硫化氫通過(guò)調(diào)控轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β及基質(zhì)金屬蛋白酶-9/基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-1改善糖尿病大鼠腎小管間質(zhì)纖維化

李子寧 梁 彪 劉茂軍 褚 春 曾 歐 李 琳 李 妍 楊 軍

(南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)科，湖南 衡陽(yáng) 421001)

硫化氫通過(guò)調(diào)控轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β及基質(zhì)金屬蛋白酶-9/基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-1改善糖尿病大鼠腎小管間質(zhì)纖維化

李子寧 梁 彪 劉茂軍 褚 春1曾 歐 李 琳 李 妍 楊 軍

(南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)科，湖南 衡陽(yáng) 421001)

目的 探討硫化氫(H2S)氣體信號(hào)分子對(duì)糖尿病大鼠腎小管間質(zhì)纖維化及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-9/基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑(TIMP)-1表達(dá)的影響。方法 單次腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)建立糖尿病模型將成年雄性SD大鼠64只隨機(jī)分為正常對(duì)照組(Control組)、STZ組、STZ+H2S組、H2S組。造模72 h后采尾靜脈血檢測(cè)，若血糖>16.7 mmol/L表明造模成功。H2S組和STZ+H2S組大鼠腹腔注射N(xiāo)aHS溶液100 μmol·kg-1·d-1，Control組和STZ組腹腔注射同等量生理鹽水。8 w后取標(biāo)本，Masson染色觀察大鼠腎臟組織病理形態(tài)學(xué)改變，Western印跡檢測(cè)大鼠腎臟TGF-β、MMP-9、TIMP-1、Ⅳ型膠原蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果 與Control組相比，STZ組存在明顯腎小管間質(zhì)纖維化，同時(shí)腎臟組織中Ⅳ型膠原、TGF-β、TIMP-1蛋白的表達(dá)升高，MMP-9蛋白的表達(dá)水平下降(P<0.05)；與STZ組大鼠相比，STZ+H2S組腎小管間質(zhì)纖維化減輕，腎組織TGF-β、TIMP-1、Ⅳ型膠原蛋白的表達(dá)降低，MMP-9蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)。結(jié)論 H2S可改善糖尿病大鼠腎小管間質(zhì)纖維化，其機(jī)制可能與調(diào)控MMP-9/TIMP-1失衡以及TGF-β蛋白的表達(dá)水平有關(guān)。

硫化氫；糖尿??；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β ；基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-1；基質(zhì)金屬蛋白酶-9

糖尿病腎小管間質(zhì)纖維化的發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β可刺激間質(zhì)細(xì)胞增殖及產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)，促進(jìn)ECM沉積，誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞合成ECM，是纖維化反應(yīng)的重要介質(zhì)〔1〕。腎小管間質(zhì)纖維化與基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-9/基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑(TIMP)-1的比例失調(diào)有關(guān)。Ⅳ型膠原是ECM的主要組成部分,MMP-9能特異性降解Ⅳ型膠原,對(duì)腎小管間質(zhì)纖維化有重要影響〔2〕；TIMP-1通過(guò)拮抗MMP-9發(fā)揮作用。硫化氫(H2S)是具有傳遞細(xì)胞信號(hào)功能的內(nèi)源性氣體遞質(zhì)，在糖尿病進(jìn)展過(guò)程中發(fā)揮較多生理效應(yīng)。本文采用單次腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)建立糖尿病動(dòng)物模型，觀察H2S對(duì)糖尿病大鼠模型腎小管間質(zhì)纖維化的影響以及對(duì)Ⅳ型膠原、TGF-β、MMP-9和TIMP-1蛋白表達(dá)水平的影響。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、試驗(yàn)試劑、儀器 成年雄性SD大鼠64只，體重(300±25)g，購(gòu)于南華大學(xué)動(dòng)物試驗(yàn)中心；STZ購(gòu)自美國(guó)MP Biomedicals Company，硫氫化鈉購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；TGF-β、MMP-9、TIMP-1及Ⅳ型膠原一抗購(gòu)自武漢博士德生物公司；鼠GAPDH單克隆抗體為廣州晶欣生物科技有限公司產(chǎn)品；HRP抗兔二抗為北京博奧森生物公司產(chǎn)品，細(xì)胞裂解液、BCA試劑盒來(lái)自中國(guó)碧云天生物技術(shù)公司。電泳儀、電泳槽、轉(zhuǎn)膜儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 分組及方法 將成年雄性SD大鼠先飼養(yǎng)1 w，恒溫環(huán)境，白天黑夜各12 h，自由進(jìn)食飲水，使其適應(yīng)環(huán)境。按體質(zhì)量隨機(jī)分為正常對(duì)照(Control)組、STZ組、STZ+H2S組及H2S組各16只；大鼠禁食12 h后，通過(guò)單次腹腔注射STZ(40 mg/kg)建造糖尿病動(dòng)物模型。為避免低血糖，24 h內(nèi)予以大鼠5%葡糖糖代替飲水；非糖尿病大鼠注射等量檸檬酸鈉；72 h后尾靜脈取血，測(cè)血糖>16.7 mmol/L為糖尿病動(dòng)物造模成功〔3〕。以硫氫化鈉作為外源性H2S供體予以STZ+H2S組和H2S組大鼠連續(xù)8 w每日腹腔注射100 μmol/kg，Control組和STZ組大鼠腹腔注射等量生理鹽水。8 w后以10%水合氯醛(350 mg/kg)腹腔注射進(jìn)行麻醉，剖開(kāi)腹腔取得腎臟標(biāo)本后用冰生理鹽水清潔沖洗，吸干水分，去除腎臟周?chē)M織包膜、血管，取適量組織于100 g/L多聚甲醛中固定24 h，余腎臟標(biāo)本保存待用。

