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    廣東地區(qū)16336例地中海貧血初篩陽性樣本基因型分析

    2017-02-28 17:32:08周冰燚趙文忠李銘
    中國醫(yī)藥導(dǎo)報(bào) 2016年32期
    關(guān)鍵詞:廣東地區(qū)珠蛋白攜帶者

    周冰燚++++++趙文忠++++++李銘臻++++++徐珊珊++++++顧恒++++++鄭立新++++++葉小磊

    [摘要] 目的 了解廣東地區(qū)育齡人群中α、β地中海貧血(簡稱“地貧”)基因型的分布情況。 方法 收集廣東省各區(qū)縣育齡夫婦血樣,以平均紅細(xì)胞體積(MCV)≤82 fL和/或平均紅細(xì)胞血紅蛋白含量(MCH)≤27 pg作為陽性指標(biāo)進(jìn)行地貧初篩,夫婦雙方均為陽性時(shí),進(jìn)行α及β地貧基因檢測。應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)結(jié)合膜雜交法進(jìn)行地貧基因檢測,異常病例經(jīng)測序確證。 結(jié)果 共收集地貧可疑樣本16 336例,其中,地貧基因攜帶者13 068例,基因診斷陽性率為80%。檢出α-地貧8627例,其中,標(biāo)準(zhǔn)型6852例(41.94%),靜止型1529例(9.36%),Hb H病241例(1.48%)和香港型5例(0.03%)。β-地貧3788例(23.19%),α復(fù)合β地貧基因攜帶者653例(4.00%)。α地貧基因型以--SEA/αα(76.15%)最常見,其次為-α3.7/αα(10.13%)和-α4.2/αα(4.63%)。共發(fā)現(xiàn)23種β地貧基因突變型,以β41-42/β(39.59%)最常見,其次為β654/β(25.08%)及β-28/β(16.89%)。 結(jié)論 MCV聯(lián)合MCH作為地貧初篩指標(biāo)操作簡單,便于在基層應(yīng)用。PCR結(jié)合膜雜交法檢測地貧基因的靈敏度和特異性較好。對育齡夫婦進(jìn)行地貧篩查并結(jié)合基因檢測,將有助于提高出生人口素質(zhì)。

    [關(guān)鍵詞] 地中海貧血;α-地中海貧血基因型;β-地中海貧血基因型;膜雜交

    [中圖分類號] R556.71 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210(2016)11(b)-0073-05

    [Abstract] Objective To investigate the distribution of α-, β-thalassemia in couples of children bearing age in Guangdong Province. Methods The samples of newly married couples from different districts and counties of Guangdong were collected and screened. MCV≤82 fL or/and MCH≤27 pg was taken as positive screening indicator. When the screening results of both spouses were positive, genotyping for α- and β-thalassemia was performed by polymerase chain reaction (PCR) combined with membrane hybridization. Abnormal cases were confirmed by sequencing. Results A total of 16 336 cases of suspected thalassemia were identified, in which 13 068 cases were diagnosed as carriers of thalassemia gene, 80% of preliminary screening positive samples were diagnosed genetically. 8627 patients were detected with α-thalassemia, among which 6852 (41.94%) were standard α-thalassemia, 1529 cases (9.36%) were static α-thalassemia, 241 cases were Hb H disease (1.48%) and 5 cases had belong to Hong Kong thalassemia (0.03%). 3788 cases (23.19%) were β-thalassemia and 653 cases (4.00%) were carriers of both α- and β-thalassemia gene. In α-thalassemia genotype, the most common genotype was --SEA/αα, followed by -α3.7/αα, -α4.2/αα, and the constituent ratio was 76.15%, 10.13% and 4.63%, respectively. A total of 23 genotypes of β-thalassemia were found in this study, the most common mutation subtype was β41-42/β (39.59%), followed by β654/β (25.08%) and β-28/β (16.89%). Conclusion MCV combined with MCH as thalassemia screening positive indicator is convenient in basic level hospitals. Meanwhile, the sensitivity and specificity of thalassemia detection by PCR and membrane hybridization is confirmed. Thalassemia screening combination with genetic testing in couple of childbearing age, will improve the quality of birth population.

