超濾法結(jié)合納升液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)分析漏出性胸腔積液中多肽組分

陳世范　楊靜波　張敏　李曉鷗　劉曉峰　郭宏華　何成彥　高洪文

摘要漏出性胸腔積液中的多肽和蛋白質(zhì)等生物分子直接或間接地與機體特定的生理、病理狀態(tài)相關(guān)，反映了肺部或者全身其它部位疾病的信息。本研究利用超濾法將漏出性胸腔積液中的多肽組分進行分離，經(jīng)脫鹽富集后，進行納升液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析。結(jié)果表明，在漏出性胸腔積液中共鑒定到來源于52種蛋白的314條多肽，超過一半的肽段來源于纖維蛋白原，并且許多肽段具有階梯序列的特征。此外，在來源于膠原蛋白和纖維蛋白原的多肽中還發(fā)現(xiàn)了大量的脯氨酸氧化修飾?；虮倔w論富集分析顯示，漏出性胸腔積液多肽組分所屬蛋白均具有胞外分泌的屬性。本研究給出了漏出性胸腔積液中多肽組的序列、等電點、分子量、翻譯后修飾等理化參數(shù)的分布特征，為進一步尋找肺部疾病相關(guān)的多肽標志物提供了可借鑒的參考數(shù)據(jù)和分析方法。

關(guān)鍵詞多肽組； 超濾； 納升液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜； 漏出性胸腔積液

1引 言

胸膜腔是位于肺和胸壁之間的一個潛在的腔隙，正常情況下含有少量起潤滑作用的液體。胸腔積液是胸膜腔內(nèi)液體的產(chǎn)生和吸收失衡，致使過多的液體聚積形成[1]，包含多種由血漿濾過及炎癥或上皮細胞釋放的蛋白。胸腔積液是臨床上常見的征象，既可由胸膜疾病引起，也可由其它臟器病變產(chǎn)生。根據(jù)其生化特性，胸腔積液分為漏出液和滲出液[2]。漏出性胸腔積液常見于胸膜毛細血管內(nèi)靜水壓增高， 如心力衰竭、縮窄性心包炎、血容量增加、上腔靜脈或奇靜脈受阻等，或者胸膜毛細血管內(nèi)膠體滲透壓降低， 如低蛋白血癥、肝硬化、腎病綜合征、急性腎小球腎炎、粘液性水腫等。多是由于靜脈回流受阻，使得毛細血管內(nèi)壓增加， 從而生成的大量組織液。而滲出性胸腔積液多由炎癥或惡性腫瘤引起。

胸腔積液中的多肽、蛋白質(zhì)等生物分子直接或間接地與機體特定的生理、病理狀態(tài)相關(guān)，反映了肺部或者全身其它部位疾病的信息[3～5]。相對于胸腔鏡引導(dǎo)下的組織活檢，獲取胸腔積液對患者的損傷很小，屬于微創(chuàng)的方法。因此，越來越多的研究將胸腔積液作為尋找與肺部疾病相關(guān)生物標志物的理想來源。隨著現(xiàn)代質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展，液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)已經(jīng)成為轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中的主要工具，在尋找特定疾病相關(guān)的蛋白、多肽、小分子代謝物等領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用[6～8]。目前，大多數(shù)的相關(guān)研究都是針對滲出性胸腔積液（滲出液）中與特定生理病理相關(guān)的生物分子[9～11]，鮮有針對漏出性胸腔積液（漏出液）的研究報道，而對其中多肽組分的分析更是缺乏系統(tǒng)研究。

超濾技術(shù)是一種壓力驅(qū)動的膜分離技術(shù)，其優(yōu)點是操作簡單，分離效率高，不涉及到相轉(zhuǎn)移，無需添加其它化學(xué)試劑，能夠最大限度地保持生物活性物質(zhì)的天然狀態(tài)[12]。在本研究中，利用超濾技術(shù)將漏出性胸腔積液中的多肽組分進行分離，脫鹽富集后， 進行納升液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析。本研究可以為進一步尋找肺部疾病相關(guān)的多肽標志物提供可借鑒的參考數(shù)據(jù)和分析方法。

2實驗部分

2.1儀器與試劑

納升高效液相色譜儀（美國Eksigent Technologies公司）； TripleTOF 5600質(zhì)譜儀（美國Applied Biosystems公司）； 真空冷凍干燥機； Allegra TM X22R離心機（美國Beckman Coulter公司）； 超濾離心管（MWCO 10 kDa，美國Pall公司）； C18反相色譜捕獲柱 （100 μm × 30 mm， 3 μm，美國Eksigent Technologies公司）； C18反相毛細管色譜分析柱（75 μm × 150 mm， 3 μm， 美國Eksigent Technologies公司）； Pierce C18吸頭（100 μL， 美國Thermo Scientific公司）。

甲酸、乙腈（HPLC級，美國Sigma Aldrich公司）； Bradford蛋白定量試劑（美國BioRad公司）； 實驗用水為經(jīng)MilliQ純水儀（美國Millipore公司）制備的超純水。

