自噬-溶酶體途徑與骨骼肌和膈肌萎縮的研究進展

邵 蕾(綜述) 朱曉萍(審校)

(1同濟大學(xué)醫(yī)學(xué)院2014級臨床醫(yī)學(xué)碩士研究生 上海 200092; 2同濟大學(xué)附屬東方醫(yī)院呼吸內(nèi)科 上海 200120)

自噬-溶酶體途徑與骨骼肌和膈肌萎縮的研究進展

邵 蕾1(綜述) 朱曉萍2△(審校)

(1同濟大學(xué)醫(yī)學(xué)院2014級臨床醫(yī)學(xué)碩士研究生 上海 200092;2同濟大學(xué)附屬東方醫(yī)院呼吸內(nèi)科 上海 200120)

骨骼肌是人體重要的運動器官和能量代謝靶器官。呼吸肌是特殊的骨骼肌,因為它們在生命過程中持續(xù)運動。膈肌是最主要的吸氣肌,相較外周骨骼肌,其血供更為豐富,抗疲勞能力和氧化代謝能力更強。多種疾病狀態(tài)下均可出現(xiàn)骨骼肌和膈肌萎縮及功能異常。肌萎縮的主要機制為蛋白分解增加而蛋白合成下降,而病理狀態(tài)下肌萎縮主要由肌肉蛋白分解增加造成。自噬-溶酶體(autophagy-lysosome,AL)途徑在維持骨骼肌質(zhì)量動態(tài)平衡中起重要作用,其主要功能是將細胞質(zhì)中多余或損傷的蛋白和細胞器運輸至溶酶體進行降解。適當(dāng)活性的AL途徑能通過清除細胞代謝產(chǎn)物來保持內(nèi)穩(wěn)態(tài),在維持骨骼肌質(zhì)量中起保護作用;而過度激活的AL途徑能使蛋白分解狀態(tài)加重,導(dǎo)致肌萎縮。本文就AL途徑在骨骼肌和膈肌萎縮中所起的作用及其機制作一綜述。

自噬; 溶酶體; 骨骼肌; 膈肌; 肌萎縮

骨骼肌是人體重要的運動器官,也是能量代謝的重要靶器官。呼吸肌是特殊的骨骼肌,因其在生命過程中持續(xù)活動。膈肌是最主要的吸氣肌,平靜呼吸時,膈肌收縮活動產(chǎn)生的潮氣量占總潮氣量的80%[1]。由于其持續(xù)活動的特性,膈肌慢肌纖維的比例、毛細血管密度和線粒體容積密度均較外周骨骼肌明顯增多,相應(yīng)的,膈肌抗疲勞能力和氧化代謝能力是外周骨骼肌的2～6倍[2]。多種疾病狀態(tài)下均可出現(xiàn)骨骼肌和膈肌萎縮和功能異常。例如,慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary diseases,COPD)由于肺過度充氣使膈肌長度縮短、膈肌曲度降低及肌纖維走行變?yōu)闄M行等原因造成膈肌收縮功能下降和肌萎縮[3];同時全身炎性反應(yīng)會導(dǎo)致四肢骨骼肌萎縮,使患者活動耐力下降和死亡率增加[4]。此外,延長機械通氣后膈肌活動缺如和無負荷承受導(dǎo)致的膈肌萎縮、膈肌損傷和收縮功能障礙是通氣患者困難脫機的重要原因[5]。肌萎縮的主要機制為蛋白分解增加而蛋白合成下降。多種病理狀態(tài)下肌萎縮主要由于肌肉蛋白分解增加造成。蛋白質(zhì)分解途徑主要包括半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)途徑、Ca2+依賴鈣蛋白酶(calpains)途徑和ATP依賴的泛素-蛋白酶體(ubiquitin-proteasome,UP)這3條途徑[6]。在骨骼肌失用性肌萎縮中,肌纖維收縮蛋白主要通過UP途徑降解。近年研究發(fā)現(xiàn),自噬-溶酶體(autophagy-lysosome,AL)途徑是細胞蛋白分解的第4條途徑,其功能是將細胞質(zhì)中多余或損傷的蛋白和細胞器運輸至溶酶體進行降解。本文就AL途徑在骨骼肌和膈肌萎縮中所起的作用及其機制綜述如下。

