結(jié)縷草ZjCSD基因的克隆及表達(dá)分析

張雪，孫鑫博，樊波，張胤冰，韓烈保，許立新*

(1.北京林業(yè)大學(xué)草坪研究所，北京 100083；2.河北省作物生長(zhǎng)調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北農(nóng)業(yè)大學(xué)，河北 保定 071001)

結(jié)縷草ZjCSD基因的克隆及表達(dá)分析

張雪1，孫鑫博2，樊波1，張胤冰1，韓烈保1，許立新1*

(1.北京林業(yè)大學(xué)草坪研究所，北京 100083；2.河北省作物生長(zhǎng)調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北農(nóng)業(yè)大學(xué)，河北 保定 071001)

銅鋅超氧化物歧化酶是植物響應(yīng)逆境脅迫過(guò)程中的關(guān)鍵酶，其含量和活性與植物抗逆性密切相關(guān)。本研究以結(jié)縷草cDNA為模板，利用同源克隆法，從結(jié)縷草轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中克隆獲得了結(jié)縷草ZjCSD基因，該基因編碼一個(gè)含有152個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示：ZjCSD基因編碼蛋白為穩(wěn)定的、親水的、酸性、非分泌脂溶蛋白，定位于細(xì)胞質(zhì)中，含有CSD蛋白家族特有的保守結(jié)構(gòu)域，具有典型的Cu2+和Zn2+結(jié)合位點(diǎn)；與小米、玉米等禾本科植物具有較高的同源性，進(jìn)化關(guān)系較近。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR研究該基因在不同組織中、不同脅迫處理下的表達(dá)模式，結(jié)果表明,ZjCSD基因在根、莖、葉中都有表達(dá)，葉中表達(dá)量最高；干旱脅迫(30% PEG)、鹽脅迫(150 mmol/L NaCl)和Cd2+脅迫(200 mg/L Cd2+)均能誘導(dǎo)ZjCSD基因表達(dá)量上調(diào)，Pb2+脅迫(1 g/L Pb2+)誘導(dǎo)ZjCSD基因表達(dá)量下調(diào)。故推測(cè)結(jié)縷草ZjCSD基因在結(jié)縷草應(yīng)對(duì)干旱、鹽和重金屬脅迫的過(guò)程中發(fā)揮作用。

結(jié)縷草；CSD；生物信息學(xué)；逆境脅迫；實(shí)時(shí)熒光定量PCR

植物在正常生命活動(dòng)中會(huì)產(chǎn)生較低水平的活性氧(reactive oxygen species，ROS)，ROS是細(xì)胞中重要的信號(hào)傳導(dǎo)分子，參與激素傳導(dǎo)、生物和非生物脅迫應(yīng)答及植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程的調(diào)控等[1]。然而在干旱、極端氣溫、重金屬污染和鹽害等逆境脅迫下，細(xì)胞中會(huì)積累過(guò)量的ROS，對(duì)脂質(zhì)、核酸和蛋白質(zhì)造成氧化損傷，進(jìn)而引起代謝異常和生物膜結(jié)構(gòu)功能損壞等[2]。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、過(guò)氧化氫酶(catalase，CAT)、抗壞血酸過(guò)氧化物酶(ascorbate peroxidase，APX)、單脫氫抗壞血酸還原酶(monodehydroascorbate reductase，MDHAR)、脫氫抗壞血酸還原酶(dehydroascorbate reductase，DHAR)、谷胱甘肽還原酶(glutathione reductase，GR)等抗氧化酶的協(xié)同作用能夠清除過(guò)量的ROS，保護(hù)植物細(xì)胞免受損傷[3]。其中，SOD能夠催化超氧陰離子自由基發(fā)生歧化反應(yīng)，是防御ROS的第一道防線。SOD是一種幾乎存在于所有需氧生物的金屬酶，根據(jù)活性中心所含金屬輔基的不同分為Mn-SODs、Cu/Zn-SODs、Fe-SODs、Co-SODs和Ni-SODs等類型[4]。高等植物主要含有Mn-SODs、Cu/Zn-SODs、Fe-SODs三類。其中，Cu/Zn-SOD(CSD)在植物體內(nèi)含量最豐富，主要在細(xì)胞質(zhì)、葉綠體、細(xì)胞核中發(fā)揮作用。

