• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    重慶中國三峽博物館小環(huán)境空氣微生物種屬與數(shù)量的動(dòng)態(tài)研究

    2017-03-01 09:13:30范文奇張麗龍
    關(guān)鍵詞:泳道展廳條帶

    唐 歡,范文奇,王 春,張麗龍

    (1. 重慶中國三峽博物館,重慶 400015; 2. 重慶市疾病預(yù)防控制中心,重慶 400042)

    重慶中國三峽博物館小環(huán)境空氣微生物種屬與數(shù)量的動(dòng)態(tài)研究

    唐 歡1,范文奇1,王 春1,張麗龍2

    (1. 重慶中國三峽博物館,重慶 400015; 2. 重慶市疾病預(yù)防控制中心,重慶 400042)

    為了發(fā)現(xiàn)文物展陳環(huán)境中潛在的微生物病害,為館藏文物的預(yù)防性保護(hù)提供科學(xué)依據(jù),結(jié)合傳統(tǒng)的純培養(yǎng)技術(shù)和基于細(xì)菌16SrRNA基因的PCR-DGGE(PCR-Denaturing gradient gel electrophoresis)技術(shù),綜合分析博物館小環(huán)境中可培養(yǎng)細(xì)菌的種屬、數(shù)量及其時(shí)空動(dòng)態(tài)變化特征。結(jié)果表明,博物館小環(huán)境內(nèi)可培養(yǎng)的空氣微生物存在季節(jié)差異,在數(shù)量和多樣性上均表現(xiàn)為夏季顯著高于冬季,其主要優(yōu)勢菌群包括Acinetobactersp.、Staphylococcussp.、Pseudomonassp.和Advenellasp.。此外,夏季空氣的特征菌屬為Acinetobactersp.和Micrococcussp.,冬季典型菌種為Bacillussp.。

    博物館環(huán)境;預(yù)防性保護(hù);PCR-DGGE;空氣微生物

    0 引 言

    博物館環(huán)境是指收藏與展示各類可移動(dòng)文物的相對(duì)密閉空間的總體[1],主要包括以囊匣、展柜為代表的微環(huán)境,以展廳、庫房為代表的小環(huán)境,整個(gè)博物館建筑空間為代表的大環(huán)境以及博物館外部環(huán)境[2]。除了溫濕度、光照、污染氣體等常見環(huán)境因素之外,微生物、昆蟲等生物因素亦是博物館環(huán)境研究的重要內(nèi)容之一。隨著文物預(yù)防性保護(hù)理念的日益深入,監(jiān)測文物展陳環(huán)境中的空氣微生物組成、控制博物館小微環(huán)境中的微生物污染已成為近年來文物預(yù)防性保護(hù)研究的一個(gè)新方向,比利時(shí)、法國、波蘭以及國內(nèi)部分博物館均開展了博物館內(nèi)空氣微生物的研究[3-6]。

    以往對(duì)博物館展廳內(nèi)空氣微生物開展的研究主要聚焦于特定時(shí)間點(diǎn)的微生物數(shù)量和種類,但空氣微生物是動(dòng)態(tài)變化的,會(huì)隨著時(shí)間、季節(jié)和參觀人流量等因素的變化而發(fā)生改變,因此,對(duì)其進(jìn)行連續(xù)動(dòng)態(tài)的監(jiān)測才能更好地發(fā)現(xiàn)其數(shù)量和種屬的演替規(guī)律,為潛在的文物微生物病害提供科學(xué)的預(yù)判依據(jù)。

    變性梯度凝膠電泳(Denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)技術(shù)自1993年被Muyzer引入微生物生態(tài)學(xué)研究以來,現(xiàn)已被廣泛地應(yīng)用于環(huán)境微生物群落的多樣性和動(dòng)態(tài)性分析。該技術(shù)不僅可以研究微生物結(jié)構(gòu)的時(shí)間空間變化特征,還可以通過對(duì)凝膠上的特定條帶進(jìn)行回收并測序,進(jìn)而鑒定條帶對(duì)應(yīng)的菌落種屬[7]。本研究通過傳統(tǒng)的菌落培養(yǎng)檢測博物館小環(huán)境中的空氣微生物數(shù)量,結(jié)合PCR-DGGE技術(shù)研究菌落的結(jié)構(gòu)和組成,對(duì)博物館小環(huán)境中冬季和夏季的空氣微生物數(shù)量與種類進(jìn)行了時(shí)空動(dòng)態(tài)分析。

    1 材料與方法

    1.1 主要設(shè)備及試劑

    空氣浮游菌采樣器型號(hào)為ZR2050型(青島眾瑞);手持式溫度/相對(duì)濕度采集器型號(hào)為U12-011型(HOBO);細(xì)菌培養(yǎng)用生化培養(yǎng)箱為SPX-250B型(上海躍進(jìn));PCR儀為C1000型(Bio-Rad);核酸定量儀為Nano Drop 2000型(Thermo);凝膠成像系統(tǒng)為Gel Doc XR+(Bio-Rad);變性梯度凝膠電泳儀為DCodeTMUniversal Mutation Detection System(Bio-Rad)。細(xì)菌總數(shù)檢測用營養(yǎng)瓊脂平板購自重慶龐通醫(yī)療器械有限公司,細(xì)菌總菌DNA提取試劑盒為QIAGEN(51604, QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit);EXTaq DNA聚合酶購自TaKaRa。

    1.2 空氣微生物采樣、培養(yǎng)及計(jì)數(shù)

    采樣展廳為位于博物館一樓的壯麗三峽展廳,該展廳是博物館參觀人流量最大的展廳。本研究在該展廳設(shè)置了4個(gè)采樣點(diǎn),分別編號(hào)為ZL1、ZL2、ZL3、ZL4,采樣點(diǎn)在展廳中的位置如圖1所示。整個(gè)展廳做了大量隔斷,布局較為復(fù)雜。ZL1采樣點(diǎn)靠近展廳入口處,該處為開放式陳列,空間寬敞,存放動(dòng)物標(biāo)本等有機(jī)質(zhì)藏品;ZL2采樣點(diǎn)位于展廳最內(nèi)側(cè),展示刺繡等有機(jī)質(zhì)文物,同時(shí)是該展廳全年平均濕度最大的檢測位點(diǎn);ZL3號(hào)采樣點(diǎn)位于展廳內(nèi)側(cè),展示有紡織品、皮革制品等文物; ZL4號(hào)采樣點(diǎn)位于展廳出口附近,展示竹木制品、刺繡等民族文物。可見,四個(gè)采樣點(diǎn)處展覽的文物均以有機(jī)質(zhì)文物為主,對(duì)于文物的微生物病害較為敏感。

    圖1 采樣點(diǎn)位置布局圖

    本研究于夏季(2013年6、7、8月)和冬季(2013年11、12月及2014年1月)對(duì)該展廳進(jìn)行了空氣微生物樣品的采集。具體采樣時(shí)間分別為2013年6月24日,7月23日,8月22日,11月29日,12月25日及2014年1月15日。

    采樣方法參照我國《室內(nèi)空氣質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》(GB/T18883—2002)的相關(guān)要求進(jìn)行??諝飧∮尉蓸悠髦糜诰嗟孛?.2m高處進(jìn)行空氣樣本采集,采樣流量參數(shù)設(shè)置為10 L/min,采樣時(shí)長設(shè)置為5min。采集后的培養(yǎng)皿放入生化培養(yǎng)箱中,37 ℃條件下倒置培養(yǎng)48 h后計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)完成后,營養(yǎng)瓊脂上的全部菌落經(jīng)無菌去離子水充分沖洗后凍存,進(jìn)行空氣微生物細(xì)菌總DNA提取。

