禾生指葡孢霉生物學特性及室內(nèi)藥劑篩選

王三喜，何蘇琴，荊卓瓊，文朝慧

( 1.甘南州農(nóng)業(yè)科學研究所，甘肅合作 747000； 2.甘肅省農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所，甘肅蘭州 730070； 3.甘肅出入境檢驗檢疫局，甘肅蘭州 730020)

禾生指葡孢霉生物學特性及室內(nèi)藥劑篩選

王三喜1，何蘇琴2，荊卓瓊2，文朝慧3

( 1.甘南州農(nóng)業(yè)科學研究所，甘肅合作 747000； 2.甘肅省農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所，甘肅蘭州 730070； 3.甘肅出入境檢驗檢疫局，甘肅蘭州 730020)

為了給青稞和燕麥鞘腐病的科學防治提供技術(shù)支持，對其病原菌-禾生指葡孢霉的生長溫度、適宜培養(yǎng)基種類、適宜pH值、存活時間等生物學特性進行了研究，并選取麥類作物上常用的8種殺菌劑進行了室內(nèi)藥劑篩選。結(jié)果表明，禾生指葡孢霉在5～30 ℃下可生長，適宜生長溫度為20～25 ℃；在PSA、PDA、CA、CMA和OMA培養(yǎng)基平板上均可生長、產(chǎn)孢,適宜病菌生長、產(chǎn)孢的培養(yǎng)基為PDA和PSA；在pH值為4～10的PDA平板上均可生長、產(chǎn)孢，適宜生長的pH值為6～10；在5～10 ℃冷藏條件下，禾生指葡孢霉存活時間超過5 a。在試驗濃度(推薦劑量)下，8種殺菌劑對禾生指葡孢霉菌絲生長均具有不同程度的抑制效果，其中50%多菌靈可濕性粉劑(500×)、70%代森錳鋅可濕性粉劑(500×)、430 g·L-1戊唑醇懸浮劑(5 000×，8 000×)和400 g·L-1氟硅唑乳油(5 000×，10 000×)的抑菌效果達100%。

禾生指葡孢霉；生物學特性；殺菌劑；鞘腐病

鞘腐病是近年來發(fā)生在甘肅省及相鄰的高海拔地區(qū)(海拔2 400～3 200 m)栽培青稞、燕麥和野燕麥上的新病害，一般田塊零星發(fā)生，重病田病穗率達 20%～30%，其病原為無性型真菌中一未描述的叢梗絲孢菌新種，被定名為禾生指葡孢霉(Dactylobotyrsgraminicola)[1-2]。本研究旨在通過對禾生指葡孢霉適宜生長溫度、培養(yǎng)基種類、酸堿度及存活時間等生物學特性的研究和室內(nèi)藥劑篩選，為青稞和燕麥鞘腐病的科學防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試菌株Gan-1131(模式菌株)和Gan-333(副模式菌株)由本項目組分離并保存。

試驗用殺菌劑種類及使用濃度見表1。

表1 殺菌劑種類及使用濃度Table 1 Varieties and testing concentrations of fungicides

1.2 試驗方法

1.2.1 禾生指葡孢霉生長對溫度的敏感性試驗

菌株Gan-1131和 Gan-333在PSA (馬鈴薯200 g，蔗糖15 g，瓊脂粉12 g，自來水1 000 mL) 平板上15 ℃黑暗培養(yǎng)6 d后，自菌落邊緣取直徑5 mm菌餅，接種于 PSA 平板中央，分別于5、10、15、20、25、30和35 ℃恒溫黑暗培養(yǎng)，重復(fù)3皿。培養(yǎng)4 d后用十字交叉法測量菌落直徑。

1.2.2 禾生指葡孢霉生長和產(chǎn)孢對培養(yǎng)基的敏感性試驗

菌株Gan-1131在PDA(馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂粉12 g，自來水1 000 mL)平板上20 ℃黑暗培養(yǎng)4 d后，自菌落邊緣取直徑5 mm菌餅，分別接種于PSA、PDA、CA(查氏瓊脂Czapek agar：NaNO33 g，K2HPO41 g，KCl 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g，蔗糖30 g，瓊脂粉12 g，蒸餾水加至1 000 mL)、CMA(玉米粉20 g，瓊脂粉12 g，蒸餾水1 000 mL)和OMA(燕麥片20 g，瓊脂粉12 g，蒸餾水1 000 mL) 平板中央，20 ℃恒溫黑暗培養(yǎng)，重復(fù)3皿。培養(yǎng)4 d后用十字交叉法測量菌落直徑。培養(yǎng)7～10 d后觀察不同培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)和產(chǎn)孢情況。

