慢病毒表達系統(tǒng)介導(dǎo)的RNAi技術(shù)靶向沉默Bi-1基因?qū)Ρ茄拾┘毎飳W(xué)特性的影響

皮 文 于長華 劉志標(biāo)

(淮安市第一人民醫(yī)院耳鼻咽喉科，江蘇 淮安 223300)

慢病毒表達系統(tǒng)介導(dǎo)的RNAi技術(shù)靶向沉默Bi-1基因?qū)Ρ茄拾┘毎飳W(xué)特性的影響

皮 文 于長華1劉志標(biāo)

(淮安市第一人民醫(yī)院耳鼻咽喉科，江蘇 淮安 223300)

目的 探討B(tài)i-1 基因的生物學(xué)功能及其與鼻咽癌發(fā)生與發(fā)展的相關(guān)性。方法 首先構(gòu)建以Bi-1 為靶基因的RNA干擾(RNAi)質(zhì)粒載體,采用慢病毒表達系統(tǒng)將其導(dǎo)入細胞，利用RNAi 技術(shù)在細胞內(nèi)誘導(dǎo)特異序列的基因沉默以觀察對鼻咽癌細胞生長增殖的影響。結(jié)果 靶向Bi-1 沉默的慢病毒感染鼻咽癌細胞后能有效抑制細胞的生長增殖并誘導(dǎo)其凋亡，在熒光顯微鏡下可見經(jīng)靶向Bi-1沉默的慢病毒處理后的鼻咽癌細胞呈現(xiàn)出細胞皺縮、核固縮、核斷裂等典型的凋亡細胞形態(tài)，而且DNA凝膠電泳圖譜呈現(xiàn)“梯狀”現(xiàn)象；此外，Bi-1 基因的沉默可有效地抑制裸鼠鼻咽癌移植瘤的生長。結(jié)論 靶向沉默鼻咽癌細胞中的Bi-1表達，可抑制細胞生長增殖，并誘導(dǎo)細胞發(fā)生凋亡。

鼻咽癌；Bi-1；RNA干擾；慢病毒

細胞凋亡是由基因編程控制的一種細胞生理性死亡，是多細胞生物體維持正常生長、組織動態(tài)平衡等正常生理活動的需要〔1〕。細胞凋亡涉及體內(nèi)代謝的多個分子、多條途徑，因此其發(fā)生機制和影響因素復(fù)雜多樣，迄今其機制并未完全清楚。Bi-1 基因作為細胞內(nèi)的凋亡抑制基因，已被發(fā)現(xiàn)其在體內(nèi)組織的表達隨著組織的發(fā)展而發(fā)生改變，說明Bi-1 基因的表達可能與細胞生長增殖密切相關(guān)〔2〕。本研究擬探討B(tài)i-1 基因與鼻咽癌細胞發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料 細胞株、菌株和質(zhì)粒：人鼻咽癌細胞株CNE-1、SUNE-1 和病毒包裝細胞293T 均由廣東醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究所保存，大腸桿菌E.coli XL-blue 為本研究所保存。慢病毒包裝系統(tǒng)包括一個轉(zhuǎn)移載體pLUNIG 和三個包裝載體pMDL-G/p-RRE，pRSV-REV 和pMK-VSVG。