    1.3 空氣微生物總菌DNA的提取

    細(xì)菌總菌DNA的提取按照QIAGEN試劑盒提供的protocol進(jìn)行。 提取后的DNA經(jīng)Nano Drop 2000測定樣品的濃度及純度,經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳(1%)檢測樣品的完整性。

    1.4 PCR擴(kuò)增[8]

    細(xì)菌16SrRNA基因 V3區(qū)的擴(kuò)增引物由Takara公司合成, 序列分別為V3-357f-GC (5’-CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGTACGGGAGGCAGCAG-3′)和 V3-518r (5′-ATTACC GCGGCTGCTGG-3′), PCR產(chǎn)物長度大小預(yù)計(jì)為217bp。PCR反應(yīng)體系為25μL,其中模板DNA量為20ng,10×EXTaq buffer 2.5μL,dNTP用量為2.5μL,ExTaq酶0.25μL,引物357f-GC、518r各0.5μL,添加無菌雙蒸水至終體積25μL。PCR循環(huán)條件為94℃預(yù)變性5min;94℃ 30s,56℃ 30s,72℃ 1min,30個(gè)循環(huán);最后72℃延伸10min。

    按照Thompson和Xiong等的方法[9,10]進(jìn)行Reconditioning PCR,以此去除PCR引物二聚體對(duì)DGGE進(jìn)行的影響。Reconditioning PCR的模板為第一次PCR的產(chǎn)物(用量為5μL),終體系為25μL,循環(huán)次數(shù)減少至5個(gè)循環(huán),其他條件均與第一次PCR的條件相同。

    1.5 DGGE電泳及特殊條帶鑒定

    按照DCode System的說明書,參照Muyzer[11]和Walter[12]等報(bào)道的DGGE條件和方法,對(duì)16SrRNA基因V3區(qū)序列擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行DGGE電泳。DGGE使用8%的聚丙烯酰胺,變性梯度為35%~65%,電泳緩沖液為1×TAE(pH=8.4)。220V條件下預(yù)電泳10min后,130V的固定電壓電泳4.5h。電泳結(jié)束后的聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行EB染色,由凝膠成像系統(tǒng)捕捉圖像后,用Quantity One軟件(BioRad,Hercules,California,USA)進(jìn)行條帶數(shù)量、位置、亮度等信息的統(tǒng)計(jì)分析,并通過軟件獲取的數(shù)據(jù)矩陣進(jìn)行UPGMA相似性聚類分析。

    用無菌刀片將凝膠上的特定條帶切割下來,使用1×EXTaq buffer 漂洗2次,將其搗碎,加入40μL×EXTaq buffer,4℃條件下浸泡過夜。以浸泡液作為模板,重新進(jìn)行PCR擴(kuò)增,引物序列為357f(5′-TACGGGAGGCAGCAG-3′)和518r(5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′),PCR條件同1.4[13]。PCR產(chǎn)物經(jīng)二次DGGE跑膠后, 確認(rèn)與原切割條帶位置一致的,經(jīng)T-A克隆后進(jìn)行測序[14,15],返回序列在Genbank進(jìn)行BLAST比對(duì),網(wǎng)址為www.ncbi.nlm.nih.com。

    1.6 數(shù)據(jù)分析

    1.6.1 多樣性分析 通過DGGE圖譜進(jìn)行的微生物群落多樣性分析包括:豐富度(richness,S),即 圖譜上每條泳道內(nèi)的條帶數(shù);微生物區(qū)系的Shannon-Wiener 指數(shù)(H′),計(jì)算方法為H′=-∑Pi lnPi,其中, Pi為第i條帶的吸光度與該泳道所有條帶吸光度總和的比值[16,17]。

    圖2 展廳冬夏兩季的溫濕度和菌落總數(shù)檢測結(jié)果

    表1是對(duì)于該展廳內(nèi)四個(gè)不同的采樣點(diǎn)進(jìn)行的數(shù)據(jù)分析。結(jié)果顯示,雖然博物館大環(huán)境受中央空調(diào)的調(diào)控,但四個(gè)采樣點(diǎn)夏季的溫度仍然極顯著高于冬季(p<0.01),濕度在不同的采樣位置中未見明顯變化(p>0.05)。在檢測數(shù)據(jù)中,最高溫度25.5℃,最低溫度14.1℃,最大濕度74%RH,均出現(xiàn)于ZL1采樣點(diǎn);濕度最低為50%RH,出現(xiàn)于ZL4采樣點(diǎn)。1號(hào)及4號(hào)采樣點(diǎn)分別接近展廳的入口與出口,溫濕度變化可能更易受博物館大環(huán)境和參觀人流的影響,因此波動(dòng)較大。此外,所有采樣點(diǎn)的濕度幾乎均在60%RH以上,這與重慶市本身年均濕度超過70%有關(guān)。

    空氣微生物總數(shù)最高檢出點(diǎn)為ZL3號(hào)采樣點(diǎn),其次為ZL2采樣點(diǎn)。這兩個(gè)采樣點(diǎn)均位于展廳中部,展廳蜿蜒的設(shè)計(jì)使其空氣流動(dòng)性較差,因此容易滋生微生物。此外,這兩個(gè)采樣點(diǎn)的菌落總數(shù)也表現(xiàn)出了季節(jié)性差異(p<0.01),即在這兩個(gè)地點(diǎn),夏季空氣中的微生物總量極顯著地高于冬季。

    表1 4個(gè)采樣點(diǎn)冬夏兩季的溫濕度和菌落總數(shù)檢測結(jié)果

    注:**,與夏季數(shù)據(jù)相比,p<0.01

    2 冬夏兩季博物館小環(huán)境空氣微生物多樣性的比較

    首先,從圖3 ①的微生物純培養(yǎng)結(jié)果可直觀看出,夏季(6~8月)2號(hào)采樣點(diǎn)的采樣平板上菌落密布,數(shù)量明顯多于冬季三個(gè)月(11~1月)的采樣平板。如果對(duì)如此之多的菌落分別單獨(dú)進(jìn)行種屬鑒定,不僅工作量龐大,而且可能存在大量相同結(jié)果。因此,使用DGGE的方法對(duì)細(xì)菌種類進(jìn)行分析就顯得尤為方便高效了。

    圖3 利用PCR-DGGE對(duì)采集的空氣微生物樣品進(jìn)行種屬鑒定的過程

    利用PCR-DGGE技術(shù)對(duì)采集的空氣微生物樣品種屬進(jìn)行鑒定的過程如圖3所示:將不同平板上的所有細(xì)菌菌落混合沖洗下來作為獨(dú)立的總DNA進(jìn)行提取,接下來對(duì)這個(gè)總DNA樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增并進(jìn)一步實(shí)施變性梯度電泳后,一個(gè)平板上所有細(xì)菌的信息就轉(zhuǎn)化到圖3②中每一個(gè)單獨(dú)的泳道內(nèi)。根據(jù)DGGE的原理,泳道內(nèi)的每一個(gè)條帶理論上分別對(duì)應(yīng)了一種細(xì)菌,而不同泳道間同一水平位置的條帶代表相同種類的細(xì)菌[11,18,19]。條帶越粗越亮,則代表該樣品中,這個(gè)條帶對(duì)應(yīng)的某種細(xì)菌數(shù)量越多。為了了解不同條帶究竟是哪一種細(xì)菌,需要對(duì)目的條帶進(jìn)行切膠回收以收集其DNA,通過二次PCR后,進(jìn)一步測序比對(duì)而明確細(xì)菌種屬[20-22]。