1.2.3 禾生指葡孢霉生長對培養(yǎng)基pH值的敏感性試驗

菌株Gan-1131在PDA 平板上20 ℃黑暗培養(yǎng)6 d后，自菌落邊緣取直徑5 mm菌餅，接種于pH值分別為4、5、6、7、8、9和10(以1 mol·L-1HCl和1 mol·L-1NaOH調(diào)整培養(yǎng)基pH值)的PDA 平板中央，20 ℃恒溫黑暗培養(yǎng)，重復(fù)5皿。培養(yǎng)4 d后用十字交叉法測量菌落直徑。培養(yǎng)10 d 后觀察產(chǎn)孢情況。

1.2.4 禾生指葡孢霉存活時間試驗

菌株Gan-1131和 Gan-333在PSA 試管斜面上(聚丙烯薄膜為封口膜)20～25 ℃黑暗培養(yǎng)7 d后，置5～10 ℃冷藏柜中保存，每菌株保存2管。每6個月從試管中挑出少許培養(yǎng)物移植于新鮮的PDA平板上，20～25 ℃活化培養(yǎng)，確定菌株存活時間。

1.2.5 禾生指葡孢霉室內(nèi)藥劑篩選

采用含藥平板法進行藥劑篩選試驗，試驗濃度采用推薦劑量。當滅菌培養(yǎng)基溫度降至55 ℃時，在PDA培養(yǎng)基中分別加入8種供試藥劑，配制成不同濃度的含藥平板，以不加藥的PDA培養(yǎng)基為對照，每處理重復(fù)3皿。試驗菌株Gan-1131在PDA平板上25 ℃培養(yǎng)5～7 d，在菌落邊緣取直徑5 mm菌餅，接種到含藥平板中央，置25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，4 d后采用十字交叉法測量菌落直徑，計算抑菌效果；培養(yǎng)至第15天，觀察各處理藥劑的持效期；對于在含藥平板上不生長的各處理，以相同的方法再重復(fù)做一次，培養(yǎng)4 d后，將各處理平板上未生長的菌餅轉(zhuǎn)至新鮮的PDA平板上，25 ℃培養(yǎng)5 d，觀察菌餅可否恢復(fù)生長，并測量菌落直徑。

抑菌效果=(對照菌落直徑-處理菌落直徑)/對照菌落直徑×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度對禾生指葡孢霉生長的影響

由圖1可知，PSA平板上黑暗培養(yǎng)4 d后，供試菌株在5～30 ℃均可生長，適宜生長溫度為20～25 ℃。35 ℃培養(yǎng)4 d未生長之菌轉(zhuǎn)放至25 ℃，3 d后均可恢復(fù)生長。

圖1 溫度對禾生指葡孢霉生長的影響

2.2 培養(yǎng)基對禾生指葡孢霉生長和產(chǎn)孢狀況的影響

由表2、圖2 A～E可知，菌株Gan-1131在供試的5種培養(yǎng)基上20 ℃黑暗培養(yǎng)10 d均可生長并產(chǎn)孢；在PDA和PSA平板上生長速度顯著快于其他3種平板，且產(chǎn)孢量大。

2.3 培養(yǎng)基pH值對禾生指葡孢霉生長的影響

由表3可知，菌株Gan-1131在pH 4～10的PDA 平板上20 ℃培養(yǎng)均可生長和產(chǎn)孢，在pH 6～10 的PDA 平板上均可較好生長，pH值為7時菌落直徑顯著大于其他處理。

2.4 禾生指葡孢霉的存活時間

菌株Gan-1131和 Gan-333在PSA 試管斜面于5～10 ℃冷藏柜中保存5 a仍然存活。菌株Gan-1131保存4 a后仍保持原始分離物的菌落形態(tài)特征；保存5 a后，在20 ℃培養(yǎng)，保持原始分離物的形態(tài)特征，在25 ℃培養(yǎng)，菌落表現(xiàn)不規(guī)則，培養(yǎng)基內(nèi)菌絲黃褐化，但將25 ℃培養(yǎng)5～7 d的培養(yǎng)物重新轉(zhuǎn)接至PDA或PSA平板上，置20 ℃培養(yǎng)，菌落可恢復(fù)原有生長狀態(tài)。菌株Gan-333在保存1 a后即表現(xiàn)出不可逆的菌絲生長速度減慢、菌落不規(guī)則和菌絲黃褐化等衰退特征。具體見圖2 F～O。

