氨基端前B型鈉尿肽單克隆抗體的制備及其鑒定

諶海蘭 陳 特 畢小云

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科,重慶 400016)

氨基端前B型鈉尿肽單克隆抗體的制備及其鑒定

諶海蘭 陳 特 畢小云

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科,重慶 400016)

目的 通過(guò)經(jīng)典單克隆抗體制備技術(shù)制備氨基端前B型鈉尿肽(NT-proBNP)單克隆抗體，將單克隆抗體進(jìn)行特異性和親和力鑒定，并用于免疫學(xué)檢測(cè)試劑盒的開(kāi)發(fā)。方法 用帶His-Trx-標(biāo)簽蛋白的NT-proBNP免疫Balb/C小鼠制備單克隆抗體。使用PEG1500化學(xué)融合法將小鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞SP2/0進(jìn)行融合。用不帶標(biāo)簽的NT-proBNP對(duì)獲取的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行反復(fù)多次克隆篩選，將穩(wěn)定分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞株經(jīng)腹腔注射Balb/C小鼠誘導(dǎo)產(chǎn)生腹水，經(jīng)蛋白G親和純化后獲得NT-proBNP單克隆抗體并對(duì)其進(jìn)行親和力和特異性進(jìn)行鑒定。結(jié)果 成功進(jìn)行細(xì)胞融合并獲得4株穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，抗體分泌亞型為IgG1，可特異性識(shí)別NT-proBNP。經(jīng)腹腔體內(nèi)誘生法和蛋白G親和純化，獲得高質(zhì)量NT-proBNP單克隆抗體，經(jīng)ELISA檢測(cè)抗體效價(jià)在1∶105以上。結(jié)論 通過(guò)傳統(tǒng)經(jīng)典單克隆抗體制備技術(shù)成功制備N(xiāo)T-proBNP單克隆抗體，為NT-proBNP檢測(cè)試劑盒的研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

氨基端前B型鈉尿肽；單克隆抗體；親和純化；心力衰竭

氨基端前B型鈉尿肽(NT-proBNP)與B型鈉尿肽(BNP)相比，具有半衰期更長(zhǎng)、分子量更大、無(wú)生物學(xué)活性等特性，臨床上將其用于心力衰竭、心肌梗死、急性冠脈綜合征等心血管疾病的早期診斷和鑒別診斷，也用于呼吸困難的鑒別診斷。目前NT-proBNP主要采用進(jìn)口羅氏公司的化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)，由于其試劑價(jià)格昂貴，臨床廣泛應(yīng)用受到極大的限制，開(kāi)發(fā)具有自主產(chǎn)權(quán)的國(guó)內(nèi)NT-proBNP檢測(cè)產(chǎn)品具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和社會(huì)前景。單克隆抗體由于其優(yōu)異的特異性，被廣泛地應(yīng)用于免疫學(xué)檢測(cè)當(dāng)中〔1〕。本實(shí)驗(yàn)前期通過(guò)分子克隆技術(shù)制備了帶Trx-His標(biāo)簽的NT-proBNP蛋白，用該蛋白免疫小鼠，并用獲取的高純度無(wú)標(biāo)簽的NT-proBNP〔2〕蛋白篩選雜交瘤細(xì)胞制備單克隆抗體，經(jīng)染色體計(jì)數(shù)分析，獲得多株可穩(wěn)定分泌抗體的單克隆細(xì)胞株，通過(guò)腹水誘生和親和純化獲得了高質(zhì)量的單克隆抗體，為NT-proBNP免疫學(xué)檢測(cè)試劑盒的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 胎牛血清(Hyclone 公司)；RPMI1640培養(yǎng)基(Hyclone 公司)；福氏佐劑、PEG1500(Roche公司)；8-AG、次黃嘌呤-氨基蝶呤-胸腺嘧啶核苷(HAT)、次黃嘌呤-胸腺嘧啶核苷(HT，Sigma公司)；單克隆抗體亞型鑒定試劑盒(Santa Cruz公司)；Sulfo-NHS-LC-Biotin(Sigma Aldrich 公司)；1 kD透析袋(生工生物)；HRP標(biāo)記的鏈霉親和素(博士德公司)；恒溫CO2孵箱(Thermo scientific 公司)；水平離心機(jī)(Thermo scentific 公司 )；普通光學(xué)顯微鏡、電子顯微鏡(Olympus 公司)；蛋白G親和純化柱、蛋白純化儀(KTA purifier)(GE公司)，Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒(碧云天公司)，酶標(biāo)儀(SUNRISE公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和細(xì)胞 Balb/C 雌性小鼠，SPF級(jí)別，6周齡(免疫)和4周齡(制備飼養(yǎng)細(xì)胞)，購(gòu)自重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心并于動(dòng)物中心處代養(yǎng)。SP2/0小鼠骨髓瘤細(xì)胞購(gòu)自上海生命科學(xué)研究所，由實(shí)驗(yàn)室傳代培養(yǎng)并經(jīng)返祖試驗(yàn)篩選獲得。