大量研究表明，在逆境脅迫下，植物能夠通過(guò)提高體內(nèi)SOD的表達(dá)量來(lái)增強(qiáng)抗逆性。如曲亞楠等[5]報(bào)道在高溫和干旱脅迫下，匍匐翦股穎(Agrostisstolonifera)體內(nèi)SOD等抗氧化酶的活性較對(duì)照植株顯著上升；樊瑞蘋等[6]研究表明高羊茅(Festucaarundinacea)在鹽脅迫時(shí)，體內(nèi)SOD活性明顯高于對(duì)照植株。由玉米(Zeamays)、煙草(Nicotianatabacum)、水稻(Oryzasativa)等植物中克隆獲得的SOD基因，通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)轉(zhuǎn)化不同的受體植物，得到SOD酶活增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因植株，進(jìn)一步驗(yàn)證了SOD與植物抗逆性密切相關(guān)。如Xu等[7]報(bào)道，過(guò)表達(dá)CSD和APX基因的木薯(Manihotesculenta)在凍害下葉片萎蔫程度明顯小于對(duì)照植株，且SOD含量是對(duì)照植株的1.5倍；張海娜等[8]研究表明過(guò)表達(dá)小麥(Triticumaestivum)CSD的煙草相比對(duì)照植株對(duì)鹽脅迫的耐性更強(qiáng)。

結(jié)縷草(Zoysiajaponica)隸屬禾本科畫眉草亞科結(jié)縷草屬，抗逆性較強(qiáng)，具有較高的坪用價(jià)值，因而廣泛應(yīng)用于城市綠地、運(yùn)動(dòng)場(chǎng)草坪、水土保持及道路護(hù)坡等方面。目前，CSD基因已從多種植物中克隆獲得并進(jìn)行了表達(dá)分析和功能驗(yàn)證，但關(guān)于結(jié)縷草CSD基因的克隆及表達(dá)模式還未見(jiàn)詳細(xì)報(bào)道。本研究通過(guò)同源克隆獲得了結(jié)縷草CSD基因，利用生物信息學(xué)方法分析其序列特性，并采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)了其在多種逆境脅迫下的表達(dá)模式。對(duì)結(jié)縷草CSD基因的研究有利于進(jìn)一步了解CSD基因在植物應(yīng)對(duì)逆境脅迫過(guò)程中的功能，同時(shí)為草坪草抗逆育種的分子機(jī)理研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料的培養(yǎng)及處理

以結(jié)縷草品種‘Zenith’為材料，播種于直徑20 cm的花盆中，培養(yǎng)基質(zhì)為沙土、草炭和蛭石(1∶1∶1)，在溫度30/25 ℃(晝/夜)、光照強(qiáng)度80 μmol/(m2·s)、光周期16/8 h(光/暗)、相對(duì)濕度65%的環(huán)境中培養(yǎng)，期間進(jìn)行正常的養(yǎng)護(hù)管理。出苗后8周左右分別用150 mmol/L NaCl、30% PEG、200 mg/L Cd2+、1 g/L Pb2+處理材料，處理后分別于0、2、4、8、12、24和48 h取結(jié)縷草葉片，用于不同脅迫下的表達(dá)分析，每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)。取未經(jīng)任何處理的結(jié)縷草植株的根、莖和葉，用于不同組織的表達(dá)分析，重復(fù)3次。取樣后立即將樣品置于-80 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄

采用Trizol總RNA提取試劑盒(Invirogen，美國(guó))提取結(jié)縷草各組織總RNA，用Nanodrop 2000檢測(cè)濃度及純度，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)完整性。采用5×All-In-One MasterMix(with AccuRT Genomic DNA Removal Kit)試劑盒(abm，加拿大)去除基因組DNA，并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。儲(chǔ)存于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成

通過(guò)local blast檢索結(jié)縷草轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得與擬南芥銅鋅超氧化物歧化酶基因AtCSD(AT1G08830)同源性最高的基因，轉(zhuǎn)錄組序列號(hào)為comp215676_c0，該基因是一段長(zhǎng)度為928 bp的cDNA序列。將該基因與親緣關(guān)系較近的禾本科模式植物玉米和水稻的CSD基因序列(分別為NM_001320832、D01000)進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn)它們具有很高相似度。利用BioXM 2.6軟件分析結(jié)縷草comp215676_c0基因序列，發(fā)現(xiàn)其含有一個(gè)長(zhǎng)度為459 bp的開(kāi)放閱讀框(ORF)，根據(jù)ORF序列設(shè)計(jì)特異性引物，上游引物CSD-F：5′-ATGGGGAAAGCTGTCGCTGT-3′，下游引物CSD-R：5′-ACCCTGGAGCCCAATGATCC-3′，以結(jié)縷草cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，目的片段大小459 bp。根據(jù)該ORF序列，利用在線工具IDT(http://sg.idtdna.com/Primerquest/Home/Index)設(shè)計(jì)熒光定量PCR所用特異性引物，上游引物CSD-qF：5′-CGGAAGATGAGAACCGCCAT-3′，下游引物CSD-qR：5′-TCCAATGATCGAGTGCGGTC-3′，目的片段大小為82 bp；內(nèi)參基因根據(jù)ZjActin基因序列設(shè)計(jì)特異性引物ZjActin-F：5′-GCTCAGTCCAAGAGAGGTATTC-3′和ZjActin-R：5′-TGATGCCAGATCTTCTCCATATC-3′。引物由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成。

