連花急支片在慢性支氣管炎大鼠中的藥效學(xué)研究

周 霞 馮娜娜 李 靜 陳翠翠 宋元林 白春學(xué) 金先橋 周 建△

(1復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院呼吸科 上海 200032; 2復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院呼吸科 上海 200040)

連花急支片在慢性支氣管炎大鼠中的藥效學(xué)研究

周 霞1,2馮娜娜1李 靜1陳翠翠1宋元林1白春學(xué)1金先橋2周 建1△

(1復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院呼吸科 上海 200032;2復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院呼吸科 上海 200040)

目的 評價連花急支片在慢性支氣管炎中的藥效學(xué)作用。方法 將72只SD大鼠分6組:對照組、吸煙組、吸煙+連花高劑量組、吸煙+連花中劑量組、吸煙+連花低劑量組、吸煙+乙酰半胱氨酸組。采用吸煙法復(fù)制慢性支氣管炎模型后給予不同藥物治療。采用肺功能檢測儀分析氣道反應(yīng)性。肺組織HE染色評價各組大鼠氣道炎癥程度及病理改變情況。ELISA法檢測血清和肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)中炎性細(xì)胞因子的濃度,對連花急支片的藥效學(xué)作用進(jìn)行綜合評價。結(jié)果 連花急支片和乙酰半胱氨酸可以改善吸煙大鼠怠倦、咳嗽等一般狀況;連花急支片和乙酰半胱氨酸能明顯改善吸煙大鼠氣道彈性阻力和肺順應(yīng)性;連花急支片和乙酰半胱氨酸能減輕吸煙大鼠支氣管黏膜炎性細(xì)胞浸潤和管壁水腫等病理改變; 連花急支片和乙酰半胱氨酸能顯著降低吸煙大鼠BALF中IL-4、IL-13和IFN-γ水平;連花急支片和乙酰半胱氨酸可不同程度降低大鼠血清IL-6和TNF-α水平。結(jié)論 連花急支片可以通過調(diào)節(jié)炎性細(xì)胞因子的平衡,減少大鼠支氣管黏膜炎性細(xì)胞浸潤和病理改變,改善肺功能,從而達(dá)到治療效果。

連花急支片; 慢性支氣管炎; 慢性阻塞性肺疾病; 藥效學(xué); 大鼠

支氣管炎是指氣管、支氣管黏膜及其周圍組織的慢性非特異性炎癥。支氣管炎主要原因為病毒和細(xì)菌的反復(fù)感染形成了支氣管的慢性非特異性炎癥。當(dāng)氣溫下降、呼吸道小血管痙攣缺血、防御功能下降時,易于致病;煙霧粉塵、污染大氣等慢性刺激也可發(fā)病;吸煙使支氣管痙攣、黏膜變異、纖毛運動降低、黏液分泌增多有助于感染;過敏因素也有一定關(guān)系。慢性支氣管炎進(jìn)一步發(fā)展即為慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)。已有研究證明連花急支片具有清宣肺熱,化痰止咳的功能[1],主要用于痰熱壅肺型急性氣管-支氣管炎,但在慢性支氣管炎中的療效還不明確。慢性支氣管炎具有緩慢進(jìn)行性發(fā)展、反復(fù)急性發(fā)作的特點,臨床上常規(guī)給予抗感染、止咳化痰平喘等對癥治療,其防治也一直是中醫(yī)藥界研究的課題之一。

本研究旨在評價連花急支片治療慢性支氣管炎的效果,為慢性哮喘癥狀的控制以及臨床綜合治療提供更多的選擇。本實驗擬建立大鼠慢性支氣管炎模型,觀察連花急支片對慢性支氣管炎大鼠血清、支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)、肺組織病理情況及肺功能的影響,以探討其對支氣管炎性介質(zhì)及細(xì)胞因子的作用機(jī)制。