2.5 殺菌劑對禾生指葡孢霉菌絲生長的抑制效果

在本試驗濃度下，8種殺菌劑對禾生指葡孢霉菌絲生長均具有不同程度的抑制作用，其中，50%多菌靈可濕性粉劑(500×)、70%代森錳鋅可濕性粉劑(500×)、430 g·L-1戊唑醇懸浮劑(5 000×，8 000×)和400 g·L-1氟硅唑乳油(5 000×，10 000×)的抑菌效果達100%，且持效期在15 d以上(表4、圖2 P～R)。

表2 培養(yǎng)基對禾生指葡孢霉生長和產(chǎn)孢的影響Table 2 Effect of cultural media on hyphal growth and spore production of Dactylobotrys graminicola

同列數(shù)據(jù)后的不同字母表示差異在0.01水平顯著。下表同。

Different letters following data in the same column indicate significant difference at 0.01 level.The same below.

將含藥平板上不生長的各處理菌餅轉(zhuǎn)至新鮮的PDA平板上，25 ℃培養(yǎng)5 d，除70%代森錳鋅可濕性粉劑500×處理菌餅有2/3的不能恢復(fù)生長外，其余處理的所有菌餅均可恢復(fù)生長，50%多菌靈可濕性粉劑500×、70%代森錳鋅可濕性粉劑500×、430 g·L-1戊唑醇懸浮劑5 000×、430 g·L-1戊唑醇懸浮劑8 000×、400 g·L-1氟硅唑乳油5 000×和400 g·L-1氟硅唑乳油10 000×處理后，菌餅在PDA平板上的平均菌落直徑分別為40.33、49.00、6.33、11.33、5.33和6.00 mm。

表3 培養(yǎng)基酸堿度對禾生指葡孢霉菌絲生長的影響Table 3 Effect of pH of the media on mycelial growth of Dactylobotrys graminicola

表4 不同種類殺菌劑對禾生指葡孢霉菌絲生長的抑制效果Table 4 Inhibition effect of various fungicides on mycelial growth of Dactylobotrys graminicola

A～I:菌株Gan-1131保存5 a后再培養(yǎng)的菌落形態(tài)；A:PDA 20 ℃培養(yǎng)7 d；B:PSA 20 ℃培養(yǎng)7 d；C:OMA 20 ℃培養(yǎng)10 d；D:CMA 20 ℃培養(yǎng)10 d；E:CA 20 ℃培養(yǎng)10 d；F～I:PDA 25 ℃培養(yǎng)10 d；J:菌株Gan-1131分離株P(guān)SA 25 ℃培養(yǎng)7 d；K～N:菌株Gan-333保存1 a后再培養(yǎng)的菌落形態(tài)；K和L:PDA 20 ℃培養(yǎng)25 d；M和N:PDA 25 ℃培養(yǎng)25 d；O:菌株Gan-333分離株P(guān)SA 25 ℃培養(yǎng)7 d；P～R:不同種類殺菌劑對菌株Gan-1131的抑制效果，25 ℃培養(yǎng)15 d，培養(yǎng)皿內(nèi)徑85 mm。圖中，J和O引自參考文獻[2]。

A-I:Colony morphology of Gan-1131 stored for 5 a；A:Cultured for 7 d at 20 ℃ on PDA; B:Cultured for 7 d at 20 ℃ on PSA; C:Cultured for 10 d at 20 ℃ on OMA; D:Cultured for 10 d at 20 ℃ on CMA; E:Cultured for 10 d at 20 ℃ on CA; F-I:Cultured for 10 d at 25 ℃ on PDA；J:Original morphological characters of strain Gan-1131 cultured for 7 d at 25 ℃ on PSA；K-N:Colony morphology of Gan-333 stored for 1 a；K and L:Cultured for 25 d at 20 ℃ on PDA; M and N:Cultured for 25 d at 25 ℃ on PDA；O:Original morphological characters of Gan-333 cultured for 7 d at 25 ℃ on PSA；P-R:Inhibition effect of various fungicides on strain Gan-1131 cultured for 15 d at 25 ℃ with culture dish inner diameter 85 mm.Fig. 2-J and Fig. 2-O were cited from reference [2].