1.2.2 Masson方法觀察大鼠腎臟組織膠原纖維染色 取以甲醛固定的4組大鼠腎臟組織；經(jīng)石蠟包埋,制成4～6 μm的切片；切片脫蠟后入5%鐵明礬水溶液固定24 h；先后用自來(lái)水和蒸餾水沖洗，用Regaud蘇木精染5～10 min；蒸餾水洗后入2.5%鐵明礬水溶液，待細(xì)胞核顯示清晰后流水洗10 min；入1%酸性復(fù)紅染10 min；蒸餾水沖洗后加入1%磷鉬酸水溶液分化3～5 min；加入含2.5%冰醋酸苯胺藍(lán)飽和水溶液；蒸餾水洗；1%冰醋酸浸洗5 min；梯度酒精脫水后透明封固。陽(yáng)性結(jié)果為膠原纖維呈藍(lán)色，細(xì)胞核藍(lán)褐色，胞質(zhì)、肌纖維呈紅色。

1.2.3 Western印跡檢測(cè)Ⅳ型膠原、MMP-9、TIMP-1及TGF-β表達(dá)水平 取4組大鼠新鮮腎臟標(biāo)本，以GAPDH為內(nèi)參；裂解細(xì)胞后提取蛋白，進(jìn)行BCA比色法蛋白定量；蛋白樣品100℃煮沸5 min促使變性；以5%濃縮膠、10%分離膠SDS-PAGE凝膠電泳。恒壓80 V電泳25 min，條帶電泳至分離膠上緣后調(diào)整為恒壓120 V、60 min；PVDF膜以甲醇浸泡5 min，置于轉(zhuǎn)移緩沖液浸泡5 min，采用濕轉(zhuǎn)法恒流200 mA、90 min，電轉(zhuǎn)至PVDF膜。室溫下以TBST配制的5%BSA搖床輕搖封閉1.5 h后，以Ⅳ型膠原、TGF-β、MMP-9、TIMP-1和GAPDH一抗(稀釋濃度均為1∶500，37℃脫色搖床輕搖孵育1 h后4℃冰箱過(guò)夜，然后室溫下以TBST(含20%Tween20)漂洗膜3次，10 min/次；用HRP標(biāo)記的二抗(稀釋度1∶4 000)37℃搖床孵育1 h，之后用TBST液漂洗3次；使ECL與膜作用1 min，化學(xué)發(fā)光顯色，以Image J軟件進(jìn)行圖像光密度分析，條帶灰度比值分別表示TGF-β、TIMP-1、MMP-9和Ⅳ型膠原蛋白含量表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS18.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中共死亡5只大鼠，其中STZ組2只，STZ+H2S組1只，H2S組2只，死亡原因推測(cè)為感染和糖尿病并發(fā)癥。

2.1 尿蛋白測(cè)定 實(shí)驗(yàn)第8周Control組尿蛋白(11.8±3.3)mg，STZ為(44.5±6.4)mg，STZ+H2S組為(26.6±6.1)mg，H2S組為(12.6±4.0)mg。與Control組相比，STZ組顯著增加(P<0.05)；與STZ組相比，STZ+H2S組明顯出現(xiàn)尿蛋白定量下降(P<0.05)。