    首先, 從本實(shí)驗(yàn)獲得的DGGE圖譜(圖4)上可以明顯看到,在四個(gè)采樣點(diǎn)夏季與冬季的24個(gè)空氣微生物樣品中,大部分樣品泳道中具有共同的條帶C、D、E、H、J和K。經(jīng)過對(duì)條帶回收并測序后發(fā)現(xiàn),對(duì)應(yīng)的微生物分別為Acinetobacterlwoffii(相似性99%)、Staphylococcushominis(相似性99%)、Advenellasp.(相似性100%)、Staphylococcussp.(相似性100%)、Pseudomonassp.(相似性100%)和Staphylococcuswarneri(相似性100%)。由此可見,在壯麗三峽展廳這個(gè)博物館小環(huán)境中,全年空氣微生物的主要群落為不動(dòng)桿菌屬、葡萄球菌屬、銅綠假單胞菌和Advenella屬,其中又以葡萄球菌屬最為優(yōu)勢。雖然C和D條帶分別對(duì)應(yīng)的Acinetobacterlwoffii和Staphylococcushominis幾乎貫穿了24個(gè)泳道,既24個(gè)樣品中都有檢出,但從條帶的亮度可見,代表夏季月份的泳道1~3中,這兩個(gè)條帶的亮度基本都比代表冬季的4~6號(hào)泳道亮度高,從側(cè)面說明這兩種菌的數(shù)量在夏季比在冬季數(shù)量多。

    圖4 四個(gè)采樣點(diǎn)冬夏季空氣微生物的PCR-DGGE譜圖

    與上述條帶不同的是,A、B和I條帶較多的出現(xiàn)在夏季空氣微生物的樣品中,而在冬季樣品中很少出現(xiàn)。經(jīng)過比對(duì)發(fā)現(xiàn),它們分別為Acinetobacterbaumannii.(相似性99%)、Acinetobacterbaumannii. (相似性100%)和Micrococcussp. (相似性100%);條帶F和G則在ZL1、2、3號(hào)采樣點(diǎn)的冬季樣品中出現(xiàn),夏季樣品中條帶極其微弱或未檢出,它們經(jīng)測序發(fā)現(xiàn)均為Bacillusthuringiensis.(相似性分別為99%和100%)。這些結(jié)果表明:在該展廳的空氣微生物組成中,除了擁有共同的優(yōu)勢菌群之外,冬夏兩個(gè)季節(jié)各自具有不同的典型菌種:夏季的特征菌屬為不動(dòng)桿菌屬和微球菌屬,而冬季芽孢桿菌屬更為活躍。特征條帶的測序結(jié)果見表2。

    表2 DGGE條帶測序比對(duì)結(jié)果

    此外,DGGE電泳圖中還可以直觀看出夏季樣品條帶的數(shù)量多于冬季樣品,說明夏季空氣微生物的種類要多于冬季。對(duì)24個(gè)泳道的條帶數(shù)量和亮度進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn),夏季樣品的微生物種類顯著高于冬季樣品(p<0.05)(圖5),且夏季空氣微生物的多樣性指數(shù)極顯著地高于冬季(p<0.01)(圖6)。詳細(xì)對(duì)4個(gè)采樣點(diǎn)進(jìn)行分析可以看出,豐富度和多樣性指數(shù)最高的采樣點(diǎn)為ZL2號(hào)位置,且與3號(hào)采樣點(diǎn)差異不顯著,該結(jié)果與微生物數(shù)量統(tǒng)計(jì)結(jié)果類似。同時(shí),1、2、3號(hào)采樣點(diǎn)的微生物豐富度和多樣性指數(shù)在冬夏兩季均高于4號(hào)采樣點(diǎn)(p<0.01)(表3)。

    圖5 冬夏兩季空氣微生物豐富度的比較

    圖6 冬夏兩季空氣微生物多樣性指數(shù)的比較

    ZL1夏季ZL1冬季ZL2夏季ZL2冬季ZL3夏季ZL3冬季ZL4夏季ZL4冬季豐富度21.00±2.6518.67±3.5121.33±4.1617.33±2.5321.67±3.7917.33±6.0315.67±3.06??13.00±2.65??多樣性指數(shù)2.66±0.112.43±0.172.80±0.142.51±0.072.74±0.182.53±0.462.53±0.21??2.22±0.08??

    注:**,與夏季相比,p<0.01

    從UPGMA聚類分析的結(jié)果可以看出(圖7),每個(gè)采樣點(diǎn)的數(shù)據(jù)基本能夠較好地聚為一簇,表明各個(gè)采樣點(diǎn)在可培養(yǎng)空氣微生物的組成上分別具有較大的相似性。在3號(hào)采樣點(diǎn),6、7、8三個(gè)夏季月份空氣微生物在組成上的相似程度為61%,說明整個(gè)夏季該采樣位置的空氣微生物種類較為穩(wěn)定。4號(hào)采樣點(diǎn)在11、12及1月三個(gè)月中,空氣微生物的種類相似性達(dá)到70%,說明整個(gè)冬季該采樣點(diǎn)的空氣中,微生物種類未發(fā)生明顯波動(dòng)。

    圖7 DGGE圖譜UPGMA聚類分析結(jié)果

    3 討 論

    1) PCR-DGGE分析技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)。從技術(shù)上看,PCR-DGGE本身是建立在不依賴于培養(yǎng)的條件下,對(duì)微生物群落多樣性和群落變化動(dòng)態(tài)開展檢測分析的技術(shù),廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、環(huán)境、農(nóng)業(yè)、林業(yè)及食品研究等領(lǐng)域[23-25]。在文博行業(yè),2015年,Lech T等應(yīng)用PCR-DGGE技術(shù)研究了波蘭國家檔案館及國內(nèi)最大的博物館Krakow博物館庫房及展廳內(nèi)空氣微生物菌群的組成[4]。除了對(duì)多樣性進(jìn)行分析外,PCR-DGGE技術(shù)還可以直接鑒定微生物群落組成,研究者可對(duì)DGGE圖譜上感興趣的特定條帶切割回收并進(jìn)行菌種鑒定。因此,在微生物的種屬分析方面DGGE具有直觀、快速的獨(dú)特優(yōu)勢。利用其一個(gè)條帶對(duì)應(yīng)一種微生物的特點(diǎn),但國蓉等利用可培養(yǎng)的標(biāo)準(zhǔn)菌株制備成marker,對(duì)微生態(tài)藥品中的益生菌進(jìn)行了PCR-DGGE的種屬分類[26], Shanqimuge等結(jié)合純培養(yǎng)技術(shù)和PCR-DGGE技術(shù)對(duì)大曲的菌種進(jìn)行直接快速的鑒定[27]。以本研究為例,若夏季樣品中培養(yǎng)菌落數(shù)大于200CFU,如果分別挑取單個(gè)克隆進(jìn)行菌落PCR再進(jìn)行測序比對(duì),工作量非常巨大,效率明顯較低。本研究借鑒不依賴培養(yǎng)的微生物的研究方法,以一個(gè)混合樣作為一個(gè)整體,進(jìn)行混合菌落的總DNA提取,再通過DGGE的條帶分割將混合信息直觀呈現(xiàn)于膠上,選取具有特征或研究意義的條帶進(jìn)行切割、測序、比對(duì),大大提高了工作效率,且更容易發(fā)現(xiàn)優(yōu)勢菌群,如該小環(huán)境中冬夏兩季的樣品泳道中均出現(xiàn)了C、D、E、H、J和K條帶,則直觀說明這些條帶所對(duì)應(yīng)的微生物菌落為貫穿整個(gè)小環(huán)境的冬夏兩季的優(yōu)勢菌群。