1.4 目的基因克隆

以結(jié)縷草cDNA為模板，對(duì)目的基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為：rTaq酶0.5 μL，dNTP 1 μL，cDNA模板2 μL，10 μmol/L上下游引物各0.5 μL，10×buffer 2 μL，滅菌超純水13.5 μL補(bǔ)齊至20 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸10 min；4 ℃保存。

PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離后，用柱式瓊脂糖凝膠回收試劑盒(OMEGA，美國(guó))對(duì)目的片段進(jìn)行回收純化，與pT-Easy載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)藍(lán)白斑篩選和菌液PCR驗(yàn)證插入片段，選取有目的條帶的菌液樣品送至北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司測(cè)序，采用Sequencher軟件進(jìn)行序列分析。

1.5 生物信息學(xué)分析

本研究使用的主要生物信息學(xué)分析工具如下：利用ExPASy Protparam分析蛋白質(zhì)的基本理化性質(zhì)(http://web.expasy.org/protparam)；利用SignalP 4.1 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)和TargetP(http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)N-末端信號(hào)肽和亞細(xì)胞定位情況；利用TMHMM 2.0預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)跨膜區(qū)段(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM)；利用ExPASy工具中的SOPMA軟件預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)；利用DNAMAN軟件進(jìn)行多序列比對(duì)，并結(jié)合MEGA 5.0軟件(Neighbor-Joining，NJ，鄰位相連法)構(gòu)建氨基酸序列的分子系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。利用miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.mirbase.org/)預(yù)測(cè)ZjCSD基因上游的miRNA。

1.6 基因表達(dá)分析

采用CFX96型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(BIO-RAD公司)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為：cDNA模板3 μL，10 μmol/L上下游引物各0.5 μL，2×TransStart Green qPCR SuperMix UDG(abm，加拿大)10 μL，滅菌超純水6 μL補(bǔ)齊至20 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?0 ℃ 2 min，94 ℃10 min，94 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。根據(jù)gene expression值進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 結(jié)縷草ZjCSD基因的克隆與序列分析

以結(jié)縷草cDNA為模板，CSD-F和CSD-R為引物擴(kuò)增目的基因。所得目的片段大小與預(yù)測(cè)大小基本一致，擴(kuò)增片段經(jīng)切膠回收后連接至克隆載體測(cè)序，測(cè)序結(jié)果通過(guò)Sequencher軟件與預(yù)測(cè)序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示擴(kuò)增片段序列與預(yù)測(cè)序列完全一致。該基因ORF長(zhǎng)459 bp，編碼152個(gè)氨基酸(圖1)，利用NCBI Conserved Domains Search分析其編碼的氨基酸序列，結(jié)果表明該基因編碼的蛋白質(zhì)含有CSD家族基因的保守結(jié)構(gòu)域，屬于CSD超級(jí)家族，具有典型的Cu2+和Zn2+結(jié)合位點(diǎn)(圖2)，因此認(rèn)為該基因是CSD同源基因，命名為ZjCSD，并將該基因在GenBank中登記注冊(cè)(accession No. KX925930)。

2.2 結(jié)縷草ZjCSD蛋白特性分析

利用在線工具Prot param預(yù)測(cè)ZjCSD蛋白的基本理化性質(zhì)，結(jié)果表明ZjCSD蛋白相對(duì)分子量為15.0836 kD，蛋白分子式為C644H1029N197O216S3，總原子數(shù)為2089，蛋白負(fù)電荷殘基(Asp+Glu)總數(shù)15，正電荷殘基(Arg+Lys)總數(shù)為9，理論等電點(diǎn)5.76；由18種氨基酸組成，其中Gly占19.7%，比例最高；該蛋白N末端為Met，半衰期為30 h，蛋白質(zhì)不穩(wěn)定指數(shù)(instability index)為14.50(穩(wěn)定系數(shù)>40時(shí)不穩(wěn)定)，脂溶指數(shù)(aliphatic index)為77.63，總平均疏水指數(shù)(grand average of hydropathicity，GRAVY)為-0.257，因此推測(cè)該蛋白是穩(wěn)定的、酸性、親水脂溶蛋白。

利用TMHMM 2.0在線工具預(yù)測(cè)ZjCSD蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域，結(jié)果表明ZjCSD蛋白無(wú)跨膜螺旋，整條肽鏈都位于膜外；利用在線工具SignalP 4.1對(duì)ZjCSD蛋白的信號(hào)肽進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示ZjCSD蛋白N端不含信號(hào)肽，為非分泌蛋白；利用TargetP 1.1對(duì)ZjCSD蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)，結(jié)果表明ZjCSD蛋白位于細(xì)胞質(zhì)中。綜上推測(cè)ZjCSD蛋白是位于細(xì)胞質(zhì)中的非分泌蛋白，合成后不進(jìn)行蛋白質(zhì)的外運(yùn)。

