非結(jié)核分枝桿菌病實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)及藥敏試驗(yàn)研究進(jìn)展

郭明日,張麗霞

·綜述·

非結(jié)核分枝桿菌病實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)及藥敏試驗(yàn)研究進(jìn)展

郭明日1,2,張麗霞1,2

非結(jié)核分枝桿菌病； 藥敏試驗(yàn)； 診斷； 綜述

非結(jié)核分枝桿菌(non-tuberculous mycobacteria,NTM)是指結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群(結(jié)核分枝桿菌、牛分枝桿菌、非洲分枝桿菌和田鼠分枝桿菌)和麻風(fēng)分枝桿菌以外的其他分枝桿菌。隨著結(jié)核病疫情的有效控制，新的診斷技術(shù)水平不斷提高，更多的NTM感染被鑒定出，人們也重新認(rèn)識(shí)到NTM感染的重要性，確認(rèn)了NTM可感染肺部、皮膚、骨骼、淋巴結(jié)等組織和器官，由此導(dǎo)致相應(yīng)部位的非結(jié)核分枝桿菌病發(fā)生。我國2010年第五次全國結(jié)核病流行病學(xué)調(diào)查報(bào)告顯示NTM分離率明顯增加，從1990年的4.9%上升到2000年的11.1%，2010年的22.9%[1]，這表明我國的NTM感染率有明顯上升的趨勢。本文對(duì)NTM實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)以及NTM藥敏試驗(yàn)方面的研究和應(yīng)用作一綜述如下。

1 NTM的分類

迄今為止，已報(bào)道的非結(jié)核分枝桿菌(non-tuberculous mycobacteria,NTM)菌種有160余種，13個(gè)亞種，且種類仍在逐漸增加中[2]。伯杰系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)根據(jù)NTM的生長速度將其分為快速生長型和緩慢生長型，常見的快速生長分枝桿菌29種，緩慢生長分枝桿菌26種，其他分枝桿菌及亞種120余種[1],其中致病或條件致病菌種有50余種。Runyon分類法將NTM分為四群:Ⅰ群：光產(chǎn)色分枝桿菌，如猿猴分枝桿菌(M.simiae)、堪薩斯分枝桿菌(M.kansasii)等；Ⅱ群：暗產(chǎn)色分枝桿菌，如蘇加分枝桿菌(M.szulgal)、蟾蜍分枝桿菌(M.xenopi)、瘰疬分枝桿菌(M.scrofulaceum)、戈登分枝桿菌(M.gordonae)；Ⅲ群：不產(chǎn)色分枝桿菌，如鳥分枝桿菌復(fù)合群、瑪爾摩分枝桿菌(M.malmoense)、土地分枝桿菌(M.terrae)、潰瘍分枝桿菌(M.ulcerans)；Ⅳ群：快生長分枝桿菌,在3～5 d內(nèi)有肉眼可見的菌落，如偶然分枝桿菌(M.fortuitum)、龜分枝桿菌(M.chelonae)、膿腫分枝桿菌(M.abscessus)、恥垢分枝桿菌(M.smegmatis)。

2 NTM病的實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)

NTM病的確診有賴于實(shí)驗(yàn)室檢測出患者臨床標(biāo)本中存在非結(jié)核分枝桿菌，抗酸染色法無法鑒別NTM與結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群(mycobacterium tuberculosis,MTB)，因此需要對(duì)分枝桿菌進(jìn)行菌種鑒定。本文綜述了NTM鑒定的傳統(tǒng)方法和目前常用的幾種分子生物學(xué)鑒定方法。