AL途徑 AL途徑由轉(zhuǎn)運系統(tǒng)(自噬體)和降解系統(tǒng)(溶酶體)組成,是真核生物進化過程中高度保守的細胞“自我消化”的信號通路。AL途徑不僅能為保持重要細胞功能提供營養(yǎng)物質(zhì),還能清除多余或損傷的細胞器、錯誤折疊蛋白及入侵的微生物[7]。至少有3種形式的自噬已經(jīng)明確:分子伴侶調(diào)節(jié)性自噬、微自噬和巨自噬。目前研究主要集中在巨自噬,因為巨自噬是真核細胞降解蛋白和細胞器的主要分解代謝機制。巨自噬以被稱為自噬體的雙膜囊泡形成為特征,包含細胞質(zhì)、細胞器、糖原和蛋白質(zhì),隨后自噬體被轉(zhuǎn)運至溶酶體降解[6]。此過程包含多個調(diào)控步驟,從膜起始、膜延長、膜形成到最終與溶酶體融合。

自噬的膜起始步驟是UNC-51-樣激酶1(Unc-51-like kinase 1,ULK1)-自噬相關(guān)性蛋白13(autophagy-related proteins 13,ATG13)-FAK家族互作蛋白200 kD (FAK family-interacting protein of 200 kD,FIP200)復(fù)合物形成,此復(fù)合物受AMP活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)和雷帕霉素靶蛋白復(fù)合體1(complex 1 of mammalian target of rapamycin,mTORC1)雙重調(diào)控。營養(yǎng)充分狀態(tài)下,mTORC1抑制ULK1活化從而抑制自噬;營養(yǎng)缺乏狀態(tài)下,AMPK抑制mTORC1復(fù)合體,并激活ULK1[8]。自噬隨后進入膜成核過程,這依賴于B細胞淋巴瘤2互作蛋白1(B-cell lymphoma 2 interacting protein 1,Beclin1)復(fù)合物。Beclin1復(fù)合物包括Beclin1、B細胞淋巴瘤2(B-cell lymphoma 2,BCL-2)家族蛋白、VPS34(phosphatidylinositol-3-phosphate kinase class III)和ATG14L。激活此復(fù)合物能產(chǎn)生磷脂酰肌醇3磷酸鹽,從而促進自噬體膜成核[9]。自噬體膜延長過程需要2種泛素樣共軛體系:ATG5-ATG12共軛體系和微管相關(guān)性蛋白輕鏈3(microtubule-associated protein light chain 3,LC3)-ATG8共軛體系。最后,類泛素分子GABARAP和GATE-16與磷脂酰乙醇胺共價結(jié)合,ATG12與ATG5共價結(jié)合,細胞質(zhì)截短型LC3(LC3-I)轉(zhuǎn)換成自噬體膜相關(guān)的磷脂酰乙醇胺共軛型LC3(LC3-Ⅱ),表明自噬體形成[10]。被自噬體吞噬的細胞器和蛋白質(zhì)隨后與溶酶體融合,最終被溶酶體酸性水解酶降解,而自噬體本身被釋放用于代謝再循環(huán)。

AL途徑的主要功能 AL途徑在營養(yǎng)缺乏或應(yīng)激狀態(tài)下能反應(yīng)性激活,這種適應(yīng)性降解作用能產(chǎn)生可循環(huán)利用的氨基酸和脂肪酸并運送至全身,用于三羧酸循環(huán)以維持ATP生成[7]。既往研究表明,自噬功能缺陷的細胞很快死亡,如果給予丙酮酸鹽等三羧酸循環(huán)底物則能維持細胞生長[11]。這證明AL途徑在維持三羧酸循環(huán)中的重要作用,這也是真核生物進化過程中高度保守的促存活機制。這種作用不僅局限于營養(yǎng)缺乏期,也包括營養(yǎng)需求增加期,特別是細胞短期出現(xiàn)高代謝需要。

