艾司洛爾對(duì)福爾馬林炎性大鼠脊髓背角pERK表達(dá)的影響

陳燁　鄒聰華　鄭曉春

【摘要】 目的：探討鞘內(nèi)注射艾司洛爾對(duì)福爾馬林炎性大鼠脊髓背角pERK蛋白表達(dá)的影響。方法：36只SD大鼠鞘內(nèi)置管后，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為生理鹽水組（N組）、艾司洛爾注射液400 μg/kg組（S1組）、艾司洛爾注射液800 μg/kg組（S2組），各12只。鞘內(nèi)置管5 d后，各組注射以上藥物，然后在大鼠后肢皮下注射福爾馬林50 μL，以Vonfrey及Hargreaves法測(cè)定機(jī)械縮足反射閾值（MWT）和熱刺激縮足反射潛伏期（TWL），觀察大鼠的疼痛行為學(xué)變化。觀察1.5 h后，采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)脊髓背角pERK蛋白表達(dá)。結(jié)果：與N組相比，S1、S2組的Ⅱ相階段的疼痛行為均有減少，且S1、S2組L4～5節(jié)段脊髓表達(dá)的pERK蛋白表達(dá)均比N組少（P<0.01）。結(jié)論：鞘內(nèi)注射艾司洛爾可減少福爾馬林大鼠脊髓背角pERK蛋白表達(dá)。

【關(guān)鍵詞】 疼痛； 脊髓； 艾司洛爾； pERK

腎上腺素受體分布于大部分交感神經(jīng)節(jié)后纖維所支配的效應(yīng)器細(xì)胞膜上，其受體分為3種類型，即β1受體、β2受體和β3受體。β1受體主要分布于心肌，可激動(dòng)引起心率和心肌收縮力增加，其代表為艾司洛爾，近幾年廣泛應(yīng)用于臨床。文獻(xiàn)[1-4]研究發(fā)現(xiàn)該阻滯藥可減少麻醉維持藥物的用量，而靜脈注射艾司洛爾可減少丙泊芬的注射痛[5]。但β1受體阻滯藥艾司洛爾是否具有調(diào)節(jié)疼痛的作用仍未闡明。細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是促分裂素原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中最具代表性的通路，ERK信號(hào)通路的調(diào)節(jié)是治療糖尿病神經(jīng)病理性痛的新靶點(diǎn)[6]。轉(zhuǎn)錄因子環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（CREB）是ERK信號(hào)通路最重要的下游信號(hào)蛋白，p-ERK可從胞漿轉(zhuǎn)位到核內(nèi)通過磷酸化CREB發(fā)揮其對(duì)靶基因表達(dá)的調(diào)節(jié)作用[7]。本研究擬通過鞘內(nèi)注射艾司洛爾，觀察大鼠脊髓背角COX-2 mRNA表達(dá)的變化，來探索艾司洛爾是否具有疼痛調(diào)節(jié)作用，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 Microspianl導(dǎo)管（美國(guó)ALZA公司），艾司洛爾注射液（江蘇奧賽康醫(yī)藥公司，批號(hào)20150213），5%福爾馬林（NS 3.2 mL+37%福爾馬林0.5 mL），Real time PCR儀（TAKARA公司，日本），MMLV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，PCR試劑盒（Invitrogen Life公司，美國(guó)），兔抗鼠pERK一抗（4370S，Cell Signaling，USA），羊抗兔生物素化二抗（BA1003，武漢博士德生物工程有限公司），DAB顯色試劑盒（AR1022，武漢博士德生物工程有限公司）。

1.2 動(dòng)物選擇及鞘內(nèi)置管 SD雄性大鼠，由福建醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，體重260～290 g。用10%水合氯醛350 mg/kg腹腔注射，參照文獻(xiàn)[8]的方法，鞘內(nèi)置管。置管隔天行注射2%利多卡因?qū)嶒?yàn)，未出現(xiàn)雙下肢無力的大鼠剔除。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組 將置管成功的大鼠隨機(jī)分為三組，各12只。生理鹽水組（N組），艾司洛爾注射液400 μg/kg組（S1組），艾司洛爾注射液800 μg/kg組（S2組）。置管5 d后，大鼠注射各組藥物后在同側(cè)足掌皮下注射5%福爾馬林50 μL。

1.4 行為學(xué)觀察 以文獻(xiàn)[9]的Vonfrey細(xì)絲法和文獻(xiàn)[10]的Hargreaves法測(cè)定機(jī)械縮足反射閾值（MWT）和熱刺激縮足反射潛伏期（TWL），觀察大鼠術(shù)后1.5 h的疼痛行為學(xué)變化。Von法是用Von Frey絲刺激大鼠注射處旁，逐漸加壓至大鼠出現(xiàn)抬腿、添足行為，記錄壓力值。Hargareaves法是熱痛刺激儀照射大鼠足底，至出現(xiàn)回避。每只大鼠測(cè)定5次，每次間隔3 min，取平均值。