2.1 NTM鑒定的傳統(tǒng)方法 經(jīng)抗酸染色鏡檢確定是抗酸菌的陽性菌株，接種于改良羅氏(L-J)培養(yǎng)基進(jìn)行增菌傳代。采用對(duì)硝基苯甲酸(PNB)生長試驗(yàn)、28℃生長試驗(yàn)、耐熱觸酶試驗(yàn)、觀察細(xì)菌生長速度、菌落形態(tài)和顏色確定屬于MTB或者NTM[1]。首先根據(jù)生長速度確定屬于快速生長分枝桿菌(≤7 d)或緩慢生長分枝桿菌(>7d)；根據(jù)PNB(500 μg/ml)生長試驗(yàn)區(qū)分為MTB(PNB培養(yǎng)基生長受抑制)或NTM(大多數(shù)NTM在一定濃度的PNB培養(yǎng)基有耐受性，可以生長)；此外，結(jié)合28℃生長試驗(yàn)(MTB不生長，NTM可以生長)、耐熱觸酶試驗(yàn)(MTB在68℃水浴20 min后不能分解過氧化氫，NTM則仍可分解過氧化氫而產(chǎn)生持續(xù)性小氣泡)也可對(duì)MTB和NTM進(jìn)行初步鑒定。

2.2 核酸測序鑒定 核酸測序技術(shù)基于同源基因或序列的差異來進(jìn)行菌種鑒定，是目前分枝桿菌鑒定技術(shù)中分辨率最高、結(jié)果最為可靠的技術(shù)。16S rRNA基因測序分析是分枝桿菌菌種鑒定的標(biāo)準(zhǔn)方法，但是由于一些NTM菌種在16S rRNA基因序列上非常相近甚至相同[3]，該基因序列在分枝桿菌屬內(nèi)的不同種之間多態(tài)性很低，因此，最近幾年已經(jīng)發(fā)展起采用分枝桿菌屬的16S rRNA，16S～23S rRNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔序列(internal transcribed spacer sequences,ITS)為靶基因進(jìn)行測序鑒定，其多態(tài)性明顯高于單獨(dú)采用16S rRNA基因測序[4]，根據(jù)測序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST比對(duì)得出菌種鑒定結(jié)果。YU等[4]在中國西南地區(qū)采用16S rRNA，16S～23S rRNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔序列基因?yàn)榘谢蜻M(jìn)行NTM測序鑒定，發(fā)現(xiàn)中國西南地區(qū)常見的NTM菌種依次為鳥-胞內(nèi)分枝桿菌(35.6%)、龜-膿腫分枝桿菌(32.6%)、偶然分枝桿菌(10.8%)、戈登分枝桿菌(5.9%)、堪薩斯分枝桿菌(1.9%)等，此外還首次在中國西南地區(qū)發(fā)現(xiàn)了1株Tsukamurella分枝桿菌。因此，16S rRNA和ITS序列作為菌種基因分型的一種輔助方法，為疑似NTM感染人群的診斷提供了一種新的策略與手段。

2.3 基因芯片鑒定 基因芯片技術(shù)采用DNA探針固化于支持物表面，然后與標(biāo)記的樣品進(jìn)行雜交，通過檢測雜交信號(hào)而對(duì)樣品中的核酸進(jìn)行快速、高通量檢測。目前市場上采用較多的是北京博奧生物公司推出的菌種鑒定試劑盒，可定性檢測疑似結(jié)核病或NTM病患者經(jīng)過分離培養(yǎng)的分枝桿菌分離株或直接來源于疑似患者的臨床樣本中的核酸，可鑒定常見的17個(gè)種或群，包括MTB、胞內(nèi)、鳥、戈登、堪薩斯、偶然、瘰疬、淺黃、土、龜/膿腫、草、不產(chǎn)色、海、潰瘍、金色、蘇爾加和瑪爾摩、蟾蜍、恥垢分枝桿菌，可用于MTB和NTM病的輔助診斷。其基本原理是將DNA探針固化于支持物表明，產(chǎn)生二維DNA探針陣列，與標(biāo)記的樣品進(jìn)行雜交，通過檢測雜交信號(hào)實(shí)現(xiàn)對(duì)生物樣品快速、并行、高通量檢測。國內(nèi)已有多篇文獻(xiàn)[5-7]報(bào)道了基因芯片法鑒定NTM菌種的臨床應(yīng)用情況，該方法可在6～8 h內(nèi)出具菌種鑒定結(jié)果，為患者得到合理化治療提供及時(shí)、準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