AL途徑能降解損傷的蛋白和細胞器,防止異常蛋白聚集。雖然部分功能和其他蛋白酶水解途徑重疊,但是自噬體囊泡隔離并降解整個細胞器是其獨特的作用方式[7]。早期研究認為AL途徑是一種非選擇性降解,然而近年越來越多證據(jù)證明自噬具有選擇性,如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、過氧化物酶體、線粒體和多聚泛素化蛋白等[10]。敲除小鼠肝細胞ATG7基因和神經(jīng)細胞ATG5基因均能導(dǎo)致組織內(nèi)多聚泛素化蛋白聚集,繼而產(chǎn)生細胞變性。泛素化是蛋白質(zhì)重要的轉(zhuǎn)錄后修飾,泛素化底物包括生理或病理狀態(tài)下產(chǎn)生的氧化損傷、突變、錯誤折疊及錯誤定位的蛋白質(zhì),此類物質(zhì)隨后被UP途徑的26 s蛋白酶體或溶酶體蛋白水解酶識別并降解,以維持細胞正常生理活動。如果AL途徑功能缺乏,多聚泛素化蛋白被識別降解的能力減弱而出現(xiàn)聚集,最終導(dǎo)致細胞內(nèi)環(huán)境紊亂[12-13]。

AL途徑在骨骼肌和膈肌萎縮中的作用 AL途徑在骨骼肌和膈肌萎縮中的作用及其機制近幾年才開始研究。Mizushima等[14]首先用轉(zhuǎn)基因法使綠色熒光蛋白標記LC3蛋白,發(fā)現(xiàn)電鏡下饑餓實驗24和48 h后,轉(zhuǎn)基因小鼠腓腸肌、趾長伸肌和比目魚肌肌纖維中LC3蛋白熒光表達量顯著升高。結(jié)果證明分解代謝狀態(tài)下,AL途徑能被持續(xù)高水平激活。此外,長期機械通氣(15～276 h)患者膈肌纖維中肌肉萎縮蛋白(muscle atrophy F-box,MAFbx)和肌肉環(huán)指蛋白(muscle ring-finger 1,MuRF1)等UP途徑基因的蛋白表達量升高外,電鏡下可見自噬體生成數(shù)量增加,AL途徑各調(diào)控步驟的相關(guān)性基因(如Beclin1,LC3,BNIP3等)表達量均顯著升高。表明長期機械通氣患者的膈肌組織中AL途徑和UP途徑同時被激活,從而清除損傷的線粒體等細胞器及肌纖維結(jié)構(gòu)。雖然以肌纖維收縮力和耐力下降為代價,但這兩種蛋白降解途徑對應(yīng)激狀態(tài)下保持細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)起重要作用[15]?？傊?在多種分解代謝狀態(tài)下,AL途徑活性可發(fā)生變化,且在保持骨骼肌動態(tài)平衡中發(fā)揮作用,但是這種作用是有益還是有害,目前尚無定論。