1.3 方法

1.3.1 NT-proBNP免疫小鼠 Balb/C雌性小鼠于免疫前采尾血測(cè)本底效價(jià)，選取無(wú)本底效價(jià)的小鼠進(jìn)行免疫。首次免疫：pet32a(+)-NT-proBNP重組帶標(biāo)簽的蛋白按150 μg/只免疫，蛋白與等體積完全福氏佐劑混合后，于4℃磁珠攪拌乳化至油包水樣，于SPF實(shí)驗(yàn)室中皮下多點(diǎn)免疫注射小鼠背部、腋窩、四肢、腹股溝。首次免疫后2 w進(jìn)行第二次免疫，劑量為100 μg/只，蛋白與不完全福氏佐劑乳化后于小鼠背部、腋窩、四肢、腹股溝，多點(diǎn)免疫。二次免疫后2 w進(jìn)行第三次免疫，方法、劑量同第二次。第三次免疫7 d后采小鼠尾血測(cè)效價(jià)。選取效價(jià)在106以上小鼠取脾融合。于融合前3 d對(duì)小鼠進(jìn)行沖擊免疫：選擇尾靜脈注射，100 μg/只。

1.3.2 SP2/0骨髓瘤細(xì)胞和飼養(yǎng)細(xì)胞的制備 SP2/0骨髓瘤細(xì)胞于融合前兩周用8-氮鳥(niǎo)嘌呤飼養(yǎng)3～7 d，觀(guān)察是否有返祖現(xiàn)象。融合后的雜交瘤細(xì)胞生長(zhǎng)所需生長(zhǎng)因子，選擇同品系2～4周齡Balb/C小鼠腹腔巨噬細(xì)胞提供。每只Balb/C 小鼠可鋪制2～4塊96孔板。方法：Balb/C 小鼠處死后，于75%酒精浸泡10 min徹底消毒，用大頭釘固定于解剖板，10 ml注射器吸取5～10 ml RPMI1640，緩慢注入小鼠腹腔，反復(fù)緩慢抽打幾次后吸出，注入10 ml離心管中，用RPMI1640，1 000 r/min，10 min洗滌2次，棄上清，用完全培養(yǎng)基重懸后細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度4×105/ml，巴氏吸管滴加入96孔培養(yǎng)板中，每孔150 μl。