主要試劑：Bi-1 山羊IgG 多克隆抗體，β-actin小鼠IgG 單克隆抗體，山羊抗小鼠IgG-辣根過氧化物酶(HRP)，兔抗山羊IgG-HRP；ECL 試劑(Santa Cruz)；SS-PAGE 低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)(BIO-RAD)；瓊脂糖(Amresco)；PrimeScriptTMRT試劑盒Kit，SYBRR Premix Ex TaqTM熒光定量PCR 試劑盒，限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、SalⅠ和CalⅠ，T4 DNA 連接酶(TaKaRa)；100 bp DNA marker，4，6-二胺基-2-苯基吲哚(DAPI)，聚偏氟丙烯(PVDF)膜(Sigma)；質(zhì)粒抽提試劑盒(Giagen)；DNA ladder 檢測試劑盒(Merck)；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 病毒感染鼻咽癌細胞 將含有Bi-1 干擾片段的慢病毒(lenti-shBi-1)和對照慢病毒(lenti-shLuc)分別感染CNE-1 和SUNE-1細胞。具體操作：按病毒滴度，在一個1.5 ml EP 管中加入適量的轉(zhuǎn)染病毒，并用培養(yǎng)基補充為100 μl后加入1 μl 100倍聚凝胺混勻，置室溫孵育5 min，加入到24孔板中培養(yǎng)的鼻咽癌細胞中；同時加入培養(yǎng)基(200 μl)與100倍聚凝胺(2 μl)的混合液，輕輕混勻后于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜，次日更換為新鮮培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng)，感染48 h后熒光顯微鏡下觀察熒光，并通過熒光細胞數(shù)推算病毒感染效率。

1.2.2 熒光定量 RT-PCR鑒定病毒感染鼻咽癌細胞中Bi-1的表達 具體實驗步驟嚴格按照試劑盒說明進行，相對定量實驗使用的分析方法為比較Ct值法。

1.2.3 Western印跡法鑒定病毒感染鼻咽癌細胞中Bi-1蛋白的表達 分別用lenti-shBi-1 和lenti-shLuc慢病毒感染2種鼻咽癌細胞株CNE-1和SUNE-1，感毒感染12 h后更換新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)60 h 后收集細胞，以預(yù)冷至0℃的磷酸鹽緩沖液(PBS)(pH7.2)洗滌2次，具體實驗步驟嚴格按照試劑盒說明進行，用Leica QWin圖像分析軟件進行光密度積分值(IOD)分析。每個圖像均重復(fù)分析3 次，取平均值。

1.2.4 噻唑藍比色實驗(MTT法)檢測細胞增殖能力 感染后，每孔1×103個細胞接種于96 孔培養(yǎng)板中，每孔體積200 μl，每組做5 個平行孔，同時設(shè)空白對照(僅加培養(yǎng)基)，分別培養(yǎng)24、48、72、96、120 h 后，每孔加入20 μl MTT(5 mg/ml)后于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，再加入150 μl/孔的DMSO，室溫孵育10 min，脫色搖床上振蕩10 min，置酶標(biāo)儀上于490 nm處測定各孔吸光度值(A490 nm)。以時間為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪制細胞生長曲線。

1.2.5 DAPI熒光染色法檢測細胞形態(tài)學(xué)改變 分別用lenti-shBi-1 和lenti-shLuc慢病毒感染鼻咽癌細胞CNE-1 和SUNE-1 72 h后，盡可能棄去上清，用胰酶消化后，800 r/min 離心5 min收集細胞，用適量的75%乙醇進行固定，4℃固定10 min，吸取1滴加到載玻片上，加入1.0 μl的DAPI 染料，蓋上蓋玻片，熒光顯微鏡下觀察細胞形態(tài)改變以區(qū)分出正常細胞與凋亡細胞并拍照。

1.2.6 凋亡細胞DNA ladder檢測 分別收集用lenti-shBi-1 和lenti-shLuc 慢病毒感染72 h后的鼻咽癌細胞CNE-1 和SUNE-1，按照Merck公司的DNA ladder檢測試劑盒提取細胞DNA，具體實驗按說明書操作進行。

2 結(jié) 果

2.1 重組質(zhì)粒 pU6-Bi-1-shRNA的PCR鑒定 經(jīng)PCR擴增后，陽性克隆得到一條較對照組大82 bp的條帶，pU6-Bi-1-shRNA重組質(zhì)粒成功構(gòu)建。見圖1。

