450nm）

表3 單克隆抗體腹水效價（OD450nm）

表4 單克隆抗體腹水純化后的蛋白質(zhì)濃度

圖1 斑點免疫法（Dot-ELISA）檢測結(jié)果

3 結(jié)論

1997—2005年，我國相繼發(fā)布《關(guān)于嚴禁非法使用獸藥的通知》《關(guān)于查處非法生產(chǎn)、銷售和使用鹽酸克倫特羅等藥品的緊急通知》《飼料及畜產(chǎn)品中瘦肉精等違禁藥品專項整治計劃》《關(guān)于加強鹽酸克倫特羅管理的通知》等，農(nóng)業(yè)部、衛(wèi)生部、國家藥監(jiān)局等部門多次單獨或共同發(fā)布公告，明確規(guī)定不允許在飼料和動物飲用水中添加包括CL（Clenbuterol Hydrochloride，鹽酸克倫特羅）、RAC（Ractopamine，萊克多巴胺）、SAL（Salbutamol，沙丁胺醇）在內(nèi)的7種藥物。目前 CL 引起的中毒事件仍有發(fā)生[12]，相關(guān)部門對此也廣泛關(guān)注，從而出現(xiàn)了大量的關(guān)于抗鹽酸克倫特羅單抗或多抗制備的報道。國內(nèi)研究者陳繼明[13]、胥傳來[14]等建立了一種用兔多克隆抗體來檢測CL的方法，但相比單克隆抗體，多克隆抗體特異性及穩(wěn)定性效果明顯不如單克隆抗體，因此在CL抗體的制備上大多還是傾向于單克隆抗體。目前國內(nèi)市場上有很多種檢測CL的酶免疫試劑盒，其主要為進口產(chǎn)品，檢測成本高，費用昂貴。因此，特異性高、穩(wěn)定性好的抗鹽酸克倫特羅單克隆抗體的研制和發(fā)展顯得有尤為重要。

眾所周知，作為完全抗原，其結(jié)構(gòu)必須同時具備T 細胞和B 細胞表位。小分子物質(zhì)，如小肽、抗生素、激素等，其結(jié)構(gòu)簡單，不具備免疫原性，必須將其連接到一些大分子蛋白質(zhì)載體上，借助載體蛋白的T細胞表位，間接誘導B細胞激活，使其分化增殖，從而產(chǎn)生針對半抗原小分子的特異性抗體[15]。目前建立半抗原免疫檢測方法的主要局限性是能否獲得可靠的、特異性強的抗體。本試驗利用重氮反應將CL分子與載體蛋白BSA和OVA偶聯(lián)，成功制備了單克隆抗體的免疫原和檢測原，通過對后期細胞株的鑒定和篩選，最終獲得了5株與CL有特異性反應的雜交瘤細胞株。選3F2E9、6E10D9株細胞進行抗體腹水制備和純化，并分別通過間接ELISA和BCA方法測定效價及蛋白濃度，最終通過Dot-ELISA方法確定了抗原與篩選出的單克隆抗體的結(jié)合能力。在使用ELISA檢測效價時，因為ELISA 法的重復性不好，所以摸索適宜的反應條件非常重要，還需考慮樣品中基質(zhì)對反應的影響，因此本試驗方法在實際應用中還有待進一步優(yōu)化。在以上所有的前期構(gòu)建及后期鑒定后，本試驗成功研制出5株單克隆抗體（1E9A9、2A9C1、3F2E9、6G2E9、6E10D9），并選取了其中2株（3F2E9、6E10D9）投入使用，為建立CL殘留現(xiàn)場快速檢測試劑盒打下了基礎(chǔ)。

[1]韓森，馬國霞，李衛(wèi)芬. 鹽酸克倫特羅檢測技術(shù)的研究進展[J]. 畜牧與飼料科學，2006（2）：33-35.

[2]賀鐵明，青傳來，王武康.鹽酸克倫特羅免疫原的合成與鑒定[J]. 中國糧油學報，2004，19（2）：85-88.

[3]林奕芝，劉奮，戴京晶，等. 高效液相色譜法測定肉與肉制品中鹽酸克倫特羅殘留量[J]. 中國衛(wèi)生檢驗雜志，2002，12（2）：180-181.

[4]BAZYLAK G，NAGELS L J. Simultaneous high-throughput determination of clenbuterol，ambroxol and bromhexine in pharmaceutical formulations by HPLC with potentiometric detection[J]. J Pharm Biomed Anal，2003，32（4/5）：887-903.

[5]HARKINS J D，WOODS W E，LEHNER A F，et al. Clenbuterol in the horse:urinary concentrations determined by ELISA and GC/MS after clinical doses[J]. J Vet Pharmacol Ther，2001，24（1）：7-14.