1.3.3 SP2/0骨髓瘤細(xì)胞與脾細(xì)胞的融合 收集SP2/0骨髓瘤細(xì)胞，用RPMI1640，1 000 r/min，5 min洗滌兩次。將沖擊免疫過(guò)的小鼠從SPF動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心取出，取眼眶血離心分離血清作為以后篩選融合細(xì)胞的陽(yáng)性對(duì)照。將含1×108個(gè)脾細(xì)胞的細(xì)胞懸液和2×107個(gè)骨髓瘤細(xì)胞的細(xì)胞懸液(細(xì)胞數(shù)之比為5∶1)移至50 ml離心管中，補(bǔ)加不含血清RPMI1640培養(yǎng)基30 ml，1 200 r/min，10 min，棄上清，吸棄殘留液體，以免影響PEG1500濃度。食指輕彈離心管底使細(xì)胞沉淀松散。將離心管浸在預(yù)溫至37℃水的燒杯中，用1 ml刻度吸管吸取1 ml預(yù)溫至37℃的50% PEG1500溶液，在1 min之內(nèi)沿離心管壁慢慢加入，邊加邊輕輕攪拌均勻，37℃水浴中作用30 s。1 min內(nèi)加入1 ml 37℃預(yù)溫的RPIM1640不完全培養(yǎng)基終止PEG1500作用，在3 min內(nèi)加入3 ml不含血清的RPIM1640不完全培養(yǎng)基，10 min內(nèi)緩慢加入10 ml RPIM1640不完全培養(yǎng)基。最后補(bǔ)加RPIM1640不完全培養(yǎng)基至30 ml，以水平離心機(jī)960 r/min，5 min離心，棄上清，加入HAT完全培養(yǎng)基重懸雜交瘤細(xì)胞。將融合雜交瘤細(xì)胞接種至10塊已鋪有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，50 μl/孔，37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)〔3〕。

1.3.4 雜交瘤細(xì)胞的篩選、克隆和亞克隆 融合后第3天開(kāi)始可以觀(guān)察細(xì)胞狀態(tài)，以后隔日觀(guān)察一次，到第5天可半量換液，以后每3～5 d用HAT選擇培養(yǎng)基半量換液。2 w后開(kāi)始用HT選擇培養(yǎng)基半量換液，4 w后用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。當(dāng)雜交瘤細(xì)胞鋪滿(mǎn)96孔板的1/3時(shí)，用不帶標(biāo)簽的NT-proBNP包被96孔酶標(biāo)板，ELISA篩選獲得陽(yáng)性融合雜交瘤細(xì)胞株并進(jìn)行克隆。當(dāng)96孔板中單克隆細(xì)胞長(zhǎng)至孔底1/3時(shí)繼續(xù)進(jìn)行ELISA篩選并進(jìn)行陽(yáng)性細(xì)胞株亞克隆，反復(fù)篩選得到持續(xù)分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞株。將持續(xù)分泌抗體的細(xì)胞株存入液氮，以后每3個(gè)月進(jìn)行復(fù)蘇-凍存循環(huán)，檢測(cè)抗體分泌情況，反復(fù)3次，最終確定穩(wěn)定分泌抗體的細(xì)胞株。

1.3.5 雜交瘤細(xì)胞染色體計(jì)數(shù) 陽(yáng)性克隆雜交瘤細(xì)胞，采用染色體計(jì)數(shù)可確定融合是否成功〔4〕。Balb/C 小鼠有40條染色體，SP2/0骨髓瘤細(xì)胞有62～68條，融合成功的雜交瘤細(xì)胞有染色體共102～108條。

1.3.6 雜交瘤細(xì)胞誘生小鼠腹水 選取2～3個(gè)月齡同品系Balb/C雌性小鼠制備腹水。注射細(xì)胞前7 d采用不完全福氏佐劑300 μl/只腹腔注射，以激發(fā)小鼠處于反應(yīng)狀態(tài)。調(diào)整8E8雜交瘤細(xì)胞濃度至1×106/ml，500 μl/只進(jìn)行注射。注射后7 d左右開(kāi)始產(chǎn)生腹水，用5 ml注射器針頭收集腹水。腹水離心：3 000 r/min，10 min，留取上清，棄去沉淀和脂質(zhì)成分，離心2次，-20℃保存。

