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    基于寡核苷酸鏈的汞離子熒光生物傳感器

    2017-03-02 19:16劉晨光王久軍張興平楊華林
    分析化學(xué) 2017年2期

    劉晨光 王久軍 張興平 楊華林

    摘要基于G四鏈體結(jié)構(gòu)和卟啉類化合物N甲基卟啉二丙酸IX(NMM)結(jié)合產(chǎn)生強烈的熒光,利用THgT錯配對汞離子(Hg2+)的特異性識別,建立了一種簡單、靈敏、高效的Hg2+檢測新方法。在富含鳥嘌呤(G)寡核苷酸鏈中,引入了大量胸腺嘧啶(T)。在沒有Hg2+存在時,可以自發(fā)形成G四鏈體結(jié)構(gòu),與NMM結(jié)合產(chǎn)生強烈的熒光; 在Hg2+存在時,可與另一條富含T序列的互補鏈通過THgT特異性結(jié)合, 形成雙鏈DNA分子,從而導(dǎo)致G四鏈體結(jié)構(gòu)不能產(chǎn)生。優(yōu)化后最佳實驗條件為:緩沖溶液的pH=6.7, 20 mmol/L KCl, 2.5 μmol/L NMM, 反應(yīng)時間為2 h。在優(yōu)化條件下,體系的熒光強度變化值與Hg2+濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,線性范圍為50~1000 nmol/L,檢出限為22.8 nmol/L(3σ)。此生物熒光傳感器對Hg2+具有良好的選擇性。實際水樣中Hg2+的加標(biāo)回收率為106.1%~107.8%,可以滿足實際水樣品中Hg2+的檢測要求。

    關(guān)鍵詞G四鏈體; THgT錯配; 汞離子; 熒光生物傳感器

    1引 言

    汞是一種常見的重金屬污染物,廣泛存在于水、空氣和土壤中[1]??赏ㄟ^食物鏈在人體中富集,引起腦部、腎臟損傷和運動障礙等疾病,極大地威脅著人類健康[2,3]。因此,發(fā)展簡單、靈敏、快速檢測汞離子(Hg2+)濃度的方法具有重要意義。目前,常用的Hg2+檢測方法有原子吸收光譜法(AAS)[4]、原子熒光光譜法(AFS)[5]和電感耦合等離子體質(zhì)譜法(ICPMS)[6]等,這些方法靈敏度和分辨率可以滿足實際檢測的需求,但是需要專業(yè)的操作人員和大型的儀器設(shè)備,不適合常規(guī)檢測。

    G四鏈體結(jié)構(gòu)是由富含鳥嘌呤的DNA中的4個鳥嘌呤通過氫鍵相互作用形成籠式結(jié)構(gòu)[7~9],可與卟啉類化合物N甲基卟啉二丙酸 IX(NMM)結(jié)合產(chǎn)生強烈的熒光[10]。與其它發(fā)光基團相比,G四鏈體/NMM復(fù)合物作為熒光報告基團,具有廉價、易于制備和儲存等優(yōu)點,已用于檢測DNA[11,12]、RNA[13]、生物硫化物[14]和抗癌藥物[15]等。

    Hg2+可以特異性地與胸腺嘧啶(T)結(jié)合,形成穩(wěn)定的THgT配位化合物[16,17]。THgT的結(jié)合強度甚至超過了正常的TA配對的強度[18]。因此,THgT錯配可以作為一種良好的Hg2+識別元件?;贖g2+通過THgT錯配可引起寡核苷酸鏈結(jié)構(gòu)的變化、替換及重組的現(xiàn)象,研究者構(gòu)建了許多Hg2+傳感器[19],包括基于熒光基團的熒光傳感器[20,21]、基于石墨烯的電化學(xué)傳感器[22]及基于金納米粒子的比色傳感器[23],其中有些方法可以實現(xiàn)Hg2+的可視化檢測[24]。然而,上述方法中,一般需要對相關(guān)材料進行化學(xué)修飾或者前處理,過程比較繁瑣。

    本研究利用THgT特異性結(jié)合,基于G四聯(lián)體/NMM復(fù)合物的獨特?zé)晒庑再|(zhì),建立了一種無需熒光標(biāo)記、簡單、實用的Hg2+檢測方法。

    2實驗部分

    2.1儀器與試劑

    3結(jié)果與討論

    3.1傳感器工作原理及可行性分析

    Hg2+傳感器原理如圖1所示。設(shè)計了兩條寡核苷酸鏈P1和P2,P1為富G序列,可以自發(fā)形成G四鏈體結(jié)構(gòu)。 同時,在P1的多聚鳥嘌呤序列中間引入了大量胸腺嘧啶。P2為富含胸腺嘧啶的P1不完全互補鏈,在Hg2+存在時,可以通過THgT錯配,形成雙鏈DNA分子。在無Hg2+存在時,P1自發(fā)形成G四鏈體結(jié)構(gòu),與反應(yīng)體系中的NMM結(jié)合,產(chǎn)生強烈的熒光。當(dāng)Hg2+存在時,P1和P2通過THgT特異性結(jié)合形成雙鏈DNA分子,阻止G四鏈體產(chǎn)生,使得體系熒光信號下降,從而實現(xiàn)對Hg2+的檢測。