AL途徑減輕骨骼肌和膈肌萎縮 AL途徑是重要的細胞信號通路,它的主要作用是降解損傷的蛋白和細胞器,并循環(huán)利用細胞的組成成分。在骨骼肌和膈肌中,AL途徑的適當(dāng)調(diào)節(jié)在維持正常細胞的生理功能中必不可少。動物去神經(jīng)化實驗表明,相比正常小鼠,ATG7基因敲除鼠的LC3-II蛋白表達缺乏,自噬體生成被抑制?；蚯贸笾洪L伸肌電鏡下可見膨脹的肌漿網(wǎng)、損傷的肌節(jié)、異常線粒體和蛋白聚集,肌纖維中泛素化蛋白表達水平升高。此外,基因敲除鼠趾長伸肌橫截面積下降,伴強直收縮力顯著降低[16]。由于AL途徑活性缺乏,使得泛素化蛋白和細胞器聚集,線粒體損傷能誘導(dǎo)氧化應(yīng)激,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)損傷能誘導(dǎo)未折疊蛋白反應(yīng)活性升高及細胞凋亡[16]。抑制AL途徑活性能破壞細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài),加快去神經(jīng)化過程中產(chǎn)生的肌纖維收縮力下降和肌萎縮。這種病理學(xué)改變與多種肌肉退行性病變和肌營養(yǎng)障礙性疾病十分相似,如散發(fā)性包涵體肌炎、杜氏肌營養(yǎng)不良癥(Duchene musclar dystrophy,DMD)和Ullrich先天性肌營養(yǎng)不良癥。DMD是一種遺傳性骨骼肌萎縮癥,以肌纖維電鏡下異常細胞器聚集為特征,且AL途徑活性嚴重受損。4月齡DMD模型鼠的脛骨前肌和膈肌肌纖維電鏡下可見腫脹的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體等細胞器,但未見雙膜自噬囊泡形成。自噬體形成標志物L(fēng)C3-Ⅰ和LC3-Ⅱ的mRNA和蛋白表達均顯著降低。低蛋白飲食能部分恢復(fù)DMD模型鼠的AL途徑活性,3個月后,飲食干預(yù)鼠的肌纖維橫截面積與正常野生鼠無顯著差異[17]。結(jié)果證明,AL途徑活性缺乏能造成內(nèi)環(huán)境紊亂,是造成DMD骨骼肌和膈肌萎縮的主要原因,適當(dāng)增強AL途徑活性能有效清除異常細胞器聚集和有害的細胞代謝產(chǎn)物,并增強肌纖維再生能力,改善肌萎縮。以上研究均提示,在基礎(chǔ)代謝及應(yīng)激狀態(tài)下,AL途徑在保持骨骼肌和膈肌質(zhì)量中均起適應(yīng)性保護作用。

AL途徑能加重骨骼肌和膈肌萎縮 AL途徑活性缺乏能導(dǎo)致肌萎縮。但是在多種應(yīng)激性分解代謝狀態(tài)下,AL途徑持續(xù)被高水平激活反而可能加重肌萎縮。Giordano等[18]研究發(fā)現(xiàn),間歇性低氧干預(yù)后小鼠的膈肌肌纖維橫截面積較正常對照組下降約30%,肌纖維收縮力下降約40%;同時3條主要的蛋白水解途徑中,calpains途徑和UP途徑相關(guān)性基因和蛋白表達水平均較正常對照組無顯著差異,而LC3B、Gabarapl等AL途徑相關(guān)性基因的表達水平均顯著升高。既往研究證明,有氧運動能使膈肌收縮活動增加,并適當(dāng)提高AL途徑的基礎(chǔ)活性水平,有利于增強骨骼肌運動耐力和適應(yīng)力[19]。與有氧運動相似,間歇性低氧也能使膈肌活動增加,從而增強AL途徑的活性;此外,低氧本身即可通過低氧誘導(dǎo)因子轉(zhuǎn)錄復(fù)合物提高AL途徑的活性[20-21]。因此,兩種因素相互疊加可使AL途徑被過度激活,蛋白分解作用加劇,最終導(dǎo)致膈肌萎縮。此外,衰老能導(dǎo)致組織器官退化和功能障礙,而骨骼肌是受影響最為明顯的靶器官之一,這與蛋白分解作用增加相關(guān)。過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活劑α(peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator α,PGC-1α)是骨骼肌肌纖維線粒體及葡萄糖代謝的重要轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子,隨著年齡增加,其表達水平逐步下降。在衰老小鼠模型中用轉(zhuǎn)基因法保持PGC-1α高水平表達能使小鼠骨骼肌中LC3-Ⅱ蛋白表達量明顯下降,表明AL途徑的活性降低。相較對照組,PGC-1α高水平組的衰老小鼠下肢骨骼肌質(zhì)量增加約8%,且線粒體功能和肌纖維完整性均得到改善[22]。衰老過程中,骨骼肌氧化性蛋白含量增加,AL途徑被持續(xù)激活以清除損傷的代謝產(chǎn)物,然而蛋白降解速度加快,但機體能源物質(zhì)缺乏,蛋白合成更新能力不足,無法維持正常的細胞功能,反而加重肌萎縮。以上研究均證明,在短期應(yīng)激狀態(tài)和長期慢性疾病的發(fā)展過程中,AL途徑持續(xù)高水平激活均能加重蛋白分解而導(dǎo)致骨骼肌和膈肌萎縮。這種病理學(xué)變化提示AL途徑抑制劑是潛在的治療靶點。