    2) 博物館環(huán)境內(nèi)空氣微生物的主要種類。在組成上,對(duì)于博物館小環(huán)境中空氣微生物種類的研究中,武望婷等曾報(bào)道首都博物館內(nèi)空氣微生物細(xì)菌組成以微球菌為主,還包括桿菌、芽孢桿菌、考克氏菌和假單胞菌[28];Gaüzère等對(duì)于盧浮宮內(nèi)的空氣微生物進(jìn)行了連續(xù)6個(gè)月的監(jiān)測,經(jīng)過高通量測序顯示其空氣微生物的優(yōu)勢菌屬分別為副球菌屬、不動(dòng)桿菌屬、銅綠假單胞菌、棲水菌屬、鞘氨醇單胞菌屬、鏈球菌屬和葡萄球菌屬等[5]。本研究通過對(duì)DGGE條帶的割膠測序發(fā)現(xiàn),展廳內(nèi)樣品可培養(yǎng)的空氣微生物主要優(yōu)勢菌群為不動(dòng)桿菌屬、銅綠假單胞菌、葡萄球菌屬及Advenellasp.,與Gaüzère等的研究基本相吻合。高通量測序雖然獲得了更豐富的多樣性數(shù)據(jù),但對(duì)于微生物組成的季節(jié)性演替和組成特征卻不如DGGE圖譜直觀,如本研究的圖譜分析可見夏季空氣的特征菌屬為Acinetobactersp.和Micrococcussp.,冬季典型菌種為Bacillussp.。另外,關(guān)于類似博物館這一密閉空間中空氣真菌的研究,馬燕天等對(duì)于莫高窟洞窟空氣微生物的研究發(fā)現(xiàn),在9月份窟外真菌數(shù)量檢出在24~32CFU/m3,在密閉的洞窟內(nèi),真菌數(shù)量比窟外更少[29];本課題組也曾對(duì)臨時(shí)展廳中空氣微生物真菌進(jìn)行計(jì)數(shù),可培養(yǎng)的真菌數(shù)量較少,5~8月真菌平均數(shù)量低于15CFU/m3[30]。在本實(shí)驗(yàn)中部分采樣位點(diǎn)甚至未檢出(數(shù)據(jù)未給出),因此在本研究中并未對(duì)真菌進(jìn)行數(shù)量統(tǒng)計(jì)和多樣性分析。

    3) 影響空氣微生物穩(wěn)定性的因素。在空氣微生物的穩(wěn)定性上,Tringe等的研究結(jié)果給予的提示是,與戶外環(huán)境不同,影響密閉的室內(nèi)環(huán)境中空氣微生物組成的主要原因可能是由于小環(huán)境空氣中的選擇性抗力,氧化損傷及干燥過程、鐵限制等均會(huì)影響微生物群落的構(gòu)成,也可能與人流活動(dòng)有關(guān)[31]。而本實(shí)驗(yàn)DGGE圖譜UPGMA聚類分析結(jié)果顯示,ZL3采樣點(diǎn)冬季空氣微生物的種類相似程度最高達(dá)到73%,ZL1和ZL2號(hào)采樣點(diǎn)的夏季空氣微生物組成相似性最高甚至達(dá)到83%。類似的研究結(jié)果還見于馬燕天等對(duì)莫高窟窟內(nèi)環(huán)境微生物的調(diào)查[29]。其結(jié)果顯示,游客人數(shù)只對(duì)窟外環(huán)境有影響,而對(duì)封閉的洞窟內(nèi)的微生物無影響??梢姡趨⒂^人員不斷發(fā)生改變的情況下,微生物組成并未發(fā)生較大變化。因此,影響博物館內(nèi)空氣微生物多樣性的主要原因還是小環(huán)境本身,季節(jié)的變化和參觀者的擾動(dòng),對(duì)于封閉環(huán)境的穩(wěn)態(tài)影響不大。

    綜合展廳這一博物館小環(huán)境的空氣微生物數(shù)量及種類分析結(jié)果,濕度的穩(wěn)定對(duì)于微生物組成可能具有一定影響,而溫度則可能影響其數(shù)量,因此對(duì)于小環(huán)境內(nèi)的溫濕度控制仍然是控制室內(nèi)微生物的重要措施[32]。此外,博物館中央空調(diào)系統(tǒng)的濕潤器、濾網(wǎng)等組件上往往是微生物積存和繁殖的場所,可通過管網(wǎng)向通風(fēng)下游散播,因此也不能忽視博物館小環(huán)境中的空調(diào)送風(fēng)系統(tǒng)對(duì)空氣微生物的影響,需定期進(jìn)行空調(diào)系統(tǒng)的維護(hù)。

    4 結(jié) 論

    1) 在博物館小環(huán)境微生物數(shù)量上,在全年濕度較為穩(wěn)定,而夏季溫度極其顯著高于冬季的條件下,該展廳內(nèi)空氣微生物菌落總數(shù)在夏季顯著高于冬季。

    2) 在微生物組成上,該展廳冬夏兩個(gè)季節(jié)的可培養(yǎng)空氣微生物組成穩(wěn)定性高于39%,且夏季樣品中的微生物種類顯著高于冬季樣品。不動(dòng)桿菌屬、葡萄球菌屬、銅綠假單胞菌和Advenella屬的微生物在冬夏兩季都是整個(gè)展廳空氣內(nèi)的優(yōu)勢菌群,在展廳的4個(gè)采樣點(diǎn)均可采集到。此外,夏季空氣的特征菌屬為不動(dòng)桿菌屬和微球菌屬,冬季典型菌種為芽孢桿菌屬。

    3) 保持展廳內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)有助于保持微生物組成的穩(wěn)定,恒溫恒濕、加強(qiáng)展廳空調(diào)送風(fēng)系統(tǒng)的微生物控制工作對(duì)控制博物館小環(huán)境的微生物污染具有重要作用。

    [1] 陳元生,解玉林. 博物館文物保持環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[J]. 文物保護(hù)與考古科學(xué),2002,14(S1):152-191. CHEN Yuan-sheng,XIE Yu-lin. Studies on museum environmental standards[J]. Sci Conserv Archaeol, 2002,14(S1):152-191.

    [2] 吳來明,徐方圓,黃 河. 博物館環(huán)境監(jiān)控及相關(guān)物聯(lián)網(wǎng)技術(shù)應(yīng)用需求分析[J]. 文物保護(hù)與考古科學(xué),2011,23(3):96-102. WU Lai-ming, XU Fang-yuan, HUANG He. The demand analysis of museum environment monitoring and the application of Internet of things[J]. Sci Conserv Archaeol, 2011,23(3):96-102.