1.3.7 單克隆抗體的純化 4℃解凍8E8細(xì)胞株腹水，0.22 μm濾膜過(guò)濾，用無(wú)菌PBS將腹水稀釋5～10倍，蛋白G親和純化柱用PBS平衡至基線(xiàn)后，以1 ml/min緩慢上樣稀釋后的腹水，單克隆抗體特異性結(jié)合于親和純化柱上，上樣完后以PBS平衡親和純化柱至基線(xiàn)，再用pH2.7的100 mmol/L甘氨酸洗脫結(jié)合于親和柱上的抗體，在收集到的抗體洗脫液中加入適量pH9.0的1 mol/L Tris平衡液體，以防止抗體蛋白沉淀，用分子量5 000的超濾膜濃縮洗脫抗體后用Bradford測(cè)抗體濃度，分裝后-20℃保存。

1.3.8 單克隆抗體效價(jià)測(cè)定及亞型鑒定 ELISA反應(yīng)板中包被無(wú)標(biāo)簽的NT-proBNP，加入純化后的單克隆抗體共同孵育，洗滌后再加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗，二抗IgG亞型分別有IgG1、IgG2a、IgG2b、 IgG3，鑒定單克隆抗體的亞型。將純化并濃縮后得到的抗體用PBS倍比稀釋測(cè)定抗體效價(jià)。

1.3.9 單克隆抗體的Western印跡鑒定 將純化后的8E8單克隆抗體用Western印跡檢測(cè)抗體特異性，分別與pet32a(+)Trx-His蛋白、pet32a(+)-NT-proBNP、NT-proBNP反應(yīng)，結(jié)果顯示：純化后的8E8單克隆抗體與Trx-His標(biāo)簽蛋白不結(jié)合，與pet32a(+)NT-proBNP和NT-proBNP均為陽(yáng)性反應(yīng)，證明8E8單克隆抗體具有較好的特異性。

1.3.10 單克隆抗體的方法學(xué)驗(yàn)證 將蛋白G親和純化后的8E8 NT-proBNP單克隆抗體用生物素進(jìn)行標(biāo)記，用NT-proBNP多克隆抗體包被96孔酶標(biāo)板，進(jìn)行雙抗體夾心反應(yīng)，以HRP標(biāo)記的鏈霉親和素進(jìn)行顯色，對(duì)免疫學(xué)檢測(cè)方法的建立進(jìn)行初步摸索，尋找最適多抗包被濃度和最優(yōu)單抗反應(yīng)濃度。同時(shí)尋找其他影響雙抗夾心反應(yīng)的最適反應(yīng)條件。多克隆抗體使用前用PBS充分透析，分裝后-40℃保存。單克隆抗體生物素標(biāo)記前應(yīng)將純化后的單克隆抗體用pH9.5的碳酸鹽透析液充分透析以去除純化過(guò)程中帶入的Tris和甘氨酸等物質(zhì)，生物素標(biāo)記單抗的方法詳見(jiàn)Sigma Aldrich (H1759)說(shuō)明書(shū)。標(biāo)記后的生物素化單克隆抗體需用1 kD孔徑的生物透析袋4℃對(duì)PBS磁珠攪拌透析，每3～4 h換一次透析液，直至將游離的生物素完全透析除去為止，以Bradford測(cè)標(biāo)記后的抗體-生物素蛋白濃度，分裝后-40℃保存。

2 結(jié) 果

2.1 免疫小鼠效價(jià)測(cè)定 Balb/C小鼠免疫前經(jīng)ELISA檢測(cè)未檢測(cè)到本底效價(jià)，經(jīng)三次皮下免疫及一次尾靜脈加強(qiáng)免疫后做細(xì)胞融合，融合時(shí)取眼眶血測(cè)效價(jià)，兩只小鼠融合時(shí)抗體效價(jià)分別為1號(hào)：4.8×106，2號(hào)：2.4×106，均達(dá)到細(xì)胞融合要求。

圖1 雜交瘤細(xì)胞染色體計(jì)數(shù)(×40)