用在線工具SOPMA對(duì)結(jié)縷草ZjCSD蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示該蛋白包含51.32%無(wú)規(guī)則卷曲(random coil)、31.58%延伸鏈(extended strand)、4.61%α-螺旋(alpha helix)和12.5%β-轉(zhuǎn)角(beta turn)，由此可見(jiàn)ZjCSD蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)中無(wú)規(guī)則卷曲和片層結(jié)構(gòu)占大部分。

圖1 ZjCSD cDNA的核苷酸序列及編碼的氨基酸Fig.1 Nucleotide sequence and deduced amino-acid of ZjCSD 雙下劃線表示起始密碼子和終止密碼子。Double underline denotes the initiation codon and the termination codon.

圖2 ZjCSD蛋白的保守結(jié)構(gòu)域Fig.2 Putative conserved domains of ZjCSD

2.3 結(jié)縷草ZjCSD的氨基酸同源性和系統(tǒng)進(jìn)化分析

將結(jié)縷草ZjCSD基因編碼的氨基酸序列在NCBI中進(jìn)行Blast相似性分析，并用DNAMAN軟件進(jìn)行序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)ZjCSD與其他多種植物的CSD氨基酸序列存在較高相似性，其中，與玉米CSD相似性達(dá)91%，與二穗短柄草、獐茅、歐洲大葉楊等相似性在85%～89%。此外，氨基酸序列的不同區(qū)段保守程度不同，N端序列同源性程度低于C端序列，C端序列較N端序列保守性更高(圖3)。

圖3 ZjCSD與其他物種相似蛋白的多重比較Fig.3 Multiple sequence alignment of ZjCSD and CSD from other species

結(jié)合同源性分析結(jié)果，利用MEGA 5.0軟件，采用鄰近相接法(Neighbor-Joining)，bootstrap驗(yàn)證重復(fù)1000次，構(gòu)建結(jié)縷草、玉米、小米等16個(gè)物種CSD氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖4)。結(jié)果顯示，日本結(jié)縷草CSD蛋白與小米、玉米等禾本科植物的CSD蛋白遺傳距離較近，聚為一類，而同屬百合科植物的宮燈百合和大蒜聚為一類，同屬茄科植物的番茄和馬鈴薯聚為一類，同屬十字花科植物的蘿卜和擬南芥聚為一類，同屬豆科植物的蔓花生和落花生聚為一類，同屬楊柳科植物的歐洲大葉楊和胡楊聚為一類，由此可見(jiàn)不同植物CSD蛋白的進(jìn)化關(guān)系具有明顯的種屬特征。

2.4 結(jié)縷草ZjCSD基因上游miRNA預(yù)測(cè)

在miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.mirbase.org/)中，將ZjCSD基因序列與miRNA進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果表明，ZjCSD基因5′-UTR第152～172位堿基中的18個(gè)堿基，與擬南芥、水稻、大豆(Glycinemax)、歐洲大葉楊、葡萄(Vitisvinifera)等多種植物miR398中含有的同源序列5′-acacaagaguccaguggggaa-3′重疊(圖5)。并且，已有報(bào)道證明了在擬南芥[9]、水稻[10]等多種植物中CSD基因是miR398的靶基因之一，因此推測(cè)結(jié)縷草中miR398也可能與ZjCSD基因存在相互作用，作用位點(diǎn)位于ZjCSD基因的5′-UTR。

圖4 ZjCSD蛋白與其他物種CSD蛋白氨基酸的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析Fig.4 Phylogenetic tree of ZjCSD and CSD from other species節(jié)點(diǎn)處的數(shù)字表示bootstrap驗(yàn)證重復(fù)1000次該節(jié)點(diǎn)可信度的百分比。 The number on the brunch represents the reliability percent of bootstrap value based on 1000 replications.

圖5 ZjCSD與其他物種miR398作用位點(diǎn)Fig.5 The action site between ZjCSD and miR398 from other species