材 料 和 方 法

主要材料與試劑 清潔級SD大鼠72只,雄性,體質(zhì)量200～250 g,購于上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司,實驗前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。連花急支片,購自石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司;大前門牌香煙(烤煙型香煙,焦油量11 mg,煙氣煙堿量0.8 mg,煙氣一氧化碳量13 mg),購自上海煙草集團(tuán)有限責(zé)任公司;乙酰半胱氨酸,購自美國Sigma公司;IL-4、IL-13、IFN-γ、TNF-α、IL-6 ELISA試劑盒,購自武漢博士德生物工程有限公司。小動物肺功能分析儀(型號BUXCO RC),購于美國DSI公司。

實驗方法

模型制作與分組 將大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為6組,即對照組、吸煙組、吸煙+連花高劑量組、吸煙+連花中劑量組、吸煙+連花低劑量組、吸煙+乙酰半胱氨酸組,每組12只。吸煙法是構(gòu)建支氣管炎最常用的方法,我們根據(jù)彭紅星等[2]的方法進(jìn)行改進(jìn),自制70 cm×60 cm×58 cm的煙熏箱,四邊各留一個直徑2 cm左右的通氣孔,除對照組外,其余60只大鼠置于煙熏箱內(nèi)。每天煙熏2次,5支/次,每次30 min,連續(xù)60天,正常對照組不做任何處理。

給藥方法 給藥組自造模第60天起灌胃給藥。每天1次,共7 天。連花急支片大劑量治療組(7.4 g/kg)、連花急支片中劑量治療組(3.7 g/kg)、連花急支片小劑量治療組(1.9 g/kg)、乙酰半胱氨酸治療組(200 mg/kg)。對照組和吸煙組給予等體積的生理鹽水。

一般情況觀察 實驗過程中,每天同一時間觀察1次,記錄動物的外觀、行為活動、步態(tài)、精神狀態(tài)、體重、食欲、尿、大便、呼吸(咳嗽)、瞳孔、皮毛、有無流涎、惡心、嘔吐、死亡或瀕死情況等。

氣道反應(yīng)性分析 最后一次給藥后24 h,用小動物肺功能測定儀測定氣道反應(yīng)性指標(biāo)(肺順應(yīng)性和肺彈性阻力)。

血清TNF-α、IL-6水平檢測 最后一次給藥后24 h,腹腔注射2 %戊巴比妥鈉40 mg/kg麻醉后,進(jìn)行腹主動脈取血,置于促凝管中,4 ℃下以3 000 r/min(離心半徑為15 cm)離心5 min后取血清置-80 ℃冰箱中冷藏,ELISA方法測定TNF-α,IL-6。

支氣管肺泡灌洗液IL-4,IL-13,IFN-γ水平檢測 取血后,分離出完整的氣管、支氣管和肺組織,氣管插管,結(jié)扎右側(cè)主支氣管,于主氣管喉軟骨下0.5 cm處切一倒T 型口,插入18號灌胃針頭(達(dá)1 cm處) ,用手術(shù)絲線扎緊,接5 mL注射器(去針頭) ,每次注入3 mL生理鹽水,停留30 s,緩慢吸出,重復(fù)5次,回收率>80%。將支氣管BALF置于冰上,4 ℃,3 000 r/min(離心半徑為15 cm)離心15 min,收集的上清移至另一干凈EP管中,置于-80 ℃。ELISA方法測定支氣管BALF中的IL-4、IL-13、IFN-γ。

肺組織病理學(xué)觀察 常規(guī)留取右肺組織,保留右肺門動脈及氣管,將其放入緩沖中性4%甲醛溶液,固定48 h后常規(guī)石蠟包埋切片,肺組織HE染色,用于鏡下觀察肺內(nèi)支氣管損傷情況,支氣管周圍炎性細(xì)胞浸潤情況,管腔內(nèi)是否有滲出物,支氣管是否擴(kuò)張等。