近期研究表明,機械通氣24 h后大鼠膈肌慢縮肌纖維和快縮肌纖維橫截面積分別下降11%和20%,LC3-Ⅱ蛋白表達水平較正常對照組升高1.3倍。如果在機械通氣前行熱應(yīng)激干預(yù)能提高熱休克蛋白70(heat shock protein 70,Hsp70)的表達水平,繼而LC3-Ⅱ蛋白表達水平顯著下降,膈肌萎縮程度明顯減輕[23]。Hsp70能降低AL途徑上游轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子叉頭轉(zhuǎn)錄因子3(forkhead boxO3,FoxO3)的去磷酸化水平,從而抑制部分AL途徑相關(guān)性基因的表達,降低AL途徑活性。這些結(jié)果表明,抑制AL途徑活性對機械通氣相關(guān)性膈肌萎縮具有保護作用。但是,由于目前對AL途徑作用機制的了解尚不完善,AL途徑抑制劑(如溶酶體抑制劑氯喹和羥氯喹)的不良反應(yīng)也需考慮。長期使用氯喹能導(dǎo)致溶酶體蛋白水解功能損傷,出現(xiàn)以肌纖維空泡變性為特征的肌肉病變[24]。

總之,AL途徑在骨骼肌和膈肌萎縮中的作用具有雙面性:活性缺乏能導(dǎo)致?lián)p傷的蛋白和細胞器聚集,破壞細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)而引起肌纖維收縮功能障礙和肌萎縮;但是持續(xù)高水平激活使得蛋白分解狀態(tài)加劇,同樣能導(dǎo)致肌萎縮。理論上,造成這兩種截然相反作用的原因主要是時間上的差異[24-25]。既往研究提示,抑制AL途徑活性導(dǎo)致有害代謝產(chǎn)物積聚,當(dāng)此種情況累積到一定程度才會出現(xiàn)明顯的病理學(xué)變化,完成這一過程需要數(shù)月甚至數(shù)年。但是在應(yīng)激狀態(tài)下,AL途徑活性急性升高引發(fā)肌萎縮所需時間很短,僅需數(shù)周或數(shù)天。因此,降低AL途徑活性是否能改善肌萎縮,增強AL途徑活性是否有利于清除異常蛋白和細胞器,在疾病不同的發(fā)展過程中,抑制或激活A(yù)L途徑對肌纖維產(chǎn)生何種作用？明確這些問題在未來的治療中十分重要。

AL途徑和UP途徑在骨骼肌和膈肌萎縮中的相互作用 UP途徑和AL途徑是兩條重要的骨骼肌蛋白水解途徑。既往認為這兩條途徑各自獨立:正常生理及各種分解代謝狀態(tài)下約有80%的蛋白通過UP途徑被降解,它主要降解肌纖維和大部分可溶性短壽蛋白,而AL途徑主要降解長壽蛋白和損傷的細胞器[26-27]。但是,越來越多證據(jù)證明UP途徑和AL途徑在降解多聚泛素化蛋白中具有代償作用。Wang等[28]用氯喹和RNA干擾兩種方法抑制結(jié)腸癌腫瘤細胞的AL途徑活性,在去血清培養(yǎng)基中,腫瘤細胞的多聚泛素化蛋白表達水平顯著升高,伴UP途徑的26 s蛋白酶體活性升高;而在血清充分的培養(yǎng)基中,細胞多聚泛素化蛋白表達升高程度不明顯,且抑制AL途徑活性或用雷帕霉素增強AL途徑活性均對26 s蛋白酶體活性無明顯影響。在去血清培養(yǎng)基和血清充分培養(yǎng)基中的結(jié)果截然不同,提示去血清培養(yǎng)基處于營養(yǎng)缺乏的狀態(tài),使AL途徑持續(xù)高水平激活以提供可循環(huán)的能量物質(zhì)并降解異常的代謝產(chǎn)物,只有當(dāng)抑制AL途徑活性會使多聚泛素化蛋白降解受到損傷并累積到一定程度時,UP途徑的代償性作用才會被激活。同時研究者也推測,UP途徑中的26 s蛋白酶體可能通過AL途徑降解,因此抑制AL途徑活性后,26 s蛋白酶體活性會有所升高。另有動物實驗證明,使用UP途徑中的26 s蛋白酶體抑制劑不能改善大鼠機械通氣12 h后導(dǎo)致的膈肌萎縮[29]。一方面,雖然UP途徑是機械通氣失用性肌萎縮中最主要的蛋白降解途徑,但是只有在calpains途徑和caspase途徑首先裂解細胞骨架蛋白后,UP途徑蛋白酶才能進入肌動蛋白和肌球蛋白使其得以降解,因此單純抑制UP蛋白酶活性不足以逆轉(zhuǎn)肌萎縮。另一方面,研究結(jié)果也提示抑制UP途徑的26 s蛋白酶活性后,AL途徑可能會發(fā)生代償性活性升高以降解積聚的多聚泛素化蛋白,因此降解肌纖維蛋白的能力未顯著受損。目前對于UP途徑和AL途徑間通過何種分子機制相互作用了解甚少,值得進一步研究。