2.2 大鼠腎臟Masson染色 Control組腎小管間質(zhì)僅可見(jiàn)少量藍(lán)色膠原纖維沉積；STZ組大鼠腎臟組織染色結(jié)果表明較多藍(lán)染的膠原纖維沉積，說(shuō)明存在明顯腎小管間質(zhì)纖維化；而STZ+H2S組腎小管間質(zhì)纖維化有所改善，大鼠腎臟組織藍(lán)染膠原纖維沉積程度減輕；H2S組大鼠腎臟藍(lán)染膠原纖維表達(dá)程度與Control組無(wú)明顯差異。見(jiàn)圖1。

圖1 各組腎組織Masson染色結(jié)果(×200)

2.3 Ⅳ型膠原表達(dá)水平 STZ組(1.19±0.016)大鼠腎臟組織Ⅳ型膠原蛋白表達(dá)水平與Control組(0.89±0.068)相比明顯上調(diào)(P<0.05)；與STZ組相比，H2S組(0.91±0.059)表達(dá)水平顯著下調(diào)(P<0.05)。而H2S組與Control組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。STZ+H2S組為(0.76±0.076)。見(jiàn)圖2。

2.4 TGF-β、TIMP-1和MMP-9蛋白在大鼠腎臟組織表達(dá)水平 STZ組與Control組相比，大鼠腎臟組織MMP-9蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào)〔STZ組(0.68±0.019),Control組(0.88±0.032)〕，TIMP-1〔STZ組(1.04±0.020)，Control組(0.83±0.015)〕及TGF-β〔STZ組(1.17±0.018)，Control組(1.01±0.005)〕蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào)(P<0.05)；STZ+H2S組TGF-β(0.85±0.015)和TIMP-1蛋白(0.84±0.053)表達(dá)水平較STZ組均有明顯下調(diào)(P<0.05)，而MMP-9蛋白表達(dá)水平則表現(xiàn)為明顯上調(diào)(0.94±0.059)。H2S組〔MMP-9(0.88±0.005),TGF-β：(0.99±0.036)，TIMP-1：(1.08±0.007)〕大鼠腎臟組織各蛋白表達(dá)水平與Control組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。見(jiàn)圖2。

圖2 Ⅳ型膠原、TGF-β、TIMP-1和MMP-9蛋白表達(dá)水平

3 討 論

腎小管間質(zhì)纖維化與腎臟終末期疾病具有明確的相關(guān)性，是導(dǎo)致糖尿病腎衰竭的重要病理改變；成纖維細(xì)胞是主要的介導(dǎo)腎小管間質(zhì)纖維化的效應(yīng)細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路如何導(dǎo)致間質(zhì)纖維化很大程度上仍然未知。目前，TGF-β被認(rèn)為是與組織纖維化關(guān)系密切的細(xì)胞因子，在組織纖維化的進(jìn)展中發(fā)揮關(guān)鍵性的作用，TGF-β可誘導(dǎo)刺激成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化、趨化炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、增加ECM合成，此外還可抑制降解ECM的蛋白酶活性，通過(guò)抑制MMPs的表達(dá)和誘導(dǎo)TIMPs的合成，抑制ECM降解〔4〕。TGF-β還能直接誘導(dǎo)TIMP-1基因表達(dá)，從而介導(dǎo)細(xì)胞因子的致纖維化作用〔5〕。Campistol等〔6〕表明，血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑(ARB)正是通過(guò)減少TGF-β的合成和分泌途徑預(yù)防腎間質(zhì)纖維化。糖尿病患者ECM過(guò)多沉積和分解減少與腎小管間質(zhì)纖維化也有密切相關(guān)，MMP-9及TIMP-1是調(diào)節(jié)基質(zhì)降解的重要因子。腎小管間質(zhì)纖維化程度與萎縮的腎小管細(xì)胞核內(nèi)MMP-9的表達(dá)水平呈正相關(guān)，MMP-9可阻礙腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，調(diào)節(jié)腎小管間質(zhì)纖維化并保護(hù)腎小管基底膜和減少ECM的表達(dá)〔7〕。

本試驗(yàn)結(jié)果提示腎小管間質(zhì)纖維化可能與TGF-β增多及其介導(dǎo)的MMP-9/TIMP-1失調(diào)有關(guān)；糖尿病時(shí)腎臟組織TGF-β表達(dá)水平上升和MMP-9/TIMP-1蛋白表達(dá)比例失調(diào)可能是導(dǎo)致腎小管ECM沉積乃至腎小管間質(zhì)纖維化的重要原因。TGF-β表達(dá)上調(diào)可能是糖尿病進(jìn)展過(guò)程中影響MMP-9/TIMP-1失調(diào)和ECM降解異常的一個(gè)重要機(jī)制〔8〕。