結(jié) 果

一般情況觀察 對照組一般狀態(tài)沒有明顯改變,呼吸平穩(wěn),狀態(tài)活躍,吸煙組小鼠煙熏后典型表現(xiàn)為:咳嗽,倦怠,食欲減退,活動明顯減少。隨著吸煙時間的延長,上述癥狀逐漸加重,且出現(xiàn)痰鳴音、呼吸困難等現(xiàn)象,體質(zhì)量增長緩慢,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(表1,P<0.01)。連花各劑量組和乙酰半胱氨酸組痰鳴音減輕,咳嗽等癥狀得到緩解,體質(zhì)量增長速度較吸煙組有不同程度加快,但差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(表1,P>0.05)。

各組大鼠氣道反應(yīng)性的比較 與對照組相比,吸煙組肺彈性阻力增加,肺順應(yīng)性下降;連花高、中、低劑量組和乙酰半胱氨酸組肺彈性阻力較吸煙組均有不同程度降低,肺順應(yīng)性也稍有增高,但差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(圖1,P>0.05)。

各組大鼠肺組織病理學(xué)改變的比較 對照組可見小支氣管管腔規(guī)則,氣管黏膜上皮完整,纖毛未見脫落,管壁未增厚,管腔內(nèi)無滲出,肺泡結(jié)構(gòu)正常。

表1 各組大鼠體質(zhì)量的改變

GroupsBeforeexperimentAfterexperimentCon201.77±7.80589.13±27.66Smoking201.79±6.46516.17±39.66(1)High-doseLianhua200.50±6.46538.56±26.36Medium-doseLianhua199.16±10.51531.13±28.50Low-doseLianhua200.19±12.16553.17±43.38Acetylcysteine199.34±9.54537.50±34.40

(1)vs. control group,P<0.01.

圖1 大鼠氣道反應(yīng)性檢測

吸煙組大鼠支氣管纖毛柱狀上皮變性、壞死脫落,支氣管管壁充血水腫伴有不同程度炎性細(xì)胞浸潤,以淋巴細(xì)胞為主,管壁平滑肌增厚明顯,支氣管管腔變狹窄,肺泡腔大小不一,肺泡間隔增寬。連花各劑量組尤其是高劑量組以及乙酰半胱氨酸組,可見氣管、細(xì)支氣管炎性細(xì)胞浸潤吸收較明顯,管壁充血水腫現(xiàn)象減輕,纖毛柱狀上皮變性、壞死脫落現(xiàn)象較吸煙組有所改善(圖2)。

A:Control group;B:Smoking group;C:Smoking and high-doseLianhuagroup;D:Smoking and medium-doseLianhuagroup;E:Smoking and low-doseLianhuagroup;F:Smoking and acetylcysteine group.

圖2 大鼠肺組織HE染色(×100)

Fig 2 Lung HE staining in rats (×100)

各組大鼠BALF中IL-4、IL-13、IFN-γ水平的比較 吸煙組大鼠BALF中IL-4、IL-13、IFN- γ水平顯著升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01或P<0.05);連花中劑量組、連花低劑量組和乙酰半胱氨酸組IL-4、IL-13、IFN-γ水平較吸煙組顯著降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);連花高劑量組與吸煙組相比,IL-4、IL-13水平顯著降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),IFN-γ水平也稍有下降,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(圖3)。

A:Levels of IL-4 in BALF;B:Levels of IL-13 in BALF;C:Levels of IFN-γ in BALF.(1)P<0.05,(2)P<0.01.

圖3 大鼠肺泡灌洗液中IL-4、IL-13和IFN-γ的水平

Fig 3 Levels of IL-4,IL-13 and IFN-γ in bronchoalveolar lavage fluid in rats

各組大鼠血清中IL-6、TNF-α水平的比較 與對照組相比,吸煙組血清IL-6、TNF-α水平均有不同程度上升,IL-6升高較顯著,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);連花高、中、低劑量組和乙酰半胱氨酸組IL-6和TNF-α水平均較吸煙組有不同程度降低(圖4)。

A:Levels of IL-6 in serum;B:Levels of TNF-α in serum.(1)P<0.01.