1.5 免疫組化方法 注射甲醛1.5 h后，各大鼠均在注射福爾馬林后1.5 h斷頭處死，剪開脊柱肌肉及椎板，暴露脊髓和L5神經(jīng)節(jié)，截取L4～5段脊髓，置于甲醛固定液中固定后石蠟包埋切片，切片經(jīng)抗原修復(fù)、封閉非特異抗原、一抗兔抗Fos血清（1∶50）、二抗羊抗兔IgG血清及DAB呈色處理后，蘇木素復(fù)染，透明、封片。采用LEICA Qwin圖像處理與分析系統(tǒng)對(duì)免疫組織化學(xué)染色的切片進(jìn)行圖像分析，每張圖像選用積分光密度（integrated optical density，IOD）來表示pERK陽性反應(yīng)產(chǎn)物的量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，Levene法檢測(cè)各組樣本方差齊性。方差齊時(shí)，各組pERK相對(duì)蛋白濃度采用Friedman ANOVA方差分析，pERK的IOD值的組間采用One-way ANOVA方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義時(shí)用LSD法比較；方差不齊時(shí)，采用多因素方差分析，pERK的IOD值的組間比較采用Kruskal-Walllis秩和檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

N組、S1組、S2組注射甲醛后出現(xiàn)疼痛反應(yīng)，表現(xiàn)為注射足只能稍受力或不能受力，抬起甚至舔咬注射足?？捎^察到完整的雙相疼痛反應(yīng)，即注射后即刻出現(xiàn)3～5 min的急性疼痛時(shí)相（第一時(shí)相），中間5～10 min的靜息期，隨后出現(xiàn)可持續(xù)40～60 min的繼發(fā)性疼痛時(shí)相（第二時(shí)相），靜息期注射足可正常行走，無明顯疼痛反應(yīng)。注射福爾馬林后各組大鼠均出現(xiàn)疼痛行為，與N組相比，S1、S2組MWT均減低，TWL縮短，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），見表1。與Ⅱ相N組IOD值（88.35±4.83）比較，S1、S2組大鼠脊髓背角pERK蛋白表達(dá)均變少，IOD值為（41.85±3.92）、（22.23±2.62）均下降（P<0.01），見圖1。

3 討論

急慢炎性疼痛實(shí)驗(yàn)中，福爾馬林實(shí)驗(yàn)是具有代表性的模型[11]，它廣泛應(yīng)用于疼痛相關(guān)機(jī)制及止痛藥的評(píng)價(jià)。有研究表明，大鼠后足注射福爾馬林后即可出現(xiàn)2個(gè)疼痛機(jī)制不同的反應(yīng)時(shí)相：Ⅰ相（5～10 min）是福爾馬林直接刺激外周傷害感受器所致；Ⅱ相（15～50 min）是主要是由于中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元興奮性增加而導(dǎo)致中樞敏化有關(guān)[12-13]。本研究中N組大鼠足底注射福爾馬林后，大鼠出現(xiàn)明顯的兩相疼痛反應(yīng)，表明大鼠出現(xiàn)了炎性疼痛及痛覺過敏，Ⅱ相生理鹽水組的時(shí)間顯著高于艾司洛爾組，提示艾司洛爾能抑制炎性反應(yīng)所導(dǎo)致的第二期的疼痛中樞敏感化，這可能與艾司洛爾抑制交感神經(jīng)有關(guān)。endprint

絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinases，MAPK）是細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要系統(tǒng)，它被激活后可維持疼痛敏化狀態(tài)[14-15]，其中細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）是MAPK的重要成員，激活后的ERK可通過磷酸化神經(jīng)元膜離子通道或受體，改變神經(jīng)元的興奮性。例如，傷害性刺激通過ERK信號(hào)通路激活NR1受體，誘導(dǎo)中樞敏化。ERK信號(hào)通路還參與緩激肽誘導(dǎo)脊髓第2板層神經(jīng)元NMDA受體和AMPA受體電流增強(qiáng)，誘發(fā)痛覺過敏[16-17]。本研究中福爾馬林致炎后的大鼠脊髓背角均可見高表達(dá)的pERK，說明存在傷害性刺激的持續(xù)性傳入。

本研究表明，艾司洛爾呈劑量依賴地減少福爾馬林炎性大鼠Ⅱ相的疼痛行為，并且抑制了脊髓背角pERK蛋白表達(dá)。Mizobuchi等[18]發(fā)現(xiàn)蘭地洛爾可減少福爾馬林炎性大鼠脊髓c-fos mRNA表達(dá)，也表明了β1受體阻滯劑具有減少炎性疼痛的作用。文獻(xiàn)[19-20]研究發(fā)現(xiàn)，β1受體阻滯劑阻滯感覺神經(jīng)中的河豚毒素相關(guān)的Na+離子通道，β-受體阻滯劑能激活游離細(xì)胞膜上的G-蛋白，產(chǎn)生突觸后或突觸前抑制，減少神經(jīng)介質(zhì)的釋放，提示β-受體阻滯劑對(duì)疼痛有中樞抑制作用，雖然艾司洛爾脂溶性低、在血液中被快速代謝，但并不排除其具有中樞作用的可能性。本研究采用置管給藥，理論上存在局部吸入血引起全身效應(yīng)，但艾司洛爾是超短效藥，不可能持續(xù)存在幾個(gè)小時(shí)的鎮(zhèn)痛作用，所以推斷艾司洛爾在脊髓水平參與了疼痛的調(diào)節(jié)。雖然鞘內(nèi)單獨(dú)應(yīng)用艾司洛爾的鎮(zhèn)痛效應(yīng)不足以完全逆轉(zhuǎn)痛行為，但其獨(dú)特的抗損傷效應(yīng)和累積的鎮(zhèn)痛效應(yīng)，可能使其成為新的鞘內(nèi)鎮(zhèn)痛的輔助用藥。由于國(guó)內(nèi)外對(duì)艾司洛爾調(diào)節(jié)疼痛研究少，其機(jī)制仍需進(jìn)一步研究并闡明。

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（收稿日期：2016-08-04） （本文編輯：張爽）endprint