結(jié)語 綜上所述,AL途徑是骨骼肌和膈肌萎縮中重要的蛋白水解途徑,在生理及病理狀態(tài)下對維持骨骼肌動態(tài)平衡起重要作用。適當(dāng)活性的AL途徑能清除多余或損傷的細胞器以維持細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài),在維持骨骼肌質(zhì)量中起保護作用;而過度激活的AL途徑能導(dǎo)致蛋白分解狀態(tài)加重,從而導(dǎo)致肌萎縮。同時,AL途徑可能與UP途徑協(xié)同活化并相互具有代償作用,共同分解骨骼肌和膈肌收縮蛋白。目前的主要問題是,為了減輕肌萎縮和肌纖維收縮功能障礙,在肌萎縮發(fā)展過程中的不同時間點抑制還是增強AL途徑的活性,需要更多的研究來為此尋找理論依據(jù)。

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Research progress of involvement of autophagy-lysosomal system in skeletal muscle and diaphragm atrophy

SHAO Lei1, ZHU Xiao-ping2△

(1GraduateStudentofClinicalMedicine,Gradeof2014,SchoolofMedicine,TongjiUniversity,Shanghai200092,China;2DepartmentofRespiratoryMedicine,EastHospital,TongjiUniversity,Shanghai200120,China)

Skeletal muscles are the body′s agent of motion and important sites for the control of metabolism.The respiratory muscles are unique among skeletal muscles,since they must work without sustained rest throughout life.The diaphragm is the principal inspiratory pump muscle,it is more resistant to developing fatigue than limb muscles.The blood flow and the oxidative capacity of the diaphragm exceed those of limb muscles.Muscle atrophy and contractile dysfunction can be found in a variety of diseases.The reductions in muscle mass is tilted toward reduced protein synthesis and enhanced protein degradation.During pathologic conditions,enhanced protein breakdown is the main reason resulting in myofiber atrophy.Recent studies have underlined a critical role for the autophagy-lysosome (AL) system in regulating muscle mass.The main function of AL system involves the delivery of cytoplasmic cargo sequestered inside double-membrane vesicles to the lysosome which can eliminate the cell of superfluous or damaged organelles and proteins.Basal autophagy is necessary to muscle homeostasis,since it is responsible for the removal of intracellular metabolites.But excessive activation of autophagy can aggravate catabolism and contribute to muscle loss.This review focuses on the AL system and discusses its beneficial or detrimental role in skeletal and diaphragm atrophy.

autophagy; lysosomal; skeletal muscle; diaphragm; atrophy

國家自然科學(xué)基金(81170074)

R565

B

10.3969/j.issn.1672-8467.2017.01.017

2016-01-18;編輯:段佳)

△Corresponding author E-mail:z_xping@hotmail.com

*This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (81170074).