圖4 大鼠血清中IL-6和TNF-α的水平

Fig 4 Serum levels of IL-6 and TNF-α in rats

討 論

吸煙是COPD的主要危險因素,慢性支氣管炎又與COPD密切相關(guān)。本研究使用吸煙法制備大鼠慢性支氣管炎模型模擬了人類慢性支氣管炎的發(fā)生發(fā)展。吸煙大鼠出現(xiàn)咳嗽、體重增長緩慢、氣道阻塞等癥狀,肺組織HE染色顯示吸煙組病理學(xué)改變符合人類慢性支氣管炎的表現(xiàn),說明大鼠慢性支氣管炎模型復(fù)制是成功的。連花急支片各劑量組和乙酰半胱氨酸組能減輕吸煙大鼠支氣管黏膜炎性細(xì)胞浸潤和黏膜上皮脫落程度,減少支氣管腔內(nèi)黏液分泌,減輕支氣管管壁水腫,表明連花急支片和乙酰半胱氨酸可改善慢性支氣管炎大鼠支氣管和肺組織的病理變化,具有緩解支氣管炎癥的作用。

慢性支氣管炎時,支氣管管壁增厚,引起管腔狹窄,支氣管杯狀細(xì)胞增生,黏液分泌增多,黏稠的分泌物滯留于氣道內(nèi),從而引起氣道阻塞;煙霧刺激及炎性介質(zhì)引起支氣管強(qiáng)烈收縮,使氣道彈性阻力增加,肺泡壁彈性組織破壞,使肺順應(yīng)性降低。給予連花急支片和乙酰半胱氨酸治療后,肺彈性阻力明顯降低,肺順應(yīng)性也有了顯著好轉(zhuǎn)。

輔助性T細(xì)胞亞群與COPD發(fā)生具有重要關(guān)系,Th1/Th2細(xì)胞功能失衡可能是COPD的重要發(fā)病機(jī)制[3-5]。IL-4主要是由Th2細(xì)胞產(chǎn)生的一種促進(jìn)體液免疫、抑制細(xì)胞免疫的特征性細(xì)胞因子,相關(guān)研究已明確IL-4在COPD發(fā)病過程中為促炎因子[6-8]。研究顯示IL-13與COPD的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān),并且與病情嚴(yán)重程度呈正比[7,9-10]。我們的研究結(jié)果表明,連花急支片各劑量組和乙酰半胱氨酸組能顯著降低吸煙組升高了的IL-4和IL-13水平(P<0.01),抑制Th2細(xì)胞功能,使Th2細(xì)胞因子分泌下降。而IFN-γ是另一種由Th1細(xì)胞產(chǎn)生調(diào)節(jié)細(xì)胞功能的小分子多肽,過去的研究發(fā)現(xiàn)COPD患者痰中IFN-γ水平顯著上調(diào),說明COPD患者Th1功能亢進(jìn),IFN-γ的過度活化打破了Th1/Th2的平衡狀態(tài),激活中性粒細(xì)胞,促進(jìn)炎性介質(zhì)和炎性細(xì)胞的大量釋放,引起異常的免疫應(yīng)答和炎性反應(yīng)[8,11]。另有研究顯示IFN-γ能刺激誘導(dǎo)MMP-9的釋放,后者可降解細(xì)胞外基質(zhì),使肺泡無效腔擴(kuò)大,肺組織彈力逐漸喪失,繼而形成肺氣腫[12]。本研究結(jié)果顯示,吸煙組IFN-γ水平明顯高于對照組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),與之前的報道結(jié)果一致;連花中劑量組、連花低劑量組、乙酰半胱氨酸組IFN-γ水平顯著下調(diào)(P<0.01),說明連花急支片和乙酰半胱氨酸可以抑制Th1細(xì)胞功能,使Th1、Th2細(xì)胞相互平衡,以維持正常的免疫功能。