    [3] Gysels K, Delalieux F, Deutsch F,etal.Indoor environment and conservation in the royal museum of fine arts, antwerp, belgium[J]. J Cultl Herit, 2004,5(2):221-230.

    [4] Lech T, Ziembinska-Buczynska A. Evaluation of a modified sampling method for molecular analysis of air mciroflora[J]. Genet Mol Res, 2015,14(2):3200-3208.

    [5] Gaüzère C, Moletta-Denat M, Blanquart H,etal. Stability of airborne microbes in the Louvre Museum over time[J]. Indoor air, 2014,24(1):29-40.

    [6] Chen Y P, Cui Y, Dong J G. Variation of airborne bacteria and fungi at Emperor Qin’s Terra-Cotta Museum, Xi’an, China, during the “Oct. 1” gold week period of 2006[J]. Environ Sci Pollut Res Int, 2010,17(2):478-485.

    [7] Su C, Lei L, Duan Y,etal. Culture-independent methods for studying environmental microorganisms: methods, application, and perspective[J]. Appl Microbiol Biotechnol, 2012, 93(3):993-1003.

    [8] Liu J, Wu D, Ahmed A.etal. Comparison of the gut microbe profiles and numbers between patients with liver cirrhosis and healthy individuals[J]. Curr Microbiol, 2012,65(1):7-13.

    [9] Thompson J R, Marcelino L A, Polz M F. Heteroduplexes in mixed-template amplifications: formation, consequence and elimination by’reconditioning PCR’[J]. Nucl Acids Res, 2002,30(9):2083-2088.

    [10] Xiong X, Hu Y, Yan N,etal. PCR-DGGE analysis of the microbial communities in three different Chinese “Baiyunbian” liquor fermentation starters[J]. J Microbiol Biotechnol, 2014,24(8):1088-1095.

    [11] Muyzer G, de Waal E C, Uitterlinden A G. Profiling of complex microbial populations by denaturing gradient gel electrophoresis analysis of polymerase chain reaction-amplified genes coding for 16S rRNA[J]. Appl Environ Microbiol, 1993, 59(3):695-700.

    [12] Walter J, Tannock GW, Tilsala-Timisjarvi A,etal. Detection and identification of gastrointestinal lactobacillus species by using denaturing gradient gel electrophoresis and species-specific PCR primers[J]. Appl Environ Microbiol, 2000, 66(1):297-303.

    [13] Wu D, Hou C, Li Y,etal. Analysis of the bacterial community in chronic obstructive pulmonary disease sputum samples by denaturing gradient gel electrophoresis and real-time PCR[J]. BMC Pulm Med, 2014, 14:179.

    [14] Zhengyu Du, Tomas Hudcovic, Jakub Mrazek,etal. Development of gut inflammation in mice colonized with mucosa-associated bacteria from patients with ulcerative colitis[J]. Gut Pathog, 2015, 7: 32.

    [15] Heilig H G, Zoetendal E G, Vaughan E E,etal. Molecular diversity ofLactobacillusspp. and other lactic acid bacteria in the human intestine as determined by specific amplification of 16S ribosomal DNA[J]. Appl Environ Microbiol, 2002,68(1):114-123.

    [16] Scanlan P D, Shanahan F, O’Mahony C,etal.Culture-independent analyses of temporal variation of the dominant fecal microbiota and targeted bacterial subgroups in Crohn’s disease[J]. J Clin Microbiol, 2006, 44(11):3980-3988.

    [17] Fromin N, Hamelin J, Tarnawski S,etal. Statistical analysis of denaturing gel electrophoresis (DGE) fingerprinting patterns[J]. Environ Microbiol, 2002, 4(11):634-643.

    [18] Matsushita Y, Yamamura K, Morimoto S.etal. Analysis of variations in band positions for normalization in across-gel denaturing gradient gel electrophoresis[J]. J Microbiol Methods, 2015,112:11-20.

    [19] 陳章寶,向少能,江震獻(xiàn),等. PCR-DGGE研究微生物種群中多條帶產(chǎn)生原因分析[J]. 微生物學(xué)通報(bào), 2010, 37(1):147-154. CHEN ZHANG-Bao, XIANG SHAO-Neng, JIANG ZHEN-xian,etal. Analysis on cuses of multi-bands in researching on microbe population by PCR-DGGE[J]. Microbiol China, 2010, 37(1):147-154.

    [20] Kuar D, Avgu tin G. Optimization of the DGGE band identification method[J].Folia Microbiol (Praha), 2012,57(4):301-306.

    [21] Xu X L, Cheng T Y, Yang H,etal. Identification of intestinal bacterial flora in Rhipicephalus microplus ticks by conventional methods and PCR-DGGE analysis[J]. Exp Appl Acarol, 2015, 66(2):257-68.

    [22] Shimano S, Sambe M, Kasahara Y. Application of nested PCR-DGGE (denaturing gradient gel electrophoresis) for the analysis of ciliate communities in soils[J]. Microbes Environ, 2012, 27(2):136-41.

    [23] Ercolini D. PCR-DGGE fingerprinting: novel strategies for detection of microbes in food[J]. J Microbiol Methods, 2004, 56(3):297-314.

    [24] 劉慧杰,楊彩云,田 蘊(yùn),等. 基于PCR-DGGE技術(shù)的紅樹林區(qū)微生物群落結(jié)構(gòu)[J].微生物學(xué)報(bào),2010,50(7):923-930. LIU Hui-Jie, YANG Cai-Yun, TIAN Yun,etal. Analysis of microbial community structure in mangrove sediments by PCR-DGGE technique[J]. Acta Microbiol Sin, 2010,50(7):923-930.

    [25] 劉有勝,楊朝暉,曾光明,等. PCR-DGGE技術(shù)對(duì)城市餐廚垃圾堆肥中細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)分析[J]. 環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào), 2007, 27(7):1151-1156. LIU You-Sheng, YANG Chao-Hui, ZENG Guang-Ming.etal. Application of PCR-DGGE to analyzing bacterial communities in culinary waste corn post[J]. Acta. Sci Circumstant, 2007, 27(7):1151-1156.

    [26] 但國蓉,袁 靜,唐 歡,等. 5種醫(yī)用益生菌產(chǎn)品的微生物數(shù)量和種屬分析[J]. 中國藥房, 2006, 17(7):530-532. DAN Guo-Rong, YUAN Jing, TANG Huan,etal. Numbers and Species of Microorganisms of 5 Probiotic Products for Medicinal Purposes[J]. China Pharmacy, 2006, 17(7):530-532.

    [27] Shanqimuge, Liang H, Zhang C,etal. A DGGE marker-mediated fast monitoring of bacterial diversity and comprehensive identification of high-temperature Daqu starter[J]. J Food Sci, 2015,80(7):1519-1525.

    [28] 武望婷,何海平,閆 麗,等.首都博物館空氣中細(xì)菌的分離鑒定及在文物保護(hù)中的意義[J].文物保護(hù)與考古科學(xué),2012,24(1):76-82. WU Wang-ting,HE Hai-ping,YAN Li,etal.The isolation and identification of bacteria in the air of Capital Museum and their significance for protection of cultural relics[J].Sci Conserv Archaeol,2012,24(1):76-82.