2.4 PCR-熒光探針法 本方法采用雙重實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)和TaqMan探針技術(shù)實(shí)現(xiàn)對(duì)分枝桿菌的檢測，分別針對(duì)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群和分枝桿菌的特異性序列設(shè)計(jì)引物和探針，兩個(gè)探針分別標(biāo)記不同的熒光發(fā)光基團(tuán)，通過檢測不同熒光通道的熒光信號(hào)變化來區(qū)分結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群和非結(jié)核分枝桿菌。有文獻(xiàn)顯示[8]采用PCR-熒光探針法對(duì)疑為結(jié)核病的石蠟包埋組織檢測結(jié)核分枝桿菌/非結(jié)核分枝桿菌，PCR-熒光探針法的陽性率51.50%高于抗酸染色法的31.00%和金胺O染色法的40.5%，有較高的敏感性和準(zhǔn)確性，可用于結(jié)核病/非結(jié)核分枝桿菌病的鑒別診斷。梁建琴等[9]使用該方法檢測1015例痰液，對(duì)于檢出的11例NTM核酸進(jìn)行16S rRNA測序確認(rèn)，準(zhǔn)確率100%；56株分離株樣本(1株MTB分離株，55株NTM分離株)檢測，準(zhǔn)確率100%。不過由于該檢測方法目前只能區(qū)分MTB和常見的NTM菌種，因此，存在一定的漏診風(fēng)險(xiǎn)。此外，如果樣本中混合有MTB和NTM時(shí)，僅能報(bào)告MTB核酸檢測陽性，且不能鑒定NTM的菌種。

2.5 線性探針雜交法鑒定 線性探針雜交法是將PCR擴(kuò)增、反向雜交、酶顯色技術(shù)合為一體，特異性引物擴(kuò)增目的基因片段，擴(kuò)增產(chǎn)物與膜上固定的特異性探針雜交，通過酶顯色反應(yīng)判讀結(jié)果。MTB的鑒定基于gyrB基因的SNPs和BCG的結(jié)核分枝桿菌基因組差異區(qū)1(region of difference,RD1)區(qū)域的差異，而NTM的鑒定是基于23S rRNA基因差異片段序列。目前德國Hain Lifescience公司生產(chǎn)的GenoType Mycobacterium CM/AS可以鑒定31種常見的NTM菌種，其中CM試劑盒可鑒定出15種常見的分枝桿菌菌種，AS可以鑒定出16種常見的非結(jié)核分枝桿菌菌種。檢測的樣本類型為臨床疑似結(jié)核病和NTM病患者經(jīng)過分離培養(yǎng)的分離株。Sookan等[10]利用GenoType Mycobacterium CM/AS對(duì)南非某省疑似為NTM的200例臨床樣本進(jìn)行了鑒定，檢出133例NTM，檢出率較高的分別是胞內(nèi)分枝桿菌(45.9%)、鳥分枝桿菌(11.3%)、戈登分枝桿菌(6.0%)、堪薩斯分枝桿菌(4.5%)。另有印度文獻(xiàn)報(bào)道[11]以PNB含藥培養(yǎng)基對(duì)MTB與NTM鑒別結(jié)果為參照，GenoType Mycobacterium CM/AS敏感度、特異度、分別為99.37%、98.33%。國內(nèi)文獻(xiàn)[12]報(bào)道采用HAIN公司線性探針雜交法鑒定NTM并與16S rRNA基因測序法比較，符合率100%，特異度100%。Rindi等[13]采用Hain公司的線性探針法鑒定了意大利某地區(qū)2004-2014年期間的147例NTM患者的培養(yǎng)物，發(fā)現(xiàn)NTM分離率以60歲以上的老年人(57.8%)為主，樣本分離率以呼吸道最常見(76.2%)，其次為淋巴結(jié)(10.9%)和血液(2.7%)。盡管HAIN鑒定NTM成本較高，但其快速、準(zhǔn)確、操作簡便等優(yōu)點(diǎn)值得其在臨床廣泛使用。