TNF-α是由巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的一種重要的促炎因子,適量的TNF-α具有抗感染、抗病毒和抗腫瘤作用,但是TNF-α過量,則使微血管通透性增加,趨化和激活中性粒細(xì)胞,介導(dǎo)過度炎性反應(yīng),引起氣道損傷,TNF-α還可刺激單核細(xì)胞等產(chǎn)生IL-6,后者是一種調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的糖蛋白,對中性粒細(xì)胞及多種炎性細(xì)胞具有趨化和激活作用[13]。本研究結(jié)果顯示,吸煙組大鼠血清TNF-α和IL-6水平均較對照組增高,給予連花急支片和乙酰半胱氨酸治療后,TNF-α和IL-6水平均有不同程度的降低,說明TNF-α和IL-6確實在慢性支氣管炎的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用,而連花急支片和乙酰半胱氨酸能通過調(diào)節(jié)免疫功能,降低慢性支氣管炎大鼠體內(nèi)TNF-α和IL-6水平,減少其對氣道的進(jìn)一步損傷,從而控制炎癥的發(fā)展。

綜上所述,連花急支片與乙酰半胱氨酸作用相當(dāng),能降低慢性支氣管炎大鼠氣道彈性阻力,提高肺順應(yīng)性,減少支氣管及肺組織中中性粒細(xì)胞、炎性介質(zhì)和細(xì)胞因子浸潤,對控制氣道炎癥有較好的療效。該作用機(jī)制可能通過減少Th2細(xì)胞因子IL-4、IL-13,抑制Th1細(xì)胞因子IFN-γ,使Th1/Th2細(xì)胞功能達(dá)到平衡;同時,也通過降低TNF-α和IL-6水平,抑制中性粒細(xì)胞和多種炎性細(xì)胞的趨化和激活,達(dá)到控制炎癥的目的。目前,連花急支片已在臨床上急性支氣管炎患者中得到廣泛應(yīng)用,在慢性支氣管炎中治療劑量的選擇還需隨機(jī)對照臨床研究進(jìn)一步證實,作為一種中藥制劑,該藥不良反應(yīng)少,安全性好,值得推廣。

[1] 谷春華,王宏濤,朱慧明,等.連花急支片治療急性支氣管炎藥效學(xué)研究 [J].亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥,2015,11(9):9-11.

[2] 彭紅星,楊榮時,曾玉蘭.細(xì)胞間黏附分子-1、巨噬細(xì)胞炎性蛋白-2在吸煙誘導(dǎo)的支氣管炎大鼠模型中的變化及其意義 [J].實用醫(yī)學(xué)雜志,2009,25(14):2234-2236.

[3] BARCZYK A,PIERZCHALA W,KON OM,etal.Cytokine production by bronchoalveolar lavage T lymphocytes in chronic obstructive pulmonary disease [J].JAllergyClinImmunol,2006,117(6):1484-1492.

[4] HODGE G,NAIRN J,HOLMES M,etal.Increased intracellular T helper 1 proinflammatory cytokine production in peripheral blood,bronchoalveolar lavage and intraepithelial T cells of COPD subjects [J].ClinExpImmunol,2007,150(1):22-29.

[5] WANG HY,PENG WD,WENG YS,etal.Imbalance of Th17/Treg cells in mice with chronic cigarette smoke exposure [J].IntImmunopharmacol,2012,14(4):504-512.

[6] CAO Y,GONG W,ZHANG H,etal.A Comparison of Serum and Sputum Inflammatory Mediator Profiles in Patients with Asthma and COPD [J].JIntMedRes,2012,40(6):2231-2242.

[7] MAY RD,FUNG M.Strategies targeting the IL-4/IL-13 axes in disease [J].Cytokine,2015,75(1):89-116.

[8] EICKMEIER O,HUEBNER M,HERRMANN E,etal.Sputum biomarker profiles in cystic fibrosis (CF) and chronic obstructive pulmonary disease (COPD) and association between pulmonary function [J].Cytokine,2010,50(2):152-157.