2.2胸腔積液的采集和理化指標檢測

所有胸腔積液標本的留取均在超聲引導(dǎo)下嚴格按照胸腔穿刺術(shù)操作規(guī)范進行，收集的樣本經(jīng)離心10 min （4℃，12000 r/min）去除組織碎片和懸浮細胞，留取適量進行胸水常規(guī)生化檢測，其余置于 80℃保存。每個樣本均按照Light標準判斷為漏出液[13]，即蛋白總量<25 g/L，乳酸脫氫酶（LDH）<200 U/L，胸腔積液/血清蛋白比值<0.5，胸腔積液/血清LDH比值<0.6，且Rivalta實驗結(jié)果均為陰性。

2.4.2質(zhì)譜條件使用配備納升噴霧離子源的TripleTOF 5600質(zhì)譜系統(tǒng)對多肽組分進行分析。使用信息依賴采集方式（Information dependent acquisition， IDA）進行二級質(zhì)譜掃描，每次IDA循環(huán)最多采集35個二級質(zhì)譜，每張二級質(zhì)譜的累積時間為80 ms，每次循環(huán)時間為2.5 s。

2.5數(shù)據(jù)分析

將采集到的質(zhì)譜數(shù)據(jù)傳輸?shù)綌?shù)據(jù)處理工作站，并使用ProteinPilot 5.0質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析軟件在SwissProt數(shù)據(jù)庫中進行檢索，所選蛋白數(shù)據(jù)庫物種為人。檢索參數(shù)設(shè)置為非酶切、磷酸化強調(diào)和生物學(xué)修飾。將得到的多肽所屬的蛋白質(zhì)列表上傳到基因本體論（http：//geneontology.org/）網(wǎng)站，按照不同的細胞組分（Cell Components）進行富集分類。

3結(jié)果與討論

3.1胸腔漏出液多肽組分的質(zhì)譜分析

將采集的胸腔積液標本進行胸水常規(guī)生化檢測，按照Light標準判斷為漏出液的樣本作為本研究分析的對象[13]。首先采用超濾法將漏出性胸腔積液樣本中的小分子物質(zhì)分離出來，再利用反相C18層析材料將其進一步富集，同時也將樣品進行了脫鹽處理。再利用納升液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜對樣品進行分析，所得質(zhì)譜數(shù)據(jù)在uniprot 庫中的人種（Homo sapiens）蛋白庫中檢索，共得到314 條序列特異性多肽，質(zhì)譜中檢測到的肽段電荷數(shù)2～6。這些肽段的分子量分布在828～6071 Da（圖1A），其中大部分分布在1000～3000 Da之間。肽段等電點分布在3.32～12.01（圖1B），其中弱酸性的肽段（pI 4.0～5.0）分布較多。結(jié)合分子量因素，看出314條肽段的分布并不平均，分別主要集中分布在4個不同等電點區(qū)域3.3～4.8，5.2～6.2，6.5～7.1和8.2～11.0（圖1C）。

與其它臨床樣本來源的多肽組學(xué)研究[7，14]類似，在漏出性胸腔積液中也發(fā)現(xiàn)了許多具有階梯序列特征的多種肽段。其中，既有在N端遞增的多肽，也有在C端遞增的多肽。如來源于骨橋蛋白的3個肽段RISHELDSASSEVN，ISHELDSASSEVN，SHELDSASSEVN（圖2A）； 以及來源于血清白蛋白的4個肽段DAHKSEVAHRFKDLGEENFKA，DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVL，DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAF，DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQY（圖2B）。 這些階梯多肽普遍存在于各種天然體液等臨床樣本中，常由于體內(nèi)特定環(huán)境下的內(nèi)源性酶解作用產(chǎn)生，其含量、分布、斷裂方式等特征可能與機體特定的生理、病理活動密切相關(guān)。例如，Bedin等[15]發(fā)現(xiàn)在結(jié)直腸腫瘤患者血液中存在大量由特定蛋白酶產(chǎn)生的階梯多肽，這些階梯多肽的斷裂模式和分布特點具有顯著的病理特異性，因此有望作為結(jié)直腸腫瘤的新穎特異的標志物。Tian等[16]使用多空二氧化硅納米顆粒對健康人血漿中的多肽組進行了富集，質(zhì)譜分析結(jié)果顯示其中含有階梯多肽，并指出Chymosin 和Cathepsin D可能是產(chǎn)生這些階梯多肽的主要內(nèi)源性蛋白酶。

3.2漏出性胸腔積液多肽的脯氨酸氧化修飾

從數(shù)據(jù)庫檢索的結(jié)果中還可以發(fā)現(xiàn)，在漏出性胸腔積液中的部分多肽發(fā)生了多種翻譯后修飾的情況，包括磷酸化、脫氨基化、N端焦谷氨酸化、N端乙酰化、甲硫氨酸氧化、雙氧化、脯氨酸氧化、絲氨酸脫水化等（圖3）。其中，最多的修飾類型為脯氨酸氧化。值得注意的是，所有的脯氨酸修飾都發(fā)生在纖維蛋白原和膠原蛋白中，以膠原蛋白為多（表1）。膠原蛋白是肺臟間質(zhì)組織的主要組成成分之一，膠原蛋白容易被氧化，導(dǎo)致膠原蛋白分子內(nèi)的結(jié)構(gòu)和生化性質(zhì)改變，是衰老和許多疾病的病理生理機制的一個關(guān)鍵性決定因素[17，18]。