    [29] 馬燕天,汪萬福,馬 旭,等. 敦煌莫高窟洞窟內(nèi)外空氣中微生物的對(duì)比研究[J]. 文物保護(hù)與考古科學(xué),2011, 23(1):13-18. MA Yan-Tian, WANG Wan-Fu, MA Xu,etal. The comparative study of airborne microorganisms between close cave and outside cave environments in Mogao Grottoes, Dunhuang[J]. Sci Conserv Archaeol, 2011, 23(1):13-18.

    [30] 唐 歡,范文奇,周理坤,等. 重慶中國三峽博物館臨時(shí)展廳內(nèi)空氣微生物調(diào)查檢測[J]. 中國微生態(tài)學(xué)雜志, 2014,26(4):420-424. TANG Huan, FAN Wen-Qi, ZHOU Li-Kun,etal. Investigation of airborne microbial content in the temporary exhibition halls of China Three Gorges Museum[J]. Chin J Microecol, 2014,26(4):420-424.

    [31] Tringe S G, Zhang T, Liu X,etal. The airborne metagenome in an indoor urban environment[J]. Plos One, 2008,3(4): e1862-e1862.

    [32] 王麗娜,修光利,詹天真,等. 送風(fēng)方式對(duì)文物保存展柜微環(huán)境氣流分布的影響[J]. 文物保護(hù)與考古科學(xué),2013,25(4):8-13. WANG Li-Na,XIU Guang-Li, ZHAN Tian-zhen,etal. Impact of inlet airflow pattern on the showcase microenvironment in museums[J]. Sci Conserv Archaeol,2013,25(4):8-13.

    (責(zé)任編輯 潘小倫)

    A dynamic study on the species and quantity of microorganisms in the micro-environment, Chongqing China Three Gorges Museum

    TANG Huan1, FAN Wen-qi1, WANG Chun1, ZHANG Li-long2

    (1.ChongqingChinaThreeGorgesMuseum,Chongqing400015,China; 2.Chongqingcenterfordiseasecontrolandprevention,Chongqing400042,China)

    In this study, both traditional colony counting and PCR-DGGE (PCR-Denaturing gradient gel electrophoresis) technology were used to analyze the quantity and species characteristics of microorganisms in the micro-environment, Chongqing China Three Gorges Museum. The results showed that the species and quantity of cultivable microorganism in the air of the museum micro-environment was significantly higher in summer than in winter. Species ofAcinetobacter,Staphylococcus、PseudomonasandAdvenellawere found to predominate. In addition,Acinetobactersp. andMicrococcussp. were dominant in summer whileBacillussp. predominated in winter. The results were helpful in terms of evaluating potential microbial pollution and to providing scientific evidence for preventive protection of exhibited or collected cultural relics in museums.

    Museum environment; Preventive conservation; PCR-DGGE; Air microorganisms

    2016-01-19;

    2016-07-11

    重慶中國三峽博物館項(xiàng)目資助(3GM2013-KTZ03)

    唐 歡(1979—),女,2001年畢業(yè)于西南師范大學(xué)生物教育專業(yè),副研究館員,研究方向?yàn)槲奈镂⑸锊『Ψ乐?,E-mail: tanghuan3gm@163.com