2.2 雜交瘤細(xì)胞染色體計(jì)數(shù) 融合成功的細(xì)胞經(jīng)純蛋白篩選后獲得4株穩(wěn)定分泌抗體的細(xì)胞株分別為：1F7、1B11、5E5和8E8。取亞克隆三次的單克隆細(xì)胞株染色體計(jì)數(shù)，在油鏡下觀(guān)察1F7、1B11、5E5和8E8并計(jì)數(shù)(圖1)，可見(jiàn)四株細(xì)胞染色體計(jì)數(shù)都在100條以上(骨髓瘤細(xì)胞染色體為62～68條，Balb/C小鼠脾細(xì)胞染色體為40條)，證明細(xì)胞融合成功。

2.3 雜交瘤細(xì)胞抗體亞型鑒定 反復(fù)克隆多次的雜交瘤細(xì)胞株經(jīng)ELISA鑒定抗體亞型，450 nm測(cè)吸光度，可見(jiàn)四株細(xì)胞亞型均為IgG1，見(jiàn)表1，證明細(xì)胞已達(dá)到較好的單克隆狀態(tài)，成功獲得NT-proBNP單克隆細(xì)胞株。

表1 單克隆抗體亞型鑒定

2.4 單克隆抗體的純化 將8E8單克隆細(xì)胞株雜交瘤細(xì)胞腹腔注射Balb/C小鼠，獲取的腹水經(jīng)蛋白G親和純化法純化單克隆抗體，在GE AKTA Purifier，UV 280 nm監(jiān)測(cè)下可見(jiàn)一個(gè)明顯的單克隆抗體蛋白峰，見(jiàn)圖2。獲得的單克隆抗體經(jīng)SDS-PAGE鑒定，可見(jiàn)κ鏈位于55 kD，λ鏈位于25 kD處，純度可達(dá)95%以上，見(jiàn)圖3。

A：穿透峰；B：?jiǎn)慰寺】贵w洗脫峰圖2 單克隆抗體親和純化圖

圖3 單克隆抗體SDS-PAGE鑒定

2.5 免疫印跡鑒定單克隆抗體特異性 經(jīng)蛋白G親和純化后的8E8單克隆抗體以1∶100稀釋用于單克隆抗體的特異性鑒定，可見(jiàn)，8E8單克隆抗體與pet32a(+)NT-proBNP和NT-proBNP蛋白有特異性反應(yīng)，與pet32a(+)Trx-His標(biāo)簽蛋白無(wú)反應(yīng)，表明單克隆抗體具有較好的特異性，見(jiàn)圖4。經(jīng)ELISA檢測(cè)親和純化后的單克隆抗體親和力，效價(jià)在1∶105以上。

2.6 單克隆抗體的方法學(xué)驗(yàn)證 建立免疫學(xué)檢測(cè)方法，首先對(duì)封閉液的封閉效果進(jìn)行了優(yōu)化，分別采用了2%BSA，5%BSA，10%BSA，2.5%BSA+100 μg/ml salmon DNA，5%BSA+100 μg/ml salmon DNA，結(jié)果顯示在2.5%BSA+100 μg/ml salmon DNA時(shí)封閉效果最好，背景本底最低。

多克隆抗體以不同濃度梯度(10、5.0、2.5、1.25、1.0、0.625 μg/ml)以磷酸鹽緩沖液100 μl/孔，在4℃包被過(guò)夜，以不同濃度的生物素標(biāo)記的8E8單克隆抗體濃度(10、5.0、2.5、1.25、0.625、0.312 5、0.156 μg/ml)，以棋盤(pán)法尋找最優(yōu)生物素標(biāo)記單克隆抗體與多克隆抗體的反應(yīng)濃度，由表2可見(jiàn)，最適多克隆抗體包被濃度為1.25 μg/ml，最適生物素標(biāo)記單克隆抗體濃度為0.312 5 μg/ml。通過(guò)不同濃度的HRP標(biāo)記的親和素，以及不同濃度的TMB顯色劑，也是通過(guò)棋盤(pán)法來(lái)尋找最優(yōu)的反應(yīng)濃度，結(jié)果顯示在設(shè)定顯色反應(yīng)時(shí)間為25 min時(shí)：在親和素-HRP稀釋濃度為1∶8 000，TMB使用濃度為1∶400時(shí)，二者反應(yīng)比例最好，顯色最深。