    為了驗證方法的可行性,測定了不同條件下的熒光光譜,結(jié)果如圖2所示。當(dāng)NMM單獨存在時,背景信號比較微弱(圖2a)。當(dāng)僅加入P1和P2時,P1不能與P2互補配對形成雙鏈DNA,P1自身形成G四鏈體結(jié)構(gòu),與NMM結(jié)合產(chǎn)生強烈熒光(圖2d)。而當(dāng)Hg2+存在時, P1和P2通過THgT錯配形成穩(wěn)定的DNA雙鏈,導(dǎo)致P1的G四鏈體結(jié)構(gòu)不能形成,從而造成熒光強度明顯下降(圖2c)。實驗結(jié)果表明,基于上述原理可以實現(xiàn)對Hg2+的檢測。

    0.2 mol/L Na2HPO4NaH2PO4緩沖液(pH = 6.1)中,加入不同濃度的KCl,室溫反應(yīng)0.5 h,測量熒光信號變化。如圖3A所示,在0~10 mmol/L濃度范圍內(nèi),隨著KCl濃度增加,熒光信號大幅提高; 之后熒光強度增長緩慢,KCl濃度為20 mmol/L時,熒光信號達到最大值; 繼續(xù)增加KCl濃度,熒光信號強度幾乎不變。因此,后續(xù)實驗采用20 mmol/L KCl。

    3.2.2NMM濃度的優(yōu)化由反應(yīng)原理可知,NMM濃度過低,不能完全結(jié)合形成的G四鏈體結(jié)構(gòu),造成測定結(jié)果不準(zhǔn)確; 但是由于NMM自身帶微弱的熒光,濃度過大又會產(chǎn)生較大的背景信號,因此需對NMM的用量進行優(yōu)化。考察不同濃度的NMM的影響,測量熒光信號和本底信號差值的變化F-FNMM(F為加入NMM后的熒光值,F(xiàn)NMM為不加P1時的本底熒光值)。如圖3B所示,隨著NMM濃度的升高,熒光信號不斷增強。當(dāng)NMM濃度為2.5 μmol/L時,體系的熒光值達到最大。再增加NMM用量,背景信號增強,而體系熒光強度不再增加,造成熒光信號和本底信號差值減小。因此,NMM最佳濃度為2.5 μmol/L。

    3.2.3pH值的優(yōu)化進一步考察了所用Na2HPO4NaH2PO4緩沖液的pH值對測量結(jié)果的影響。結(jié)果如圖3C所示, F0為不加Hg2+的體系的熒光強度, F為加Hg2+后的熒光強度,當(dāng)pH=6.7時,加入Hg2+前后的熒光變化值(F0-F)達到最大值。因此,本研究選擇pH 6.7的磷酸鹽緩沖體系。

    3.2.4Hg2+反應(yīng)時間的優(yōu)化Hg2+存在時,通過THgT特異性結(jié)合使P1和P2形成雙鏈DNA分子。對此反應(yīng)時間進行了優(yōu)化。在125 nmol/L P1、125 nmol/L P2、0.2 mol/L Na2HPO4NaH2PO4緩沖液(pH 6.7)中加入600 μmol/L Hg2+,室溫反應(yīng)不同時間,然后加入20 mmol/L KCl和2.5 μmol/L NMM,室溫反應(yīng)0.5 h,測量熒光信號變化情況。如圖3D所示,隨著反應(yīng)時間延長,熒光信號逐漸下降,反應(yīng)2 h后,熒光信號趨于穩(wěn)定,說明此時Hg2+與胸腺嘧啶反應(yīng)完全。因此,本實驗選用2 h作為反應(yīng)時間。

    AbstractA simple, fast and highly sensitive fluorescence analysis method for detection of mercury ion was developed based on Nmethylmesoporphyrin IX(NMM)/Gquadruplex DNA system and specific THgT mismatches. In this strategy, a large number of thymine was introduced into guaninerich oigonucleotides which could form Gquadruplex. In the presence of Hg2+, guaninerich oigonucleotides and complementary strand could form doublestranded DNA molecule by specific THgT mismatch pair, leading to destruction of Gquadruplex DNA structure. In the absence of Hg2+, guaninerich oigonucleotides spontaneously formed Gquadruplex DNA structure that could bound NMM to generate intense fluorescence. Based on the above facts, a sensitive fluorescence biosensor for determination of Hg2+ was fabricated. And the optimal conditions for Hg2+ determination were as follows: buffer solution pH of 6.7, 20 mmol/L KCl and 2.5 μmol/L NMM in buffer and incubation for 2 h. Under the optimal conditions, the fluorescence intensity signal change (F0-F) and the Hg2+ concentration exhibited a linear correlation within 50 nmol/L to 1000 nmol/L range with a low detection limit of 22.8 nmol/L (3σ). The biosensor exhibited good selectivity toward common metal ions. The developed method was successfully employed to detect Hg2+ in tap water with recovery of 106.1%-107.8%.

    KeywordsGQuadruplex deoxyribonucleic acid; ThymineHgthymine mismatches; Mercury ion; Fluorescence Biosensor

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