2.6 免疫學(xué)鑒定方法 分枝桿菌在生長過程中會(huì)分泌200余種蛋白，MPB64(Mycobacterial protein from BCG of Rm0.64 in electrophoresis)是在結(jié)核分枝桿菌的培養(yǎng)中分泌到菌體外的蛋白質(zhì)，也是分泌時(shí)間早、分泌量最多的蛋白，而非結(jié)核分枝桿菌則不分泌該蛋白，因此，通過檢測和鑒定MPB64可以鑒別MTB和NTM[14]。MPB64的檢測需要首先在液體培養(yǎng)基或者固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)出分枝桿菌，培養(yǎng)后的菌液采用MPB64抗原檢測試劑盒(膠體金法)進(jìn)行檢測，若質(zhì)控線(C)和檢測線(T)均出現(xiàn)紫紅色條帶，則為MPB64陽性，為MTB，若僅質(zhì)控線(C)出現(xiàn)紫紅色條帶，而檢測線(T)未出現(xiàn)，則為NTM。MPB64抗原膠體金法檢測需做好相關(guān)質(zhì)控，陽性質(zhì)控品采用BCG、牛分枝桿菌(ATCC93006)、結(jié)核分枝桿菌(ATCC93009)，陰性質(zhì)控采用鳥分枝桿菌(ATCC95001)、堪薩斯分枝桿菌(ATCC95013)。潘愛珍等[15]以PCR擴(kuò)增測序法為“金標(biāo)準(zhǔn)”，對(duì)MPB64免疫膠體金法和傳統(tǒng)PNB/TCH法對(duì)分枝桿菌菌種鑒定能力進(jìn)行了比較，結(jié)果顯示膠體金法與PCR測序法結(jié)果一致率分別是95.93%、87.08%，膠體金法和PNB/TCH法鑒定結(jié)核分枝桿菌的敏感度和特異度分別為88.41%、99.64%和62.32%、99.29%，膠體金法檢測所需時(shí)間為15min，優(yōu)于PNB/TCH法的28天，因此，MPB64膠體金法對(duì)分枝桿菌的鑒定具有快速、省時(shí)、操作方便的特點(diǎn)，值得在臨床推廣。

3 NTM藥敏試驗(yàn)

大多數(shù)NTM對(duì)常用的抗分枝桿菌藥物具有耐藥性[16-18]，目前采用的分枝桿菌藥敏試驗(yàn)，包括BACTEC MGIT960和羅氏培養(yǎng)基絕對(duì)濃度法或比例法藥敏試驗(yàn)所測藥物已不能滿足NTM病治療的需要。目前引起NTM病的菌種主要是Ⅰ群的堪薩斯分枝桿菌、Ⅱ群的鳥-胞內(nèi)分枝桿菌復(fù)合群(m.avium complex,MAC)、Ⅳ群的龜、膿腫分枝桿菌和偶然分枝桿菌，其中堪薩斯、MAC屬于緩慢生長分枝桿菌，龜、膿腫、偶然分枝桿菌屬于快速生長分枝桿菌。中華醫(yī)學(xué)會(huì)結(jié)核病學(xué)分會(huì)對(duì)于以上幾種常見的NTM病的藥敏試驗(yàn)給出了指導(dǎo)性意見[16]，包括未經(jīng)治療的MAC病患者，僅推薦進(jìn)行克拉霉素敏感性試驗(yàn)；對(duì)未經(jīng)治療的堪薩斯分枝桿菌病患者，僅需進(jìn)行利福平藥敏試驗(yàn)；對(duì)于快速生長分枝桿菌中的偶然、膿腫和龜分枝桿菌，常規(guī)藥敏試驗(yàn)應(yīng)包括阿米卡星、伊米配能(僅限于偶然分枝桿菌)、多西環(huán)素、氟喹喏酮類藥物、磺胺類藥物或復(fù)方磺胺甲嗯唑、頭孢西丁、克拉霉素、利奈唑胺和妥布霉素等。目前對(duì)很多NTM菌種感染后引起的疾病知之甚少，部分NTM菌種的藥敏試驗(yàn)需求較少，因此，針對(duì)NTM的藥敏試驗(yàn)尚沒有通用指南，下面結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道對(duì)幾種臨床常見的NTM菌種感染所需的藥敏試驗(yàn)進(jìn)行綜述。