有研究表明，膠原蛋白等胞外基質(zhì)成分的降解產(chǎn)物多肽向外周體液中的分泌與肺臟的組織重塑密切相關(guān)，因而可以作為許多肺部疾病預(yù)后的特異性生物標志物[19]。本研究除了在漏出性胸腔積液中發(fā)現(xiàn)大量膠原蛋白降解產(chǎn)物外，還發(fā)現(xiàn)了其降解產(chǎn)物中脯氨酸的氧化修飾狀態(tài)，這為進一步研究將脯氨酸氧化的膠原蛋白等胞外基質(zhì)成分的降解產(chǎn)物多肽作為特定疾病、生理病理狀態(tài)的生物標志物提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和參照。

3.3漏出性胸腔積液多肽所歸屬的蛋白質(zhì)

在漏出性胸腔積液中鑒定到的314條多肽來源于52種蛋白。其中，分別有136、30和9條肽段來源于α纖維蛋白原、β纖維蛋白原和γ纖維蛋白原（圖4）。即有超過一半的肽段來源于纖維蛋白原，這與漏出性胸腔積液所處的組織內(nèi)環(huán)境的特異性密切相關(guān)。眾所周知，纖維蛋白原是一種由肝臟合成的具有凝血功能的蛋白質(zhì)，是纖維蛋白的前體分子。經(jīng)凝血酶等因子作用后可以轉(zhuǎn)化為纖維蛋白而發(fā)揮各種生理和病理作用，人體內(nèi)源性的組織型纖溶酶原激活因子（uPA）和尿激酶（uPA）是降解纖維蛋白的主要因素。在臨床研究發(fā)現(xiàn)中，惡性胸腔積液中uPA和uPA的含量顯著升高，導(dǎo)致纖維蛋白原降解產(chǎn)物明顯高于其它非惡性疾病如結(jié)核性或心肌梗死患者的積液[20]。

基因本體論（Gene ontology，GO）是一種在生物信息領(lǐng)域中極為重要的方法和工具，可以對海量的生物數(shù)據(jù)進行整合和重新利用，正逐步成為系統(tǒng)生物學(xué)領(lǐng)域中最具代表性的規(guī)范化的基因和基因產(chǎn)物特性的術(shù)語描繪或詞義解釋的工作平臺[20]。利用基因本體論對漏出性胸腔積液中的多肽組分所屬蛋白進行分析（圖5），發(fā)現(xiàn)均具有胞外分泌的屬性， 這與胸腔積液中含有的大量胞外基質(zhì)類的蛋白成分相吻合。

4結(jié) 論

本研究利用超濾法將漏出性胸腔積液中的多肽組分進行分離，經(jīng)脫鹽富集后，再進行納升液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析。結(jié)果表明，在漏出性胸腔積液中共鑒定到來源于52種蛋白的314條多肽，超過一半的肽段來源于纖維蛋白原，并且許多肽段具有階梯序列的特征。此外，在來源于膠原蛋白和纖維蛋白原的多肽中還發(fā)現(xiàn)了大量的脯氨酸氧化修飾?；虮倔w論富集分析顯示，胸腔漏出液多肽組分所屬蛋白均具有胞外分泌的屬性。本研究詳細描述了漏出性胸腔積液中多肽組的序列、等電點、分子量、翻譯后修飾等理化參數(shù)的分布特征，為進一步尋找肺部疾病相關(guān)的多肽標志物提供了參考數(shù)據(jù)和分析方法。

AbstractThe peptides， proteins and other biological molecules in transudative pleural effusion correlate directly or indirectly with specific physiological and pathological state， reflecting the information regarding the lungs or other parts of the body. In the present study， the peptide fraction in transudative pleural effusion was isolated by ultrafiltration. After desalted and enriched by C18 tips， the peptide mixture was analyzed by nano LCMS/MS. The results showed that 314 peptides， which were originated from 52 proteins， in pleural transudate were identified. More than half of the peptides were derived from fibrinogen. Many peptides were characterized as displaying ladder sequences. In addition， a large number of proline oxidation modifications were detected in the peptides derived from collagen and fibrinogen. Gene ontology enrichment analysis showed that the most of the proteins extracellular properties of pleural transudate polypeptide components were protein with exocytosis. The study provided a rapid and efficient separation and analysis methods for lung disease markers related peptide compounds in pleural fluid leakage. Also this research provided a rapid and effective method for screening peptide biomarkers related to lung diseases from transudative pleural effusion.

KeywordsPeptidome； Ultrafiltration； Nanoliquid chromatographytandem mass spectrometry； Transudative pleural effusion