H2S是新發(fā)現(xiàn)的第三類(lèi)氣體信號(hào)分子〔9〕，研究表明H2S是高效的細(xì)胞色素C氧化酶抑制劑，其抑制作用具有可逆性；另有研究證實(shí)H2S對(duì)機(jī)體新陳代謝具有意義深遠(yuǎn)的影響〔10〕，對(duì)腎臟具有保護(hù)作用。新型信號(hào)分子的發(fā)現(xiàn)最終可能形成新的治療策略，延緩腎臟疾病進(jìn)展。有研究顯示,H2S能改善腎小管間質(zhì)纖維化，其機(jī)制與調(diào)節(jié)TGF-β蛋白的表達(dá)水平有關(guān)。本研究提示H2S具有減輕糖尿病大鼠腎小管間質(zhì)纖維化的治療作用。H2S可抑制TIMP-1表達(dá)、增加MMP-9表達(dá)，顯著改善兩者之間的比例失調(diào)，這種作用很可能是通過(guò)抑制TGF-β的表達(dá)來(lái)完成的。H2S能改善腎小管間質(zhì)纖維化，其作用可能與逆轉(zhuǎn)MMP-9/TIMP-1蛋白表達(dá)比例失調(diào)有關(guān)，而且H2S還具有直接抑制TGF-β蛋白表達(dá)、改善腎小管間質(zhì)纖維化的作用。這些結(jié)果表明，H2S可能是治療腎小管間質(zhì)纖維化的有前景的選擇性治療方法；而H2S逆轉(zhuǎn)TGF-β介導(dǎo)的MMP-9/TIMP-1失調(diào)、改善腎小管間質(zhì)纖維化的內(nèi)部信號(hào)調(diào)控機(jī)制，以及未來(lái)的臨床應(yīng)用前景仍有待進(jìn)一步研究。

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9 肖 婷，羅 健，吳志雄，等.硫化氫對(duì)糖尿病大鼠心肌纖維化及CX40 和CX45 表達(dá)的影響〔J〕．中國(guó)老年學(xué)雜志，2015;35(11):6025-7.

10 Blackstone E,Roth MB.H2S induces a suspended animation-like state in mice〔J〕.Science,2005;308(5721):518.

〔2016-04-27修回〕

(編輯 滕欣航)

Hydrogen sulfide alleviates renal fibrosis in diabetic rats through TGF-β, MMP-9 and TIMP-1 signaling pathway

LI Zi-Ning, LIANG Biao, LIU Mao-Jun,etal.

Department of Cardiology, the First Affiliated Hospital of South China University，Hengyang 421001，Hunan，China

Objective To explore the effects of hydrogen sulfide on glomerular fibrosis in diabetic rats and the expressions of TGF-β, MMP-9 and TIMP-1.Methods 64 adult male SD rats were randomly divided into control, streptozotocin(STZ), diabetic rats with H2S treatment (STZ+H2S) and normal rats with H2S treatment (H2S) groups.Diabetes mellitus was induced by the intraperitoneal injection of STZ. After the model was established successfully,the rats in STZ+H2S and H2S groups were given daily intraperitoneal injections of NaSH(100 μmol/kg)，while the rats in control and STZ groups were given saline.After 8 weeks,the pathologies of renal interstitial fibrosis were examined by Massion staining, and the expressions of CollagenⅣ, TGF-β, MMP-9 and MMP-1 were analyzed by Western blot.Results Compared with those of control group,the rats in STZ group showed obvious glomerular fibrosis in the nephridial tissue with significantly increased expression levels of CollagenⅣ, TGF-β and TIMP1 and decreased expression level of MMP9(P<0.05), while changes in STZ+H2S group were significantly reversed(P<0.05).Conclusions Hydrogen sulfide could alleviate glomerular fibrosis in diabetic rats,and the mechanism might involve the regulation of MMP-9/TIMP-1 imbalance and the level of TGF-β protein expression.

Hydrogen sulfide; Diabetes；TGF-β ；TIMP-1；MMP-9

國(guó)家自然科學(xué)基金(No.81270181)

楊 軍(1972-)，男，博士，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，教授，主要從事心血管疾病研究。

李子寧(1978-)，男，碩士，主治醫(yī)師，主要從事心肌重構(gòu)與冠心病研究。

R587.1

A

1005-9202(2017)03-0544-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.03.010

1 南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院藥劑科