1:NT-proBNP；2:pet32a(+)NT-proBNP；3:pet32a(+) 標(biāo)簽蛋白；M：Marker圖4 單克隆抗體免疫印跡鑒定抗體特異性表2 多克隆抗體濃度和生物素標(biāo)記單克隆抗體 濃度的優(yōu)化(μg/ml)

包被多克隆抗體(μg/ml)52.51.250.6250.31250.16551.7621.8371.7291.391.1681.2812.51.9362.141.9861.8641.8961.8361.252.0361.982.0511.8442.1511.8341.02.0661.9461.9851.8781.891.8320.50.4660.6010.3880.2320.1770.179

3 討 論

本研究前期構(gòu)建了質(zhì)粒pet32a(+)NT-proBNP，獲得了帶Trx-His標(biāo)簽的NT-proBNP，由于NT-proBNP分子量小，為提高其免疫原性，本實(shí)驗(yàn)用帶Trx-His標(biāo)簽的NT-proBNP蛋白作為免疫原免疫小鼠，為了排除針對(duì)標(biāo)簽抗體的單克隆抗體，篩選時(shí)用無(wú)標(biāo)簽NT-proBNP篩選單克隆細(xì)胞株。本研究通過(guò)經(jīng)典雜交瘤技術(shù)獲得了NT-proBNP雜交瘤細(xì)胞并對(duì)其進(jìn)行了亞型分析，通過(guò)腹水誘生法制備了NT-proBNP單克隆抗體，使用蛋白柱親和層析純化的方法得到了高純度的單克隆抗體，鑒定了單克隆抗體的特異性。一株好的單克隆抗體不僅需要具有高的特異性還要求具有高的親和力，本研究獲得的單克隆抗體效價(jià)在105左右，可以滿(mǎn)足科研檢測(cè)的需要，需要獲得更高效價(jià)的單克隆抗體，可以通過(guò)低溫超濾濃縮，或通過(guò)提高抗體純化技術(shù)得到更高效價(jià)的單克隆抗體。本研究成功獲得NT-proBNP的優(yōu)質(zhì)抗原、高質(zhì)量多克隆抗體和優(yōu)質(zhì)單克隆抗體，通過(guò)初步試驗(yàn)證明該抗原、多克隆抗體、單克隆抗體可以有效結(jié)合反應(yīng)，為下一步研發(fā)NT-proBNP的免疫學(xué)檢測(cè)試劑盒奠定了基礎(chǔ)。NT-proBNP作為公認(rèn)有效的診斷心力衰竭，以及鑒別診斷心衰的指標(biāo)，應(yīng)用越來(lái)越受到推崇，但是，目前NT-proBNP電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒仍然需要從國(guó)外進(jìn)口，價(jià)格非常昂貴〔5～9〕。國(guó)內(nèi)市場(chǎng)開(kāi)發(fā)出了一些試劑盒，但其檢測(cè)方法多為金標(biāo)法，其靈敏度還較低，不能滿(mǎn)足臨床醫(yī)生對(duì)診斷的需求。NT-proBNP的電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)最核心的技術(shù)是其單克隆抗體的獲得，其效價(jià)、純度的優(yōu)劣直接關(guān)系到產(chǎn)品的質(zhì)量，國(guó)內(nèi)市場(chǎng)要在這方面取得突破，還需加大研發(fā)力度以獲得高質(zhì)量的單抗。

1 曹雪濤.免疫學(xué)研究的發(fā)展趨勢(shì)及我國(guó)免疫學(xué)研究的現(xiàn)狀與展望〔J〕.中國(guó)免疫學(xué)雜志，2009;25(1)：10-23.