2.5 結(jié)縷草ZjCSD基因表達(dá)分析

對(duì)結(jié)縷草植株的不同組織進(jìn)行熒光定量RT-PCR分析，結(jié)果顯示，ZjCSD基因在結(jié)縷草的根、莖、葉中均有表達(dá)，但表達(dá)量存在差異(圖6)。葉中表達(dá)量最高，約為莖的4倍，根中表達(dá)量最低，約為莖的0.7倍。采用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR分析結(jié)縷草葉片中ZjCSD基因在不同脅迫下的表達(dá)，結(jié)果顯示(圖7)：在PEG(A)處理2～48 h條件下，ZjCSD基因的表達(dá)量在2 h時(shí)開(kāi)始上升，在4 h時(shí)達(dá)到最大值 ，約為0 h表達(dá)量的4.0～4.5倍；8～12 h表達(dá)量有所下降，為0 h表達(dá)量的2倍左右，24 h后表達(dá)量恢復(fù)為0 h水平。在NaCl(B)處理?xiàng)l件下，ZjCSD基因的表達(dá)量在4 h時(shí)迅速升高并達(dá)到最大值，約為0 h后表達(dá)量的10.5～11.0倍，8 h后表達(dá)量下降，24 h時(shí)恢復(fù)為0 h水平。在Cd2+(C)處理?xiàng)l件下，ZjCSD基因的表達(dá)量也呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，4 h時(shí)表達(dá)量達(dá)到最大值，大約是對(duì)照(0 h)的3.0～3.5倍，8 h后表達(dá)量下降，但仍高于0 h水平。在Pb2+(D)處理?xiàng)l件下，ZjCSD基因的表達(dá)量在2～8 h下調(diào)，12 h時(shí)恢復(fù)為0 h水平，24 h表達(dá)量下降，48 h表達(dá)量又恢復(fù)至0 h水平，總體表達(dá)量均低于或基本持平于對(duì)照。

圖6 ZjCSD基因的組織特異性表達(dá)Fig.6 Tissue-specific expression of ZjCSD

圖7 不同脅迫下ZjCSD基因在結(jié)縷草葉片中的表達(dá)Fig.7 The expression of ZjCSD in leaf under different stresses A：干旱(PEG)脅迫Drought stress；B：鹽(NaCl)脅迫Salt stress；C：Cd2+脅迫Cd2+ treatment；D：Pb2+脅迫Pb2+ treatment.

3 討論

本研究從結(jié)縷草轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中克隆獲得了結(jié)縷草銅鋅超氧化物歧化酶基因ZjCSD，利用生物信息學(xué)軟件對(duì)該基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)分析后，發(fā)現(xiàn)其含有CSD基因家族特有的高度保守的金屬離子結(jié)合區(qū)， Cu2+與His45、His47、His62、His119 位相結(jié)合，Zn2+與His62、His70、His79、Asp82 位相結(jié)合；C端序列較N端序列保守性更高，驗(yàn)證了Lee等[11]提出的CSD蛋白抵抗外界氧化脅迫的主要功能區(qū)域或結(jié)構(gòu)區(qū)域位于C端的推斷。

miRNA是一類較短的內(nèi)源非編碼RNA，通過(guò)降解mRNA或翻譯抑制在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá)。在植物脅迫響應(yīng)過(guò)程中扮演重要角色[12]。miR398是近期在擬南芥、水稻、苜蓿(Medicagotruncatula)等多種植物中發(fā)現(xiàn)的響應(yīng)多種生物和非生物脅迫的miRNAs之一，包括銅缺乏[13]、ABA脅迫和鹽脅迫[14]、紫外線脅迫[15]、氧化脅迫等[16]。在擬南芥中，miR398靶向胞質(zhì)CSD1和質(zhì)體CSD2基因，還靶向COX5b-1和CCS1基因。植物的miRNA靶位點(diǎn)主要位于mRNA的蛋白編碼區(qū)[17]。miR398與CSD2和CCS1的互補(bǔ)位點(diǎn)位于mRNA的編碼區(qū)[9,18]，但與CSD1和COX5b-1的互補(bǔ)位點(diǎn)位于5′-UTR[19]。本研究通過(guò)生物信息學(xué)分析，首先預(yù)測(cè)了ZjCSD基因定位于細(xì)胞質(zhì)中，隨后預(yù)測(cè)了ZjCSD上游的miRNA之一是miR398，且兩者互作位點(diǎn)位于ZjCSD基因的5′-UTR。通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)得到的結(jié)論與擬南芥中結(jié)論相似，因此推測(cè)結(jié)縷草miR398也能調(diào)控ZjCSD的表達(dá)，但仍需進(jìn)一步通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

干旱、鹽害和重金屬等逆境脅迫誘導(dǎo)植物體內(nèi)活性氧的積累，造成植物氧化損傷。SOD作為抗氧化酶系統(tǒng)的第一道防線，能夠清除過(guò)多的活性氧，在植物抵御氧化損傷中發(fā)揮重要作用。許立新[20]在對(duì)草地早熟禾(Poapratensis)干旱及干旱后復(fù)水恢復(fù)機(jī)理的研究中發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫下，CSD基因的表達(dá)量顯著提高，且抗旱性較強(qiáng)的品種相比抗旱性較弱的品種CSD基因的表達(dá)水平更高，類似的結(jié)論在白三葉(Trifoliumrepens)中也得到了驗(yàn)證[21]。鹽脅迫能夠誘導(dǎo)CSD基因的轉(zhuǎn)錄水平提高已在包括煙草[22]、百脈根(Lotuscorniculatus)[23]、秋茄(Solanummelongena)[24]等多種植物中得到驗(yàn)證。本研究中，用PEG、NaCl分別處理結(jié)縷草48 h，ZjCSD基因的表達(dá)整體均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，說(shuō)明干旱脅迫和鹽脅迫均能誘導(dǎo)ZjCSD基因表達(dá)上調(diào)，與前人研究結(jié)果一致。