    [Key words] Thalassemia; α-thalassemia genotype; β-thalassemia genotype; Membrane hybridization method

    地中海貧血(Thalassemia),簡稱“地貧”,又稱海洋性貧血,是世界上發(fā)病率最高的遺傳性溶血性貧血,也是危害最嚴(yán)重的血紅蛋白病之一[1]。地貧發(fā)病主要集中在熱帶和亞熱帶地區(qū),好發(fā)于地中海沿岸、北非、東南亞和印度次大陸等地區(qū)[2]。而我國以長江以南的廣大地域?yàn)榈刎毟甙l(fā)區(qū),其中尤以廣西、廣東和海南三?。▍^(qū))為甚[3]。地貧為遺傳性疾病,主要為編碼人體珠蛋白基因缺失或突變,導(dǎo)致某種珠蛋白鏈合成障礙,如α珠蛋白肽鏈或β珠蛋白肽鏈合成障礙,可分別導(dǎo)致α-地貧和β-地貧[4],也有少見的δβ和γβ型地貧。地貧基因攜帶者臨床表現(xiàn)多樣[5],可表現(xiàn)正常,也可出現(xiàn)需要反復(fù)輸血的患者。對于重型患者目前尚無根治辦法,因此只能通過對婚前、孕前以及產(chǎn)檢人群和新生兒進(jìn)行血液學(xué)篩查、基因診斷等手段加以預(yù)防,尤其是對同型地貧的高風(fēng)險(xiǎn)夫婦進(jìn)行產(chǎn)前診斷,淘汰重型胎兒,是目前國際上公認(rèn)的預(yù)防地貧發(fā)生的最佳措施[6]。本研究著重對廣東地區(qū)育齡人群進(jìn)行地貧篩查并分析基因型,以進(jìn)一步明確地貧在廣東地區(qū)分子流行病學(xué)特征,為該病防控策略制訂奠定基礎(chǔ)。

    1 對象與方法

    1.1 研究對象

    2013年1月~2015年2月對參加廣東省各縣區(qū)、街道(鎮(zhèn))婚育學(xué)校新婚班的育齡夫婦進(jìn)行孕前地貧篩查,當(dāng)夫婦雙方篩查結(jié)果均為陽性時(shí),收集所有樣本。

    1.2 方法

    地貧篩查:主要由廣東省各縣區(qū)計(jì)劃生育服務(wù)站進(jìn)行,包括如珠海市計(jì)劃生育服務(wù)中心、東莞市計(jì)劃生育服務(wù)中心、中山市人口和計(jì)生服務(wù)中心等130家機(jī)構(gòu)。部分縣區(qū)委托當(dāng)?shù)蒯t(yī)院進(jìn)行。各檢測機(jī)構(gòu)技術(shù)規(guī)范要求如下:采集2~3 mL EDTA抗凝血后,行血常規(guī)測定,以平均紅細(xì)胞體積(MCV)≤82 fL[7]和/或平均紅細(xì)胞血紅蛋白含量(MCH)≤27 pg[8]作為篩查陽性指標(biāo)。夫婦雙方均為陽性時(shí),轉(zhuǎn)移血樣到采集卡上,干燥后3 d內(nèi)送至廣東省計(jì)劃生育專科醫(yī)院優(yōu)生技術(shù)中心檢測。采用潮州凱普血液基因組DNA提取試劑盒對采集卡樣本進(jìn)行DNA提取,用潮州凱普提供的α-和β-地貧基因檢測試劑盒(PCR+膜雜交法)進(jìn)行基因檢測,嚴(yán)格按說明書中步驟操作。

    1.3 地貧基因檢測結(jié)果判讀

    地貧基因反向斑點(diǎn)雜交膜條設(shè)3個(gè)α和6個(gè)β正常對照點(diǎn),可檢測3種α地貧缺失型基因(SEA、3.7、4.2)、3種突變型基因(CS、QS、WS)及15種常見β地貧突變型基因[-28(A-G)、-29(A-G)、Cap(-AAAC)、Int(T-G)、CD14/15(+G)、CD17(A-T)、βE(G-A)、CD27/28(+C)、CD31(-C)、CD41/42(-TTCT)、CD43(G-T)、CD71/72(+A)、IVS-I-1(G-T,G-A)、IVS-I-5(G-C)、IVS-II-654(C-T)]。每次實(shí)驗(yàn)所有正常對照點(diǎn)均應(yīng)顯色,突變純合子及缺失純合子除外。

    圖1為膜條上各雜交位點(diǎn)對應(yīng)圖,出現(xiàn)地貧基因突變、缺失時(shí)在相應(yīng)位置會(huì)出現(xiàn)雜交信號。圖2~5為不同類型地貧基因攜帶者的雜交圖。

    1.4 數(shù)據(jù)分析

    采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析,采用描述性統(tǒng)計(jì)方法描述地貧篩查的準(zhǔn)確率和各種基因型分布情況。

    2 結(jié)果

    2.1 地貧篩查及基因分型情況

    廣東地區(qū)育齡夫婦經(jīng)血常規(guī)篩查(MCV和MCH)疑似地貧16 336例(8168對),經(jīng)基因診斷明確13 068例,篩查陽性率為80%(13 068/16 336)。α地貧基因攜帶者9280例,其中,標(biāo)準(zhǔn)型6852例(41.94%),靜止型1529例(9.36%);β地貧基因者攜帶4441例,單純?chǔ)碌刎毣?788例(23.19%);Hb H病241例(1.48);α復(fù)合β地貧653例(4.00%);香港型地貧5例(0.03%)。見表1。