M:100 bp marker;1:陽性單克隆;2:pU6圖1 pU6-BI-1-shRNA重組質(zhì)粒的 PCR鑒定

2.2 靶向 Bi-1沉默的慢病毒成功包裝 將含靶基因shRNA 的慢病毒轉(zhuǎn)移載體LunIG 與3 個病毒包裝載體pMDL-G/p-RRE、pRSV-REV 和pMK-VSVG 混勻并轉(zhuǎn)染293T 細胞后，可包裝產(chǎn)生兩種慢病毒，即含Bi-1shRNA 序列的慢病毒(lenti-shBi-1)和對照慢病毒(lenti-shLuc)。293T 細胞包裝產(chǎn)生的慢病毒，經(jīng)梯度稀釋法測定得到病毒滴度。測定結(jié)果顯示，lenti-shBi-1 慢病毒的滴度為6.5×105TU/ml，對照組慢病毒(lenti-shLuc)滴度為4.3×106TU/ml，兩種病毒的滴度均能滿足實驗的需要。

2.3 慢病毒 lentivirus-shBi-1可明顯抑制鼻咽癌細胞 Bi-1的表達 將包裝產(chǎn)生的慢病毒顆粒lentivirus-shBi-1 分別感染CNE-1 和SUNE-1 細胞48 h后，熒光顯微鏡下觀察到大多數(shù)細胞發(fā)出綠色熒光，結(jié)合可見光下的細胞總數(shù)，推算出病毒的轉(zhuǎn)染效率高達90%以上。熒光定量PCR結(jié)果顯示，用慢病毒顆粒lentivirus-shBi-1 分別感染CNE-1 和SUNE-1 細胞后，細胞中Bi-1 mRNA表達水平(0.048±0.014,0.092±0.010)顯著降低，與未處理組細胞(設(shè)為1)相比差異顯著(P<0.01)；而用慢病毒顆粒lentivirus shLuc 感染的細胞中Bi-1 mRNA 表達水平(1.063±0.044，1.063±0.044)與未處理組細胞相比基本上趨于一致，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖2。

圖2 慢病毒感染后發(fā)綠色熒光的 CNE-1細胞(×100)

Western印跡檢測結(jié)果顯示，慢病毒顆粒lentivirus-shBi-1 分別感染鼻咽癌細胞CNE-1 和SUNE-1 72h后，細胞中Bi-1 的蛋白表達水平(0.108，0.167)顯著降低，與未處理組細胞(1.061，1.032)相比差異顯著(P<0.01)。而用慢病毒顆粒lentivirus-shLuc感染鼻咽癌細胞后，細胞中Bi-1 蛋白表達(0.998，1.087)與未處理組細胞相比沒有明顯改變。同時，根據(jù)各條帶的Bi-1 蛋白灰度值與β-actin 蛋白灰度值比率，可計算出lentivirus-shBi-1 感染的CNE-1 和SUNE-1 細胞中Bi-1 的表達率分別為10.2%和16.2%，與對照組相比差異顯著(P<0.01)。說明慢病毒介導(dǎo)的siRNA(lentivirus-shBi-1)可以明顯抑制細胞中Bi-1 的表達，結(jié)果與熒光定量PCR的結(jié)果一致。見圖3。

1:CNE-1;2:CNE-1-shLuc;3:CNE-1-shBi-1;4:SUNE-1;5:SUNE-1-shLuc;6:SUNE-1-shBi-1圖3 Western印跡法檢測鼻咽癌細胞 CNE-1及SUNE-1中 Bi-1蛋白的表達

2.4 Bi-1 基因沉默可抑制鼻咽癌細胞 CNE-1和 SUNE-1的生長增殖 分別用不同病毒感染鼻咽癌CNE-1 和SUNE-1 后，不同處理的三組細胞的體外增殖能力差異顯著(P<0.01)。與未處理組細胞和lentivirus-shLuc 慢病毒處理組細胞相比，慢病毒lentivirus-shBi-1 處理的細胞生長增殖速度顯著減慢，表明干擾Bi-1 基因表達后抑制了鼻咽癌細胞CNE-1 和SUNE-1 的體外增殖。見表1。