重金屬脅迫會(huì)導(dǎo)致植物的生物量減少，葉片失綠，根系生長(zhǎng)受到抑制，形態(tài)發(fā)生改變，甚至死亡[25]。在重金屬污染物中，鎘(Cd)由于遷移性強(qiáng)，易被植物吸收富集進(jìn)入食物鏈，威脅人畜健康，因而是重金屬污染物中危害性最大的一種[26]。大量研究表明，植物能夠通過(guò)調(diào)節(jié)SOD基因的表達(dá)水平來(lái)抵抗Cd脅迫。張玉秀等[27]報(bào)道，100 μmol/L Cd2+能夠誘導(dǎo)龍葵(Solanumnigrum)幼苗CSD基因的表達(dá)上調(diào)，Luo等[28]用0.2和0.5 mmol/L的Cd2+處理多年生黑麥草(Loliumperenne)7 d，結(jié)果表明，4～24 h內(nèi)CSD基因表達(dá)量提高。本研究中，Cd2+處理?xiàng)l件下ZjCSD基因的表達(dá)量上升，與前人研究結(jié)果相符。Pawlak等[29]研究表明，在大豆幼苗根系中，Pb2+濃度為150～350 mg/L時(shí)，CSD基因 mRNA量明顯低于對(duì)照。本研究中，Pb2+處理0～48 h內(nèi)，ZjCSD基因的相對(duì)表達(dá)量總體低于或持平于對(duì)照表達(dá)量水平，與大豆幼苗根系在較高濃度Pb2+處理下CSD基因表達(dá)量下調(diào)的情況相符。由Cd2+處理誘導(dǎo)ZjCSD表達(dá)量上升而Pb2+處理誘導(dǎo)ZjCSD表達(dá)量下降的事實(shí)可以推測(cè)，ZjCSD基因?qū)d2+和Pb2+的響應(yīng)模式和調(diào)控機(jī)制不同。造成上述差異的原因之一可能是這兩種金屬具有不同的化學(xué)性質(zhì)，其中Cd可以替代轉(zhuǎn)錄因子鋅指結(jié)構(gòu)中的Zn配合物，并在一定程度上作為轉(zhuǎn)錄激活因子發(fā)揮作用[30]，但具體原因仍需進(jìn)一步探究。綜上，ZjCSD基因在重金屬脅迫下的表達(dá)調(diào)控機(jī)制十分復(fù)雜，不同的重金屬元素有不同的調(diào)控機(jī)制，詳細(xì)的機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本研究從結(jié)縷草中克隆獲得了結(jié)縷草銅鋅超氧化物歧化酶基因，命名為ZjCSD。該基因含有完整的ORF，編碼152個(gè)氨基酸。ZjCSD基因編碼的蛋白含有CSD家族特有的保守結(jié)構(gòu)域，具有典型的金屬結(jié)合位點(diǎn)。ZjCSD基因在葉中表達(dá)量最高；在干旱脅迫、鹽脅迫和Cd2+脅迫下表達(dá)量上調(diào)，在Pb2+脅迫下表達(dá)量下調(diào)。因此，推測(cè)ZjCSD基因參與結(jié)縷草抵抗干旱、鹽和重金屬脅迫的過(guò)程，并在其中發(fā)揮一定功能。

References：

[1] Laloi C, Apel K, Danon A. Reactive oxygen signalling: the latest news. Current Opinion in Plant Biology, 2004, 7(3): 323-328.[2] Noctor G, Foyer C H. Redox homeostasis and antioxidant signalling: a metabolic interface between stress perception and physiological responses. Plant Cell, 2005, 17(7): 1866-1876.

[3] Gill S S, Tuteja N. Reactive oxygen species and antioxidant machinery in abiotic stress tolerance in crop plants. Plant Physiology and Biochemistry, 2010, 48(12): 909-930.

[4] Mittler R, Vanderauwera S, Gollery M,etal. Reactive oxygen gene network of plants. Trends in Plant Science, 2004, 9(10): 490-498.