    張麗龍,E-mail: tmmulong@sina.com

    1005-1538(2017)01-0035-09

    K879.2

    A

    猜你喜歡
    泳道展廳條帶
    得分一瞬
    睿士(2023年9期)2023-09-20 05:47:07
    不斷改變,不斷進(jìn)步 參觀KEF展廳后隨筆
    BESPOKE ROMANCE展廳
    GAB展廳
    NORHOR成都展廳
    家蠶色氨酸羥化酶 (TRH) 基因的克隆及表達(dá)特性分析
    游泳池里的航母
    基于條帶模式GEOSAR-TOPS模式UAVSAR的雙基成像算法
    基于 Savitzky-Golay 加權(quán)擬合的紅外圖像非均勻性條帶校正方法
    一種基于MATLAB的聲吶條帶圖像自動(dòng)拼接算法
    海岸工程(2014年4期)2014-02-27 12:51:28
    欧美亚洲日本最大视频资源| 一级a爱视频在线免费观看| 又紧又爽又黄一区二区| 精品视频人人做人人爽| 欧美在线一区亚洲| 亚洲avbb在线观看| 黑人操中国人逼视频| 欧美 日韩 精品 国产| 日韩欧美三级三区| 十八禁人妻一区二区| 欧美中文综合在线视频| 国产精品久久久久成人av| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 国产一区二区三区在线臀色熟女 | 少妇被粗大的猛进出69影院| 午夜福利在线观看吧| 91麻豆av在线| 国产精品98久久久久久宅男小说| kizo精华| 日本av免费视频播放| 国产精品免费大片| 激情在线观看视频在线高清 | 国产精品亚洲一级av第二区| 黄色视频在线播放观看不卡| 一二三四在线观看免费中文在| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 精品少妇久久久久久888优播| 天堂8中文在线网| 啦啦啦在线免费观看视频4| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 国产成人欧美| 亚洲,欧美精品.| 亚洲一区二区三区欧美精品| 91大片在线观看| 国产精品1区2区在线观看. | 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 99精品久久久久人妻精品| 精品一区二区三区av网在线观看 | 久久精品国产亚洲av高清一级| 色婷婷av一区二区三区视频| 国产成人精品久久二区二区免费| 新久久久久国产一级毛片| 久久久国产精品麻豆| 一区在线观看完整版| 丰满迷人的少妇在线观看| 在线观看66精品国产| 国产高清激情床上av| 纵有疾风起免费观看全集完整版| tocl精华| cao死你这个sao货| 在线观看免费视频日本深夜| 中文字幕精品免费在线观看视频| 少妇 在线观看| 久久人人97超碰香蕉20202| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 搡老岳熟女国产| 另类亚洲欧美激情| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 一级片免费观看大全| 成年人黄色毛片网站| 日韩视频一区二区在线观看| 日本a在线网址| 在线av久久热| 97人妻天天添夜夜摸| 亚洲国产看品久久| 亚洲av国产av综合av卡| 久久久久久久久免费视频了| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 国产欧美亚洲国产| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 精品卡一卡二卡四卡免费| 91字幕亚洲| 性高湖久久久久久久久免费观看| 99久久精品国产亚洲精品| 亚洲av成人一区二区三| 丁香欧美五月| 久久精品成人免费网站| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 嫩草影视91久久| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 色婷婷av一区二区三区视频| 手机成人av网站| av欧美777| 亚洲精品自拍成人| 高潮久久久久久久久久久不卡| 欧美亚洲日本最大视频资源| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| av不卡在线播放| 啦啦啦免费观看视频1| 久久精品国产亚洲av高清一级| 2018国产大陆天天弄谢| 天堂俺去俺来也www色官网| 高清视频免费观看一区二区| 国产一区二区在线观看av| 久久精品国产综合久久久| 丁香六月天网| 亚洲精品自拍成人| xxxhd国产人妻xxx| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 最近最新中文字幕大全免费视频| 人人澡人人妻人| 老汉色∧v一级毛片| 国产一区二区激情短视频| 精品国产一区二区久久| www日本在线高清视频| 日韩精品免费视频一区二区三区| 黄片大片在线免费观看| 啪啪无遮挡十八禁网站| 国产精品一区二区在线不卡| 18禁观看日本| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 亚洲欧美日韩高清在线视频 | 电影成人av| 正在播放国产对白刺激| 三上悠亚av全集在线观看| 成人亚洲精品一区在线观看| 成人国产av品久久久| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 日韩中文字幕视频在线看片| 又紧又爽又黄一区二区| 国产成人精品在线电影| 亚洲国产欧美在线一区| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 成人免费观看视频高清| 2018国产大陆天天弄谢| 亚洲国产成人一精品久久久| 久久人妻熟女aⅴ| 欧美另类亚洲清纯唯美| 成人特级黄色片久久久久久久 | 欧美国产精品一级二级三级| 黄色 视频免费看| 亚洲av日韩精品久久久久久密| av片东京热男人的天堂| 久热爱精品视频在线9| 高清视频免费观看一区二区| 国产单亲对白刺激| 妹子高潮喷水视频| 国产有黄有色有爽视频| 一级片'在线观看视频| 在线观看66精品国产| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 精品人妻在线不人妻| 亚洲五月婷婷丁香| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 欧美中文综合在线视频| a级片在线免费高清观看视频| 欧美激情极品国产一区二区三区| 日韩人妻精品一区2区三区| 亚洲人成伊人成综合网2020| 国产高清国产精品国产三级| 中文字幕精品免费在线观看视频| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 久久中文看片网| 国产免费福利视频在线观看| 精品熟女少妇八av免费久了| 伦理电影免费视频| 美国免费a级毛片| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 亚洲成人国产一区在线观看| 欧美黄色淫秽网站| 蜜桃国产av成人99| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 久久国产亚洲av麻豆专区| 波多野结衣av一区二区av| 国产黄色免费在线视频| 亚洲专区字幕在线| 国产欧美日韩精品亚洲av| 国产一区二区在线观看av| 9热在线视频观看99| 国产精品二区激情视频| 国产精品亚洲av一区麻豆| 国产精品99久久99久久久不卡| 一二三四社区在线视频社区8| 亚洲免费av在线视频| 国产精品免费视频内射| 国产男女超爽视频在线观看| 天堂8中文在线网| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 黄色怎么调成土黄色| 老司机深夜福利视频在线观看| av超薄肉色丝袜交足视频| 亚洲av日韩在线播放| 久久性视频一级片| 一级毛片电影观看| 一区二区三区乱码不卡18| 日韩中文字幕欧美一区二区| 人妻一区二区av| 在线观看免费日韩欧美大片| 搡老乐熟女国产| 国产成人免费无遮挡视频| 国产精品99久久99久久久不卡| 亚洲三区欧美一区| 咕卡用的链子| 99re在线观看精品视频| 99国产精品一区二区蜜桃av | 操出白浆在线播放| 真人做人爱边吃奶动态| 乱人伦中国视频| 51午夜福利影视在线观看| 黑人猛操日本美女一级片| 一边摸一边做爽爽视频免费| 久久久精品免费免费高清| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 手机成人av网站| 深夜精品福利| 国产成人av教育| 一级毛片女人18水好多| 九色亚洲精品在线播放| 久久久欧美国产精品| 两性夫妻黄色片| 亚洲av片天天在线观看| 在线观看人妻少妇| 51午夜福利影视在线观看| 国产男女内射视频| 天堂俺去俺来也www色官网| 国产精品.久久久| 99热网站在线观看| 老司机深夜福利视频在线观看| 久热这里只有精品99| 亚洲av国产av综合av卡| 国产人伦9x9x在线观看| 国产一区二区三区视频了| 精品久久久久久久毛片微露脸| 午夜激情久久久久久久| 下体分泌物呈黄色| 亚洲久久久国产精品| 制服诱惑二区| 精品国产乱子伦一区二区三区| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 极品教师在线免费播放| 亚洲avbb在线观看| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 亚洲av美国av| 国产成人av教育| 日韩免费高清中文字幕av| 99久久99久久久精品蜜桃| 国产男靠女视频免费网站| 日韩视频一区二区在线观看| 十分钟在线观看高清视频www| 91大片在线观看| 国产成人欧美| 91成年电影在线观看| 极品人妻少妇av视频| 一本大道久久a久久精品| videos熟女内射| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 午夜成年电影在线免费观看| 午夜福利视频在线观看免费| 三级毛片av免费| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 免费观看av网站的网址| 亚洲中文日韩欧美视频| 十八禁网站网址无遮挡| 国产一区二区 视频在线| 国产在线观看jvid| 精品熟女少妇八av免费久了| 精品一区二区三区av网在线观看 | 精品亚洲乱码少妇综合久久| 国产不卡av网站在线观看| 国产精品偷伦视频观看了| 久久国产精品人妻蜜桃| 女性被躁到高潮视频| 一区福利在线观看| 中文欧美无线码| xxxhd国产人妻xxx| 免费少妇av软件| 最近最新免费中文字幕在线| 成人影院久久| 老司机在亚洲福利影院| h视频一区二区三区| 日韩欧美免费精品| 成人18禁在线播放| 岛国在线观看网站| 国产日韩欧美在线精品| 亚洲一区二区三区欧美精品| 欧美精品av麻豆av| 日韩中文字幕欧美一区二区| 女性生殖器流出的白浆| 精品少妇久久久久久888优播| 人妻 亚洲 视频| 国产成人免费观看mmmm| 午夜免费成人在线视频| 麻豆国产av国片精品| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 国产有黄有色有爽视频| 丰满少妇做爰视频| 成在线人永久免费视频| 热re99久久国产66热| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 久久国产精品人妻蜜桃| 18禁国产床啪视频网站| 国产精品 欧美亚洲| 国产一区有黄有色的免费视频| 国产成人av教育| 国产精品久久久久久精品古装| a级毛片在线看网站| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 色94色欧美一区二区| 亚洲精品久久午夜乱码| 日本精品一区二区三区蜜桃| 久久影院123| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| e午夜精品久久久久久久| 91字幕亚洲| 亚洲五月婷婷丁香| 国产亚洲一区二区精品| a在线观看视频网站| 亚洲色图av天堂| 亚洲av第一区精品v没综合| 精品高清国产在线一区| 国产三级黄色录像| 午夜福利视频精品| 一个人免费在线观看的高清视频| 午夜日韩欧美国产| 亚洲,欧美精品.