[9] LEE JS,ROSENGART MR,KONDRAGUNTA V,etal.Inverse association of plasma IL-13 and inflammatory chemokines with lung function impairment in stable COPD:a cross-sectional cohort study [J].RespRes,2007,8(6):795-800.

[10] MIOTTO D,RUGGIERI MP,BOSCHETTO P,etal.Interleukin-13 and-4 expression in the central airways of smokers with chronic bronchitis [J].EurRespirJ,2003,22(4):602-608.

[11] HENS G,VANAUDENAERDE BM,BULLENS DMA,etal.Original article Sinonasal pathology in nonallergic asthma and COPD:‘united airway disease’ beyond the scope of allergy [J].Allergy,2008,63(3):261-267.

[12] 談春江,杜娟.慢性阻塞性肺疾病穩(wěn)定期基質(zhì)金屬蛋白酶-9和γ-干擾素與肺功能的相關(guān)性 [J].貴陽醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2015,40(2):146-148.

[13] 黃勇,黃亞林,蘇韞,等.野菊花提取物對慢性支氣管炎大鼠血清和支氣管肺泡灌洗液中TNF-α、IL-6含量及肺組織病理形態(tài)學(xué)的影響 [J].中國老年學(xué)雜志,2010,30(18):2614-2616.

Effectiveness ofLianhuaJizhiTablets for chronic bronchitis in rats

ZHOU Xia1,2, FENG Na-na1, LI Jing1, CHEN Cui-cui1, SONG Yuan-lin1, BAI Chun-xue1, JIN Xian-qiao2, ZHOU Jian1△

(1DepartmentofRespiratoryMedicine,ZhongshanHospital,FudanUniversity,Shanghai200032,China;2DepartmentofRespiratoryMedicine,HuashanHospital,FudanUniversity,Shanghai200040,China)

Objective To study the effectiveness ofLianhuaJizhiTablets for chronic bronchitis. Methods Seventy-two SD rats were assigned to six groups:control group,smoking group,smoking and high-doseLianhuagroup,smoking and medium-doseLianhuagroup,smoking and low-doseLianhuagroup and smoking and acetylcysteine group.The rat model of chronic bronchitis was established by daily exposure to cigarette smoking and then treated with different treatments.Airway responsiveness was assessed by pulmonary function meter.HE staining of lung tissue was used to analyze the degree of inflammatory response and the pathological changes.ELISA was used to detect the concentration of inflammatory cytokines in serum and bronchoalveolar lavage fluid (BALF). Results AfterLianhuaJizhiTablets and acetylcysteine treatment,the performance status of smoking rat was significantly elevated.LianhuaJizhiTablets and acetylcysteine treatment could significantly improve the airway responsiveness of smoking rats.HE staining showed that infiltration of inflammatory cells in bronchia and edema of bronchial wall were alleviated byLianhuaJizhiTablets and acetylcysteine treatment.LianhuaJizhiTablets and acetylcysteine treatment could significantly reduce the levels of IL-4,IL-13and IFN- γ in BALF of smoking rats.Levels of IL-6 and TNF-α in serum decreased at different degrees byLianhuaJizhiTablets and acetylcysteine treatment. Conclusions Similar to acetylcysteine,LianhuaJizhiTablets alleviated the infiltration of inflammatory cells,pathological changes and improved pulmonary function in rats through regulating the balance of inflammatory cytokines,and consequently achieved a therapeutic effect.

LianhuaJizhiTablets; chronic bronchitis; chronic obstructive pulmonary disease; effectiveness; rat

北京市科委“十病十藥專項”(Z121102001112002);國家自然科學(xué)基金(81570028,81400018,81500026)

R562.2

A

10.3969/j.issn.1672-8467.2017.01.004

2016-06-30;編輯:王蔚)

△Corresponding author E-mail:zhou.jian@fudan.edu.cn

*This work was supported by“Ten Diseases and Ten Drugs Research Project” of Beijing Science and Technology Commission(Z121102001112002) and the National Natural Sciencec Foundation of China (81570028,81400018,81500026).