表1 lentivirus-shBi-1體外抑制鼻咽癌細胞的生長增殖

2.5 Bi-1 基因沉默可抑制鼻咽癌細胞 CNE-1和 SUNE-1凋亡 DAPI 細胞熒光染色結(jié)果顯示：分別用慢病毒lentivirus-shBi-1 感染CNE-1和SUNE-1 細胞后，在熒光顯微鏡下可觀察到細胞出現(xiàn)典型的凋亡形態(tài)學(xué)改變，包括胞體縮小、核固縮、核碎裂。而lentivirus-shLuc 慢病毒處理的鼻咽癌細胞中未見凋亡細胞的產(chǎn)生。DNA ladder 實驗結(jié)果顯示，慢病毒lentivirus-shBi-1 感染CNE-1 和SUNE-1 細胞72 h后，在瓊脂糖凝膠電泳圖片上呈現(xiàn)出較明顯的“梯狀”條帶；但與DAPI 染色一樣，用lentivirus- shLuc 慢病毒處理的鼻咽癌細胞中未見DNA“梯狀”條帶的出現(xiàn)。見圖4，圖5。

圖4 DAPI 細胞熒光染色結(jié)果(×200)

圖5 瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

3 討 論

基因治療是通過引入遺傳物質(zhì)到特定的組織或細胞從而達到疾病治療的一種實驗性處理方法〔3〕。RNAi是一種定向基因沉默技術(shù)，屬于轉(zhuǎn)錄后基因沉默機制〔4〕，它由雙鏈RNA 啟動，降解與雙鏈RNA 具有相同序列的同源mRNA，進而高效、特異地阻抑細胞內(nèi)源或外源性靶基因的表達，引起基因沉默。近幾年的研究發(fā)現(xiàn)，長度為21～23 nt的siRNA 能引起特異性基因沉默，又不影響體內(nèi)其他非目的基因的表達〔5〕。目前，RNAi 作為一種成熟的基因沉默技術(shù)已被廣泛地運用到科研實踐中，并取得了較好的基因沉默效果〔6〕。趙景宏等〔7〕利用RNAi技術(shù)成功地抑制了胰腺癌細胞中stathmin 基因而抑制了腫瘤細胞的生長，其抑制的特異性和效率都高達90%以上。還有研究發(fā)現(xiàn)，RNAi 在抑制Ⅰ型胰島素樣生長因子BP7(IGFBP7)基因表達時，能快速且特異地誘導(dǎo)惡性黑色素瘤細胞凋亡〔8〕。這些都說明采用RNAi 技術(shù)封閉癌基因在誘導(dǎo)某些癌細胞凋亡、抑制其復(fù)發(fā)和遠處轉(zhuǎn)移方面發(fā)揮至關(guān)重要的作用。