[5] Qu Y N, Yang Z M. Effect of drought and heat stress on antioxidant metabolism ofAgrostisstoloniferaL. Journal of Shandong Agricultural University： Natural Science Edition, 2014, 45(4): 489-494. 曲亞楠, 楊志民. 高溫與干旱脅迫對(duì)匍匐翦股穎抗氧化代謝的影響. 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào): 自然科學(xué)版, 2014, 45(4): 489-494.[6] Fan R P, Zhou Q, Zhou B,etal. Effects of salinization stress on growth and the antioxidant system of tall fescue. Acta Prataculturae Sinica, 2012, 21(1): 112-117. 樊瑞蘋, 周琴, 周波, 等. 鹽脅迫對(duì)高羊茅生長(zhǎng)及抗氧化系統(tǒng)的影響. 草業(yè)學(xué)報(bào), 2012, 21(1): 112-117.

[7] Xu J, Yang J, Duan X G,etal. Increased expression of native cytosolic Cu/Zn superoxide dismutase and ascorbate peroxidase improves tolerance to oxidative and chilling stresses in cassava (ManihotesculentaCrantz). BMC Plant Biology, 2014, 14: 208.[8] Zhang H N, Li X J, Li C D,etal. Effects of overexpression of wheat superoxide dismutase (SOD) genes on salt tolerant capability in tobacco. Acta Agronomica Sinica, 2008, 34(8): 1403-1408. 張海娜, 李小娟, 李存東, 等. 過(guò)量表達(dá)小麥超氧化物歧化酶(SOD)基因?qū)煵菽望}能力的影響. 作物學(xué)報(bào), 2008, 34(8): 1403-1408.

[9] Jones-Rhoades M W, Bartel D P. Computational identification of plant microRNAs and their targets, including a stress-induced miRNA. Molecular Cell, 2004, 14(6): 787-799.

[10] Axtell M J, Bartel D P. Antiquity of microRNAs and their targets in land plants. Plant Cell, 2005, 17(6): 1658-1673.

[11] Lee Y M, Friedman D J, Ayala F J. Superoxide dismutase: an evolutionary puzzle. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1985, 82(3): 824.

[12] Sunkar R. MicroRNAs with macro effects on plant stress responses. Seminars in Cell and Developmental Biology, 2010, 21(8): 805-811.

[13] AbdelGhany S E, Pilon M. MicroRNA-mediated systemic down-regulation of copper protein expression in response to low copper availability in Arabidopsis. Journal of Biological Chemistry, 2008, 283(23): 15932-15945.

[14] Jia X, Wang W X, Ren L,etal. Differential and dynamic regulation of miR398 in response to ABA and salt stress inPopulustremulaandArabidopsisthaliana. Plant Molecular Biology, 2009, 71(1): 51-59.

[15] Jia X, Ren L, Chen Q J,etal. UV-B-responsive microRNAs inPopulustremula. Journal of Plant Physiology, 2009, 166(18): 2046-2057.

[16] Sunkar R, Kapoor A, Zhu J K. Posttranscriptional induction of two Cu/Zn superoxide dismutase genes inArabidopsisis mediated by downregulation of miR398 and important for oxidative stress tolerance. Plant Cell, 2006, 18(8): 2051-2065.

[17] Bonnet E, Wuyts J, Rouzé P,etal. Detection of 91 potential conserved plant microRNAs inArabidopsisthalianaandOryzasativaidentifies important target genes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2004, 101(31): 11511-11516.

[18] Beauclair L, Yu A, Bouché N. MicroRNA-directed cleavage and translational repression of the copper chaperone for superoxide dismutase mRNA in Arabidopsis. Plant Journal, 2010, 62(3): 454-462.

[19] Sunkar R, Zhu J K. Novel and stress-regulated microRNAs and other small RNAs from Arabidopsis. Plant Cell, 2004, 16(8): 2001-2019.

[20] Xu L X. Mechanism Involved in Drought Response and Post-drought Recovery of Kentucky Bluegrass[D]. Beijing: Beijing Forestry University, 2011. 許立新. 草地早熟禾適應(yīng)干旱以及干旱后復(fù)水恢復(fù)機(jī)理研究[D]. 北京: 北京林業(yè)大學(xué), 2011.

[21] Shi P. The Drought Pretreatment Inducing the Physiological Mechanism of Drought Resistance and Differential Expression of Anti-oxidase Gene inTrifoliumrepens[D]. Sichuan: Sichuan Agricultural University, 2012. 石鵬. 干旱預(yù)處理誘導(dǎo)白三葉抗旱性的生理機(jī)制與抗氧化酶基因差異表達(dá)[D]. 四川: 四川農(nóng)業(yè)大學(xué), 2012.

[22] Bueno P, Piqueras A, Kurepa J,etal. Expression of antioxidant enzymes in response to abscisic acid and high osmoticum in tobacco BY-2 cell cultures. Plant Science, 1998, 138(1): 27-34.

