SCN9A基因突變與癲癇的相關(guān)性

伍明剛 張 昭 李新宇 左松林 王菊麗 朱金玲 張金波

(佳木斯大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007)

SCN9A基因突變與癲癇的相關(guān)性

伍明剛 張 昭 李新宇 左松林 王菊麗1朱金玲2張金波2

(佳木斯大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007)

目的 探討SCN9A基因rs6746030位點(diǎn)與癲癇疾病發(fā)病的相關(guān)性。方法 從醫(yī)院隨機(jī)選取中央顳區(qū)棘波兒童良性癲癇(BECT)組78例和原發(fā)性未分類癲癇組82例，以正常人(無癲癇發(fā)作史且家族其他上下三代親屬中無癲癇發(fā)作史)32例血液作為對照組，提取全血DNA，以PCR擴(kuò)增、酶切、電泳、測序等技術(shù)確定堿基序列及基因分型。運(yùn)用χ2檢驗(yàn)計(jì)算該基因型與癲癇發(fā)病相關(guān)性。結(jié)果 對照組與疾病組均為平衡群體(P>0.05)；SCN9A基因rs6746030位點(diǎn)與BECT癲癇發(fā)病存在相關(guān)性(P=0.006 3)；SCN9A基因rs6746030位點(diǎn)與未分類癲癇相關(guān)(P=0.012 0)。結(jié)論 SCN9A基因rs6746030位點(diǎn)突變與癲癇發(fā)病具有相關(guān)性。

癲癇；基因突變；SCN9A

癲癇是大腦神經(jīng)元突發(fā)性異常放電導(dǎo)致短暫大腦功能障礙的一種慢性疾病。遺傳學(xué)與生物學(xué)研究〔1，2〕表明，神經(jīng)元細(xì)胞核中編碼離子通道的基因突變導(dǎo)致膜通道蛋白改變引起通道性質(zhì)與結(jié)構(gòu)的變化與癲癇發(fā)病關(guān)系密切，其中包括SCN9A〔3〕參與編碼的電壓門控性鈉離子通道蛋白〔4，5〕。鈉離子通道的打開與關(guān)閉能控制細(xì)胞電流的變化，在調(diào)整大腦神經(jīng)元放電過程中有主要作用。本文旨在探討SCN9A與癲癇發(fā)病的相關(guān)性。

1 材料和方法

1.1 研究對象 經(jīng)同意采取癲癇患者血液標(biāo)本，選取從2012～2015年，佳木市中心醫(yī)院中央?yún)^(qū)棘波兒童良性癲癇(BECT)組78例和未分類癲癇組82例，篩選正常人32例血液作為對照組不做性別統(tǒng)計(jì)。未分類癲癇組入選標(biāo)準(zhǔn)為在醫(yī)院確診為腦部異常放電引起癲癇的病人。 PCR引物設(shè)計(jì)：根據(jù)美國國立生物信息中心NCBI給予的rs6746030基因序列，由上海生工公司設(shè)計(jì)引物。引物序列：正向引物5′-GTGGTCCTTTGGACAACAGC-3′，反向引物5′-TGGTTGAGGGAGTATCACAGAA-3′，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長為477 bp，經(jīng)酶切以后所得酶切產(chǎn)物分別為144 bp和333 bp。

1.2 外周血DNA提取 經(jīng)DNA提取試劑盒(BioTeKe全血基因組提取試劑盒)提取DNA后保存于-20℃冰箱內(nèi)。

1.3 PCR擴(kuò)增 反應(yīng)體系為15 μl。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s、60℃退火30 s、72℃延伸30 s，72℃終末延伸5 min，循環(huán)30次。

1.4 酶切 rs6746030位點(diǎn)的酶切酶為FastDigest Csp6I，試劑添加為Csp6I 0.8 μl；緩沖液1.6 μl；三蒸水13.6 μl，將16 μl混合液混入8 μl DNA 產(chǎn)物中，37℃水浴5 min后80℃水浴滅活10 min。

1.5 瓊脂糖凝膠電泳及測序 2%瓊脂糖凝膠電泳，電壓150 V，時(shí)間45 min，紫外線凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行基因分型。隨機(jī)選取不同基因型個(gè)體DNA標(biāo)本寄送中國上海生物工程股份有限公司對其進(jìn)行測序。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS11.0軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 Hardy-Weinber平衡分析 各實(shí)驗(yàn)組均滿足Hardy-Weinberg平衡，P>0.5，所以選取的各組標(biāo)本為遺傳平衡群體，見表1。病例組與對照組間等位基因頻率有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表2、表3。

2.2 SNP位點(diǎn)測序結(jié)果圖和酶切凝膠電泳圖

2.2.1 SNP位點(diǎn)測序結(jié)果圖 在所有結(jié)果中只見G/A與G/G兩種基因型，未見A/A型突變，見圖1。

2.2.2 酶切結(jié)果 見圖2。

表1 各組等位基因的Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)(n)

自由度λ=2

表2 BECT組與對照組的rs6746030位點(diǎn)的基因型及 等位基因頻率分布比較〔n(%)〕

G/G為野生純合子，G/A為突變雜合子，A/A為突變純合子，下表同

表3 癲癇組與對照組的rs6746030位點(diǎn)的基因型及等位基因頻率分布比較(%)