細胞的增殖、分化和凋亡之間的平衡是組織穩(wěn)定性的先決條件，如果細胞凋亡受抑，細胞增殖與凋亡的平衡調(diào)節(jié)被破壞，結(jié)果導(dǎo)致細胞數(shù)目不斷增加，表現(xiàn)出生長優(yōu)勢。Bi-1 作為細胞凋亡通路上受Bcl-2和Bax 調(diào)控的調(diào)節(jié)蛋白，在惡性腫瘤中，其過度表達或表達不足導(dǎo)致Bi-1/Bcl-XL/Bcl-2 和Bax 蛋白失去平衡，引起凋亡不足，細胞增殖與凋亡的平衡調(diào)節(jié)被破壞，與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，而且可影響腫瘤的惡性行為如浸潤、轉(zhuǎn)移、惡性生長。雖然Bi-1 在動物的睪丸、肺、前列腺、心臟、腦、胎盤、肝、骨骼肌、脾、腎和胰腺等組織中廣泛表達，但是與相應(yīng)的正常細胞相比，Bi-1基因在前列腺癌、原發(fā)性乳腺癌細胞中的表達上調(diào)4～10倍。另外，在子宮癌、卵巢癌、胃癌和肺腺癌細胞中也發(fā)現(xiàn)Bi-1 基因表達的上調(diào)，這些表明Bi-1基因過表達可能與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，有望成為腫瘤治療的新靶點。然而，Bi-1 與其他腫瘤的關(guān)系尚未見報道，還需要進行深入的研究。進一步的研究還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)某些癌細胞(如乳腺癌、鼻咽癌)中高表達的Bi-1 基因被特異性地沉默后能抑制其生長增殖并誘導(dǎo)細胞發(fā)生凋亡甚至死亡，這就提示Bi-1 基因在腫瘤的基因治療中可能有著重要的意義〔9〕。

本研究選取Bi-1 基因明顯高表達的鼻咽癌細胞株CNE-1 和SUNE-1 為靶細胞，以復(fù)制缺陷型慢病毒作為載體，首先成功構(gòu)建可特異性沉默Bi-1 基因表達并帶有GFP 報告基因的慢病毒載體LunIG-Bi-1-shRNA，并得到了較高滴度的慢病毒lenti-shBi-1。重組病毒顆粒感染兩種鼻咽癌細胞后，經(jīng)熒光定量PCR 和Western印跡驗證可明顯抑制細胞中Bi-1 基因的表達，抑制率可達85%以上，這為進一步研究Bi-1 基因在鼻咽癌發(fā)生發(fā)展中可能的作用提供了有效工具。

1 羅海清,李祥勇,蔡宏華,等.奈達鉑聯(lián)合 BI-1基因沉默對鼻咽癌細胞增殖和凋亡的影響〔J〕.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2015;36(10):1416-8.

2 王會敏,何柯新,徐建華,等.利用 RNAi阻抑 hTERT 和Bi-1雙基因表達的RNAi作用效果的研究〔J〕.重慶醫(yī)學(xué),2015；44(8):1012-6.

3 李桂源，劉華英，周 鳴,等.鼻咽癌癌變的分子機理〔J〕.生物化學(xué)與生物物理進展，2006;33(10):922-31.

4 宗永生,吳秋良,林素暇,等.Eb 病毒相關(guān)性疾病病理學(xué)研究的進展〔J〕.中山大學(xué)學(xué)報:醫(yī)學(xué)科學(xué)版,2005;26(5):481-7.

5 張美紅,李祥勇,周克元,等.bi-1 短發(fā)夾狀RNA 重組真核表達質(zhì)粒對鼻咽癌細胞和卵巢癌增殖的影響〔J〕.腫瘤防治研究,2008;35(5):321-4.

6 Yuan JS,Reed A,Chen F,etal.Statistical analysis of real-time PCR data〔J〕.BMC Bioinformatics,2006;7(1):85-96.

7 趙景宏,黃 嵐,晉 軍,等.造影劑誘導(dǎo)腎小球內(nèi)皮細胞凋亡的caspase-3 機制〔J〕.中國藥理學(xué)通報,2006;22(9):1111-4.

8 Hannon GJ.RNA interference〔J〕.Nature,2002;418(6894)：244-51.

9 Chou MI,Hsieh YF,Wang M,etal.In vitro and in vivo targeted delivery of IL-10 interfering RNA by JC virus-like particles〔J〕.J Biomed Sci,2010;24(1):17-51.

〔2016-01-19修回〕

(編輯 袁左鳴)

皮 文(1966-)，女，副主任醫(yī)師，主要從事耳鼻咽喉腫瘤臨床診治研究。

R76

A

1005-9202(2017)03-0555-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.03.014

1 淮安市第一人民醫(yī)院放療科