[23] Rubio M C, Bustos-Sanmamed P, Clemente M R,etal. Effects of salt stress on the expression of antioxidant genes and proteins in the model legumeLotusjaponicus. New Phytologist, 2009, 181(4): 851-859.

[24] Xing X S. Characterization of Antioxidant Defense GenesKcCSDandKcTrxffromKandeliacandelChloroplast under NaCl Stress[D]. Beijing: Beijing Forestry University, 2015. 荊曉姝. 秋茄葉綠體抗氧化防御基因KcCSD和KcTrxf的耐鹽性功能分析[D]. 北京: 北京林業(yè)大學(xué), 2015.

[25] Yadav S K. Heavy metals toxicity in plants: an overview on the role of glutathione and phytochelatins in heavy metal stress tolerance of plants. South African Journal of Botany, 2010, 76(2): 167-179.

[26] Wagner G J. Accumulation of cadmium in crop plants and its consequences to human health. Advances in Agronomy, 1993, 51: 173-212.

[27] Zhang Y X, Jin L, Feng S S,etal. Effects of Cd on activity and gene expression of antioxidant enzymes in hyperaccumulatorSolanumnigrumL. Journal of Graduate University of Chinese Academy of Sciences, 2013, 30(1): 11-17. 張玉秀, 金玲, 馮珊珊, 等. 鎘對(duì)鎘超累積植物龍葵抗氧化酶活及基因表達(dá)的影響. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué)學(xué)報(bào), 2013, 30(1): 11-17.

[28] Luo H, Li H, Zhang X,etal. Antioxidant responses and gene expression in perennial ryegrass (LoliumperenneL.) under cadmium stress. Ecotoxicology, 2011, 20(4): 770-778.

[29] Pawlak S, Firych A, Rymer K,etal. Cu, Zn-superoxide dismutase is differently regulated by cadmium and lead in roots of soybean seedlings. Acta Physiologiae Plantarum, 2009, 31(4): 741-747.

[30] Hartwig A. Zink finger proteins as potential targets for toxic metal ions: differential effects on structure and function. Antioxidants and Redox Signaling, 2001, 3(4): 625-634.

Molecular cloning and expression analysis ofZjCSDfromZoysiajaponica

ZHANG Xue1, SUN Xin-Bo2, FAN Bo1, ZHANG Yin-Bing1, HAN Lie-Bao1, XU Li-Xin1*

1.InstituteofTurfgrassScience,BeijingForestryUniversity,Beijing100083,China; 2.KeyLaboratoryofCropGrowthRegulationofHebeiProvince,AgriculturalUniversityofHebei,Baoding071001,China

Copper/zinc-superoxide dismutase (CSD) is a key enzyme involved in the plant response to abiotic stress. Its content and activity is closely related to the stress tolerance of plants. TheZjCSDgene was isolated from the transcriptome database ofZoysiajaponicaby homologous cloning. It encoded a protein of 152 amino acid residues. Bioinformatics analysis revealed that the protein encoded byZjCSDgene was stable, hydrophobic, acidic, fat-soluble, and located in the cytoplasm. With typical Cu2+and Zn2+binding sites,ZjCSDbelonged to the plant SOD super family. A homology analysis based on the deduced amino sequence indicated thatZjCSDhad a closer relationship with CSD from Setaria italica and Zea mays than with CSDs from other plants. The expression profiles ofZjCSDin different tissues and under different stress treatments were investigated by qRT-PCR. Transcripts ofZjCSDwere detected in the root, stem, and leaf. The highest transcript levels were in the leaf. TheZjCSDmRNA levels were up-regulated by salt, drought, and cadmium stress, and down-regulated by lead stress. These results suggested thatZjCSDmight play a role in drought, salt, and heavy metal stress tolerance inZ.japonica.

Zoysiajaponica;CSD; bioinformatics; abiotic stress; qRT-PCR

10.11686/cyxb2016260

http://cyxb.lzu.edu.cn

2016-06-27；改回日期：2016-11-04

中國(guó)林學(xué)會(huì)——青年人才托舉工程項(xiàng)目和國(guó)家高新技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(2013AA102607)資助。

張雪(1991-)，女，山東煙臺(tái)人，在讀碩士。E-mail: zhangxuenearyuki@163.com

*通信作者Corresponding author. E-mail: lixinxu@bjfu.edu.cn

張雪, 孫鑫博, 樊波, 張胤冰, 韓烈保, 許立新. 結(jié)縷草ZjCSD基因的克隆及表達(dá)分析. 草業(yè)學(xué)報(bào), 2017, 26(2): 102-110.

ZHANG Xue, SUN Xin-Bo, FAN Bo, ZHANG Yin-Bing, HAN Lie-Bao, XU Li-Xin. Molecular cloning and expression analysis ofZjCSDfromZoysiajaponica. Acta Prataculturae Sinica, 2017, 26(2): 102-110.