圖1 SNP位點(diǎn)測序結(jié)果圖

Y：原樣；GG：野生純合子G/G；GA：突變雜合子G/A；未見突變純合子A/A型圖2 酶切結(jié)果

3 討 論

癲癇是神經(jīng)系統(tǒng)的常見病之一，癲癇的家族聚集現(xiàn)象顯示其發(fā)病具有遺傳性，與癲癇有關(guān)的基因已被準(zhǔn)確定位〔6〕。癲癇發(fā)病可以分為原發(fā)性癲癇和繼發(fā)性癲癇，其中繼發(fā)性癲癇往往繼發(fā)于腦部內(nèi)外傷、神經(jīng)系統(tǒng)寄生蟲感染、腦血管病、腫瘤、遺傳代謝、神經(jīng)系統(tǒng)藥物中毒等。原發(fā)性癲癇為腦部異常放電引起身體肌肉癇樣痙攣，臨床上診斷只能依靠詢問病史、腦電圖檢查等，到目前為止未發(fā)現(xiàn)能對原發(fā)性癲癇發(fā)作有聯(lián)系的實(shí)質(zhì)性損傷。近年來研究表明，癲癇的發(fā)病與離子通道的改變有關(guān)〔7〕，染色體19q13.1的基因SCN1B(編碼電壓型門控鈉離子通道的β1調(diào)節(jié)亞基)的點(diǎn)突變導(dǎo)致GEFS+，表明電壓型門控鈉離子通道的改變能誘發(fā)癲癇。電壓性門控鈉離子〔8〕通道蛋白中αⅠ、αⅡ、β1、β2、α9蛋白分別由SCN1A、SCN2A、SCN1B、SCN2B和SCN9A基因編碼表達(dá)，其中SCN9A基因在GEFS+家族中的I62V、P149Q突變〔9〕，SCN9A突變還被發(fā)現(xiàn)與SCN1A突變共同存在于SMEI家族中，說明SCN9A基因突變能誘發(fā)癲癇，但SCN9A基因具體堿基的突變與癲癇發(fā)病相關(guān)性及該基因突變的致病機(jī)制研究報(bào)道很少。研究SCN9A基因突變與原發(fā)性癲癇之間相關(guān)性，可以豐富原發(fā)性癲癇病因?qū)W內(nèi)容。

SCN9A基因在檢測中未發(fā)現(xiàn)突變純合子A/A的類型，可能

因?yàn)镚突變?yōu)锳的概率為0.109/237(GenBank數(shù)據(jù))，突變率低，但是不排除純在野生純合子A/A型基因，故統(tǒng)計(jì)時(shí)每個(gè)基因組數(shù)據(jù)都加0.5后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。SCN9A基因中rs6746030位點(diǎn)上野生純合子G/G突變成雜合子A/G后可能引起B(yǎng)ECT發(fā)病，G向A突變可能與BECT發(fā)病有關(guān)；同樣的，SCN9A基因中rs6746030位點(diǎn)上野生純合子G/G突變成雜合子A/G后可能引起大多數(shù)原發(fā)性癲癇發(fā)病，G向A突變可能與大多數(shù)原發(fā)性癲癇發(fā)病有關(guān)。

編碼電壓型門控鈉離子通道蛋白基因突變誘發(fā)很多癲癇綜合征，大多數(shù)〔10〕突變發(fā)生在SCN1A基因上，對SCN9A基因突變導(dǎo)致癲癇發(fā)病的報(bào)道少，本研究對SCN9A基因突變引發(fā)癲癇在病因?qū)W上做了補(bǔ)充，但是由于標(biāo)本量小，標(biāo)本采集地域局限，所以該研究只針對佳木斯地區(qū)有一定的意義，研究還待進(jìn)一步深入，探索人類SCN9A基因與癲癇的關(guān)系。

1 李玉娟，柳垂亮，王 飛，等.異氟醚和七氟醚對新生大鼠皮質(zhì)凋亡以及Akt和Bcl-x/Bad表達(dá)的不同影響〔J〕.中山大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)科學(xué)版)，2011；32(3)：291-6.

2 Engel T，Henshall DC.Apoptosis，Bcl-2 family proteins and caspases：the ABCs of seizure-damage and epiletogenesis〔J〕?Int J Physiol Pathophysiol Pharmacol，2009;1(2)：97-115.

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4 向 林，楊 青.特發(fā)性癲癇離子通道基因的研究進(jìn)展〔J〕.重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2007；32(1)：106-9.

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〔2016-03-11修回〕

(編輯 李相軍)

2015年黑龍江省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃指導(dǎo)項(xiàng)目(201510222043)；佳木斯大學(xué)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(CXTDPY-201602)；佳木斯大學(xué)青年基金項(xiàng)目 (Sq2012-38)

張金波(1974-)，女，副教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事遺傳病的診斷、治療與預(yù)防研究。

伍明剛(1992-)，男，2012級臨床醫(yī)學(xué)在讀學(xué)生，主要從事臨床醫(yī)學(xué)研究。

R742.1

A

1005-9202(2017)03-0623-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.03.043

1 佳木斯市中心醫(yī)院 2 佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院