| 女警被强在线播放| 午夜福利在线观看吧| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 色婷婷久久久亚洲欧美| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 免费人妻精品一区二区三区视频| 怎么达到女性高潮| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 亚洲av日韩在线播放| 亚洲情色 制服丝袜| 999久久久国产精品视频| 国产有黄有色有爽视频| 国产高清videossex| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 亚洲avbb在线观看| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 国产免费福利视频在线观看| 日本av手机在线免费观看| 丁香欧美五月| 国产精品成人在线| 亚洲精品国产区一区二| av福利片在线| 日韩免费av在线播放| 香蕉国产在线看| 一边摸一边做爽爽视频免费| 两性夫妻黄色片| 日本黄色视频三级网站网址 | 国产成人一区二区三区免费视频网站| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 99热网站在线观看| 欧美av亚洲av综合av国产av| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区 | 三级毛片av免费| 日韩免费av在线播放| 午夜精品久久久久久毛片777| 亚洲精品中文字幕在线视频| 欧美日韩福利视频一区二区| 少妇粗大呻吟视频| 免费在线观看黄色视频的| 黄色 视频免费看| 亚洲天堂av无毛| 免费在线观看影片大全网站| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 另类精品久久| 日韩有码中文字幕| 乱人伦中国视频| 亚洲伊人久久精品综合| 99久久人妻综合| 亚洲伊人久久精品综合| 久久久国产欧美日韩av| 一级片'在线观看视频| 男女无遮挡免费网站观看| 高清av免费在线| 在线观看免费视频网站a站| www.精华液| 国产av一区二区精品久久| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 一区福利在线观看| 欧美大码av| a级片在线免费高清观看视频| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 一二三四社区在线视频社区8| 一级毛片女人18水好多| 成人亚洲精品一区在线观看| 成人永久免费在线观看视频 | 在线观看www视频免费| 又大又爽又粗| 免费在线观看影片大全网站| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 丝袜喷水一区| 欧美中文综合在线视频| 国产伦理片在线播放av一区| 国产成人av激情在线播放| 久久久久精品人妻al黑| 久久久精品94久久精品| 日韩成人在线观看一区二区三区| 又大又爽又粗| 亚洲色图av天堂| 国产一区二区三区在线臀色熟女 | 午夜福利,免费看| 老司机午夜十八禁免费视频| 亚洲精品国产区一区二| 又大又爽又粗| 色婷婷久久久亚洲欧美| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| xxxhd国产人妻xxx| 国产伦理片在线播放av一区| 性少妇av在线| 蜜桃国产av成人99| 日本a在线网址| 精品卡一卡二卡四卡免费| 久久天堂一区二区三区四区| 老司机福利观看| 精品亚洲成a人片在线观看| 中文字幕人妻熟女乱码| 国产亚洲av高清不卡| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 国产成人精品久久二区二区免费| 久久天堂一区二区三区四区| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 国产亚洲精品第一综合不卡| 免费人妻精品一区二区三区视频| 国产在视频线精品| 大型av网站在线播放| 亚洲一区中文字幕在线| 最新的欧美精品一区二区| 天堂俺去俺来也www色官网| 69精品国产乱码久久久| 99国产极品粉嫩在线观看| bbb黄色大片| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 可以免费在线观看a视频的电影网站| av欧美777| 制服人妻中文乱码| 啦啦啦 在线观看视频| netflix在线观看网站| 日本a在线网址| 亚洲专区国产一区二区| 亚洲国产成人一精品久久久| 国产国语露脸激情在线看| 亚洲精品在线观看二区| 亚洲精品乱久久久久久| 在线永久观看黄色视频| 精品国产乱子伦一区二区三区| 性高湖久久久久久久久免费观看| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 久久免费观看电影| 国产精品久久久久久精品古装| 无人区码免费观看不卡 | av一本久久久久| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 国产免费视频播放在线视频| 51午夜福利影视在线观看| 黄色成人免费大全| 精品熟女少妇八av免费久了| 少妇精品久久久久久久| 成人18禁在线播放| 99国产精品免费福利视频| 亚洲av片天天在线观看| 啪啪无遮挡十八禁网站| 9热在线视频观看99| 51午夜福利影视在线观看| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 99riav亚洲国产免费| 九色亚洲精品在线播放| 久久亚洲真实| 亚洲欧美激情在线| 精品国产一区二区久久| 国产xxxxx性猛交| 最近最新中文字幕大全电影3 | 亚洲av欧美aⅴ国产| 日本黄色视频三级网站网址 | 一区二区三区乱码不卡18| 夜夜爽天天搞| 不卡一级毛片| 一本色道久久久久久精品综合| 午夜福利乱码中文字幕| 高潮久久久久久久久久久不卡| 大陆偷拍与自拍| 欧美精品亚洲一区二区| 精品国产乱码久久久久久小说| 少妇精品久久久久久久| 黑人欧美特级aaaaaa片| 黑丝袜美女国产一区| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 国产色视频综合| 精品亚洲乱码少妇综合久久| svipshipincom国产片| 成年人免费黄色播放视频| 日日夜夜操网爽| 亚洲精品粉嫩美女一区| 啦啦啦在线免费观看视频4| 久久久久久久大尺度免费视频| 岛国毛片在线播放| 搡老乐熟女国产| 考比视频在线观看| 欧美中文综合在线视频| h视频一区二区三区| 午夜久久久在线观看| 精品人妻在线不人妻| 黄色丝袜av网址大全| 1024香蕉在线观看| 青青草视频在线视频观看| 亚洲男人天堂网一区| 精品国产乱子伦一区二区三区| 国产xxxxx性猛交| 少妇的丰满在线观看| 久久久国产欧美日韩av| 99精品久久久久人妻精品| 超碰97精品在线观看| 国产色视频综合| 婷婷成人精品国产| 69精品国产乱码久久久| 12—13女人毛片做爰片一| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 五月天丁香电影| 亚洲一码二码三码区别大吗| 下体分泌物呈黄色| 亚洲国产欧美一区二区综合| av免费在线观看网站| 午夜福利在线观看吧| 欧美成人午夜精品| 中国美女看黄片| 亚洲中文字幕日韩| 成人手机av| 蜜桃国产av成人99| 中文字幕人妻熟女乱码| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 女人精品久久久久毛片| 久久天堂一区二区三区四区| 在线观看舔阴道视频| 亚洲人成电影观看| 丝袜喷水一区| 高潮久久久久久久久久久不卡| 天堂中文最新版在线下载| 国产精品久久久久久精品古装| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区 | 成人手机av| 国产亚洲精品第一综合不卡| 丰满迷人的少妇在线观看| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 在线观看www视频免费| 一本色道久久久久久精品综合| 深夜精品福利| 岛国在线观看网站| 精品熟女少妇八av免费久了| 久热这里只有精品99| 午夜日韩欧美国产| 嫁个100分男人电影在线观看| 91成人精品电影| 精品一区二区三区av网在线观看 | 午夜91福利影院| 久久久久国内视频| 丝袜喷水一区| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 天天操日日干夜夜撸| 男人舔女人的私密视频| 正在播放国产对白刺激| 日韩欧美免费精品| 国产成人欧美| 欧美中文综合在线视频| 亚洲人成77777在线视频| 国产视频一区二区在线看| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 99re6热这里在线精品视频| 色老头精品视频在线观看| 国产国语露脸激情在线看| 一进一出好大好爽视频| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 成人黄色视频免费在线看| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 在线观看免费高清a一片| 国产黄色免费在线视频| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 国产精品电影一区二区三区 | 最新美女视频免费是黄的| 国产伦人伦偷精品视频| 欧美 日韩 精品 国产| 国产精品欧美亚洲77777| 国产精品一区二区在线观看99| 亚洲三区欧美一区| 91麻豆av在线| 午夜福利免费观看在线| 激情视频va一区二区三区| 日韩中文字幕视频在线看片| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 少妇 在线观看| 首页视频小说图片口味搜索| 成年人免费黄色播放视频| 亚洲专区国产一区二区| 99香蕉大伊视频| tube8黄色片| 欧美国产精品一级二级三级| 国产高清激情床上av| 日本a在线网址| 国产人伦9x9x在线观看| 欧美日本中文国产一区发布| 亚洲午夜理论影院| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 亚洲全国av大片| 十分钟在线观看高清视频www| 久热这里只有精品99| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 满18在线观看网站| 免费在线观看影片大全网站| 国产成人欧美在线观看 | 91成人精品电影| 亚洲精品国产色婷婷电影| 国产免费现黄频在线看| 激情在线观看视频在线高清 | 最近最新中文字幕大全电影3 | 自线自在国产av| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 精品少妇黑人巨大在线播放| 不卡av一区二区三区|