[6]DAMASCENO L，VENTURA R，ORTURA R，et al. Derivatization procedures for the detection of β2-agonists by gas chromatographic/mass spectrometric analysis[J]. J Mass Spectrom，2000，35（11）：1285-1294.

[7]MUCKERHEIDE A，DOMEN P L，MICHAEL J G.

Cationization of protein antigens，II. Alteration of regulatory properties [J]. J Immunol，1987，138（9），2800-2804.

[8]FESSER A C，DICKSON LC，MACNEIL J D，et al. Determination of beta-agonists in liver and retina by liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. J AOAC Int，2005，88（1）：61-69.

[9]ITARU Y，KOHJI I. Enzyme immunoassay for clenbuterol，an β2-adrnergicstimulant[J]. Journal of immunoassay，1982，3（2）：155-171.

[10]楊利國. 酶免疫測定技術(shù)[M].南京：南京大學出版社，2001，31（6）：238.

[11]APPLE J，DOMEN L，MUEKERHEIDE A，et al. Cationization of protein antigens. IV. Increased antigen uptake by antigen-presenting cells[J]. Journal of Immunology，1988，140（10）：3290-3295.

[12]馬靜. 鹽酸克倫特羅膠體金免疫層析試紙條制備與應用[D]. 福建：集美大學，2015.

[13]陳繼明，黃士新，周光宏，等. 酶聯(lián)免疫吸附測定法檢測克倫特羅[J]. 中國獸藥雜志，1999，33（2）：19-22.

[14]胥傳來，賀鐵明，王武康，等. 動物源食品中殘留克倫特羅檢測抗體的制備與應用[J].中國獸醫(yī)科技，2004，34（12）：50-54.

[15]邵煒慧，賈紅，劉文博，等. 鹽酸克倫特羅單克隆抗體的制備及檢測方法的初步建立[J].中國預防獸醫(yī)學報，2006，28（4）：450-453.

（責任編輯：朱迪國）

Preparation and Identi fi cation of Monoclonal Antibodies against Clenbuterol

Zhang Lingling1，2，Zhan Xiang3，Peng Zhe1，2，Shi Jianli1，2，Wu Xiaoyan1，2，Xu Shengnan1，2，Zheng Shuxuan1，2，Xu Shaojian1，2，Huang Baohua1，2，Li Jun1，2
（1. Animal Husbandry and Veterinary Research Institute，Shandong Academy of Agricultural Sciences，Jinan，Shandong 250100；2. Shandong Key Laboratory of Animal Disease Control and Breeding，Jinan，Shandong 250100；3. Jinan Animal Health Supervision Institution，Jinan， Shandong 250011）

In order to further develop the method for detecting residual Clenbuterol（CL），so as to lay foundation for research and development of the detection kits，monoclonal antibodies（mAbs）against CL were prepared. Through diazo reaction，CL was coupled with Bovine serum albumin（BSA）and Ovalbumin（OVA），the coupling products were used as immunogen and detection antigen，respectively. Using hybridoma technique，5 monoclonal hybridoma cell strains（1E9A9、2A9C1、3F2E9、6G2E9、6E10D9）which could secret antibodies against small CL molecules were obtained. During serial subcultivation in vitro and cryopreservation and resuscitation，the antibodies could be secreted stably. ELISA detection showed the antibody titers of supernatant of the 5 strains were 1:128 000，1:512 000，1:128 000，1:512 000 and 1:256 000，respectively. Ascites containing mAbs were induced by hybridoma cell strain 3F2E9 and 6E10D9 and the antibody titers in puri fi ed ascites were 1:128 000 and 1:256 000. Measurement by BCA protein determination method showed their concentrations were 1.60 mg/mL and 1.54 mg/mL repectively. Through Dot-ELISA，good reactivity between the two mAbs and CL was veri fi ed. As a conclusion，speci fi c mAbs against CL were prepared successfully，which would lay foundation for further research of the kits for CL residue detection.

Clenbuterol；monoclonal antibody；residue detection

S851.34

：A

：1005-944X（2017）02-0091-06

10.3969/j.issn.1005-944X.2017.02.027

“十三五”國家重點研發(fā)計劃（2016YFD0500708）；山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系疫病控制崗位（SDAIT-08-07）；山東省農(nóng)業(yè)重大應用技術(shù)創(chuàng)新課題；山東省科技發(fā)展計劃（2014GNC111011）；山東省農(nóng)業(yè)科學院青年英才培養(yǎng)工程；山東省農(nóng)業(yè)科學院青年科研基金項目（2016YQN53）

李 俊