2 諶海蘭，陳 曦，徐繡宇，等.無(wú)標(biāo)簽NT-proBNP重組蛋白的獲得及多克隆抗體的制備〔J〕.臨床檢驗(yàn)雜志，2012;30(11)：902-5.

3 Chinen J，Shearer WT.Advances in basic and clinical immunology in 2010〔J〕.Allerg Clin Immunol，2011；127(2)：336-41.

4 Januzzi JL Jr,Chen-Tournoux AA,Moe G.Amino-terminal pro-B-type natriuretic peptide testing for the diagnosis or exclusion of heart failure in patients with acute symptoms〔J〕.Am J Cardiol,2008；101(3A)：29-38.

5 Gaggin HK，Januzzi Jr JL.Biomarkers and diagnostics in heart failure〔J〕.Biochim Biophys Acta，2013；1832(12)：2442-50.

6 Popcel JM，Bielsa S.Comparison of pleural N-terminal pro-B-type natriuretic peptide，midregion pro-atrial natriuretic peptide and mid-region pro-adrenomedullin for the diagnosis of pleural effusions associated with cardiac failure〔J〕.Respirology，2013；18(3)：540-5.

7 Zhou Q，Ye ZJ，Su Y.Diagnostic value of N-terminal pro-brain natriuretic peptide for pleural effusion due to heart failure：a meta-analysis〔J〕.Heart，2010；96(15)：1207-11.

8 Alehagen U，Dahlstr U,Rehfeld JF,etal.ProeA-type natriuretic peptide，proadrenomedullin and N-Terminal proeB-type natriuretic peptide used in a multimarker strategy in primary health care in risk assessment of patients with symptoms of heart failure〔J〕.J Cardiac Fail，2013；19(1)：31-9.

9 Huntley BK，Sandberg SM，Heublein DM.ProBNP1-108 processing and degradation in human heart failure〔J〕.Circ Heart Fail,2014;8(1):17-9.

〔2015-08-11修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢(mèng)園)

Preparation and identification of monoclonal antibody against NT-proBNP

CHEN Hai-Lan, CHEN Te, BI Xiao-Yun.

Department of Laboratory, the First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing 400016, China

Objective To make monoclonal antibody of N-terminal pro-B-type natriuretic peptide (NT-proBNP) with traditional chemical fusion and cloning screens technique, identify the specificity and affinity, provide a foothold for constructing immunological test kit with this acquired antibodies for NT-proBNP.Methods Chemical fusion technique was used to get hybridoma of NT-proBNP. Hybridomas were identified with chromosome dyeing counting. Monoclonal antibodies of NT-proBNP were acquired by peritoneal injection hybridomas in Balb/C mouses. Monoclonal antibodies of 8E8 were purified by protein G affinity purification in GE AKTA Purifier. SDS-PAGE identified the purity quotient of it. The affinity was identified with ELISA, and Western blot was used to identify the specificity of this antibodies.Results Chromosome dyeing counting proved that hybridomas were prepared successfully. Four hybridomas (1F7,1B11,5E5 and 8E8)steadily secreting NT-proBNP monoclonal antibody were screened out. The isotype of all the four hybridomas was IgG1. The titer of the 8E8 monoclonal antibody after purified with protein G affinity was above 105 with a good purity quotient up to 95%. Western blot showed that this antibody had a good conjugation with NT-proBNP.Conclusions The hybridomas persistent secreting monoclonal antibody against NT-proBNP are successfully prepared. This would be an outstanding experimental basis for NT-proBNP immunological kit construction.

NT-proBNP；Monoclonal antibody；Affinity purification；Heart failure

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31270984)

諶海蘭(1984-)，女，碩士，檢驗(yàn)技師，主要從事病原微生物學(xué)致病機(jī)制及體外診斷試劑研發(fā)研究。

R541.6

A

1005-9202(2017)03-0525-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.03.002