圖2 禾生指葡孢霉菌落形態(tài)變化及不同種類殺菌劑的抑菌效果

Fig.2 Variations of colony morphology ofDactylobotrysgraminicolaand inhibition effect of various fungicides

3 討 論

禾生指葡孢霉生長溫度范圍廣(5～30 ℃)，對基質(zhì)及酸堿度的要求低(在多種培養(yǎng)基及pH 6～10的PDA 平板上可較好地生長、產(chǎn)孢)，離體存活時間長(在PSA斜面上5～10 ℃下的存活時間超過5 a)，這些特性非常有利于這種病菌在高海拔、冷涼地區(qū)的自然生態(tài)條件下長期存活，但其初侵染源及在自然條件下存活情況還有待于今后更進一步的試驗研究。

多菌靈、代森錳鋅、戊唑醇和氟硅唑均為廣譜性殺菌劑，對大麥和燕麥的多種病原真菌有抑制作用，廣泛用于鐮刀菌穗腐病、黑穗病、葉斑病、銹病、根腐病等病害的防治[3-10]。

室內(nèi)藥劑篩選試驗結(jié)果顯示，50%多菌靈可濕性粉劑、70%代森錳鋅可濕性粉劑、430 g·L-1戊唑醇懸浮劑和400 g·L-1氟硅唑乳油在試驗濃度下，對禾生指葡孢霉菌絲生長的抑制效果達100%。自含代森錳鋅的平板上移出的病菌，有2/3的菌餅不能恢復(fù)生長，說明保護性殺菌劑代森錳鋅可部分地殺死禾生指葡孢霉菌。自含氟硅唑和戊唑醇平板上移出的病菌，其恢復(fù)生長的能力弱于從含多菌靈平板上移出的病菌，說明氟硅唑和戊唑醇對此種病菌的抑制力強于多菌靈。

依據(jù)室內(nèi)藥劑篩選試驗結(jié)果，多菌靈、代森錳鋅、戊唑醇和氟硅唑可作為青稞和燕麥鞘腐病田間防治的試驗藥劑。根據(jù)不同地區(qū)青稞和燕麥的主要病害種類，選擇合適的藥劑和施藥方式，可起到兼防兼治多種病害的效果。

本研究中，除病菌適宜生長溫度是利用原始分離菌進行試驗外，其余試驗均是利用保存1～5 a的菌株進行的試驗，而菌株Gan-333在保存1 a后即表現(xiàn)出不可逆的菌絲生長速度減慢、菌落不規(guī)則和菌絲黃褐化等衰退特征，故后續(xù)的適宜培養(yǎng)基種類、病菌適宜生長酸堿度等生物學特性研究和室內(nèi)藥劑篩選試驗只選用了菌株Gan-1131。關(guān)于菌株衰退原因還有待更進一步研究。

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Biological Characteristics ofDactylobotrysgraminicolaand Fungicides Screening TestinVitro

WANG Sanxi1,HE Suqin2,JING Zhuoqiong2,WEN Zhaohui3

(1.Institute of Agricultural Sciences of Gannan Area,Hezuo,Gansu 747000,China; 2.Institute of Plant Protection,Gansu Academy of Agricultural Sciences,Lanzhou,Gansu 730070,China; 3.Gansu Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Lanzhou,Gansu 730020,China)

Sheath rot of hulless barley and oats,caused byDactylobotrysgraminicola,is a new disease in the highlands of Gansu province and the neighboring region in recent years. In order to providing technical support for the disease controlling,biological characteristics(cardinal temperatures,proper medium,optimum pH value,survival time,etc.) and fungicides screening ofDactylobotrysgraminicolainvitrowere investigated. The fungal cardinal growth temperatures were evaluated by temperature gradients method. The proper medium and pH value were evaluated by hyphae growth and condia production situation on different culture medium plates and on pH 4 to 10 PDA plates,respectively. The fungal survival time was assessed by determination of the survival situation of preserved strains on a regular basis(every six months) and fungicides amendment(medicated plate method) were assessed for inhibitory effect onDactylobotrysgraminicolainvitrowith eight different fungicides. The results showed thatDactylobotrysgraminicolacan grow at 5 to 30 ℃,the optimal growth temperature is 20～25 ℃. The fungus can grow and sporulate on PSA,PDA,CA,CMA and OMA plates,of which PDA and PSA are more suitable for the fungal growth and sporulation. The fungus can grow and sporulate on PDA plate with pH value 4 to 10,and suitable pH value ranges from 6 to 10. Survival time ofDactylobotrysgraminicolawas longer than 5 a at 5 to 10 ℃. Under test concentrations(recommended dose),all eight fungicides could inhibit the mycelial growth ofDactylobotrysgraminicola,of which carbendazim 50% WP(500×),mancozeb 70% WP(500×),tebuconazole 430 g·L-1SC(5 000×,8 000×) and flusilazole 400 g·L-1EC(5 000×,10 000×) made inhibitory effects up to 100%.

Dactylobotrysgraminicola; Biological characteristics; Fungicides; Sheath rot

時間：2017-01-16

2016-06-01

2016-06-09

國家燕麥蕎麥產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(CARS-08-C-1)

E-mail：466024948@qq.com

何蘇琴(E-mail:gshesuqin@sina.com)

S43

A

1009-1041(2017)02-0281-06

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