    2.2 α地貧基因突變類型及其構(gòu)成比

    受檢的16 336人中檢出α-地貧9280例,包括α復(fù)合β地貧基因攜帶者,大部分為--SEA/αα型(76.15%),其次為-α3.7/αα(10.13%)及-α4.2/αα(4.63%)。見表2。

    2.3 β地貧基因突變類型及其構(gòu)成比

    受檢16 336人中檢出β地貧4441例,包括α復(fù)合β地貧基因攜帶者,共檢出23種β地貧基因突變類型,最常見突變類型為β41-42/β(39.59%),其次為β654/β(25.08%)、β-28/β(16.89%)及β17/β(9.01%)。見表3。

    2.4 α復(fù)合β地貧基因突變類型及其構(gòu)成比

    受檢16 336人中檢出α復(fù)合β地貧基因攜帶者653例,占4.00%,以--SEA/β41-42(17.15%)最常見,其次為--SEA/β654(13.48%)及-α3.7/β41-42(11.18%)。見表4。

    3 討論

    地貧是世界上最常見且發(fā)病率最高的單基因遺傳病之一,現(xiàn)階段尚無理想治療方法,本病重在預(yù)防,產(chǎn)前篩查結(jié)合基因檢測技術(shù)是降低重癥地貧兒出生的重要手段。廣東省為地貧高發(fā)省份之一,每年新增重型和中間型地貧患兒約4000例[9]。數(shù)據(jù)顯示,廣東省人群地貧基因平均攜帶率約11%,在部分地區(qū)可高達(dá)16%~20%[1],其中α地貧和β地貧基因攜帶率分別為8.30%~8.85%[4,10]和3.36%~3.73%[10-11]。本研究以MCV≤82 fL和/或MCH≤27 pg聯(lián)合作為地貧篩查陽性的指標(biāo),在進(jìn)行地貧基因檢查的16 336例地貧疑似樣本中,基因診斷確診13 068例,篩查總陽性率為80%,敏感度和特異性較好。也有研究提示,在基層醫(yī)院中可單純將MCV作為篩查指標(biāo),陽性患者再進(jìn)行HbA2檢測,可減少患者負(fù)擔(dān),并有較高靈敏度[12]。

    α-地貧是第16號染色體短臂末端α珠蛋白基因缺陷所致,有缺失型和非缺失型兩種,中國人群以缺失型為主[13],常見東南亞型缺失(--SEA)、右側(cè)缺失(-α3.7)和左側(cè)缺失(-α4.2)。β-地貧為位于染色體11p15.5上的β-珠蛋白基因發(fā)生核苷酸的缺失、插入或置換,目前發(fā)現(xiàn)的β地貧基因突變超過200種,中國人β地貧基因突變類型有34種[14],廣東省已檢出20多種。本研究采用導(dǎo)流雜交技術(shù)和低密度基因芯片技術(shù)可同時(shí)檢測3種α-珠蛋白基因缺失、3種α-珠蛋白基因突變以及15種β-珠蛋白基因突變,突破性解決了α-地貧基因缺失無法和突變檢測兼容、無法和β-基因突變同步檢測的問題,同時(shí)也提高檢測特異性和靈敏度。本研究受檢者共16 336人,檢出α-地貧9280例,陽性率為56.8%,常見的3種類型--SEA/αα型、-α3.7/αα及-α4.2/αα占α地貧陽性對象的90.26%,與國內(nèi)同類研究結(jié)果吻合[15-17];檢出β地貧4441例,陽性率為27.19%,共檢出23種β地貧基因突變類型,常見為β41-42/β、β654/β及β-28/β,占β地貧陽性對象的81.56%,與廣東省內(nèi)同類研究結(jié)果基本吻合[18-19];檢出α復(fù)合β地貧基因攜帶者653例,篩查陽性率為4.00%,發(fā)生頻率依次為--SEA/β41-42(17.15%)、--SEA/β654(13.48%)及-α3.7/β41-42(11.18%)。說明αβ復(fù)合基因突變在廣東地區(qū)人群中的發(fā)生率較高,此類人群血液篩查的表現(xiàn)多以β地貧為主,α地貧的表現(xiàn)被掩蓋[20],臨床易漏診,故對于疑似β地貧者,應(yīng)同時(shí)進(jìn)行α地貧和β地貧基因檢測,以防漏診。

    本研究涉及檢測樣本量大,時(shí)間跨度長,采樣點(diǎn)多達(dá)130個(gè),采樣具有一定的普遍意義。結(jié)果較好的反映出廣東地區(qū)地貧基因分子流行學(xué)現(xiàn)狀,對降低本地區(qū)地貧發(fā)生率有一定的指導(dǎo)意義。

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