3.1 鳥-胞內(nèi)分枝桿菌(MAC)藥敏試驗(yàn) 由于MAC對(duì)目前常用的幾種抗結(jié)核藥不敏感或耐藥，對(duì)異煙肼和吡嗪酰胺天然耐藥，而對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類藥物敏感，美國FDA批準(zhǔn)將阿奇霉素和克拉霉素用于MAC病的治療，但需要連用其他1～2種抗生素(乙胺丁醇和利福平)。美國第九版《臨床微生物手冊(cè)》推薦使用微量肉湯稀釋法進(jìn)行MAC對(duì)克拉霉素的藥敏試驗(yàn)，使用改良羅氏培養(yǎng)基上的培養(yǎng)產(chǎn)物進(jìn)行，具體操作步驟參見文獻(xiàn)報(bào)道[1]?？死顾厮幟粼囼?yàn)濃度(μg/mL)使用2～64，當(dāng)≤4為敏感，8～16為中介，≥32為耐藥，鳥分枝桿菌作為質(zhì)控菌株，濃度(μg/mL)使用0.5、1和2。關(guān)于阿奇霉素的藥敏試驗(yàn)，CLSI(臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì))推薦使用BACTEC 12B培養(yǎng)基的大量肉湯稀釋法，濃度(μg/mL)使用16～512或32,128和512，當(dāng)≤128為敏感，256為中介，≥512為耐藥，鳥分枝桿菌作為質(zhì)控菌株，濃度(μg/mL)使用8、16和32。CLSI建議僅做克拉霉素或阿奇霉素中的一種藥敏試驗(yàn)即可，互相可預(yù)測另一種藥物的敏感性。文獻(xiàn)[17]顯示鳥-胞內(nèi)分枝桿菌復(fù)合群對(duì)克拉霉素的耐藥率為11.36%，利福平耐藥率為95.45%，利福噴汀耐藥率29.55%，阿米卡星耐藥率43.18%，

3.2 堪薩斯分枝桿菌藥敏試驗(yàn) 中華醫(yī)學(xué)會(huì)結(jié)核病學(xué)分會(huì)專家共識(shí)(簡稱“專家共識(shí)”)推薦，對(duì)未經(jīng)治療的堪薩斯分枝桿菌病患者，僅需進(jìn)行利福平藥敏試驗(yàn)，若利福平耐藥，即要使用微量肉湯稀釋法進(jìn)行多種抗結(jié)核藥物敏感試驗(yàn)[16]。目前推薦如下八種藥物進(jìn)行藥敏試驗(yàn)：利福布汀、乙胺丁醇、異煙肼、鏈霉素、克拉霉素、阿米卡星、環(huán)丙沙星、甲氧嘧啶-新諾明或新諾明[13]，堪薩斯分枝桿菌(ATCC12478)或海分枝桿菌(ATCC927)用于堪薩斯分枝桿菌對(duì)利福平藥敏試驗(yàn)的質(zhì)控菌株。

3.3 海分枝桿菌藥敏試驗(yàn) 目前海分枝桿菌(Mycobacterium marinum)病的治療常使用利福平、利福布汀、乙胺丁醇、克拉霉素、磺胺類藥物、多西環(huán)素、米諾環(huán)素等單一藥物治療或1～2種藥物聯(lián)用。由于海分枝桿菌對(duì)上述藥物的MIC范圍較窄，因此“專家共識(shí)”推薦海分枝桿菌分離株不需進(jìn)行常規(guī)藥敏試驗(yàn)，但治療失敗患者例外[16]。Peter等[19]采用肉湯微量稀釋法藥敏試驗(yàn)研究了利福平、阿米卡星、克拉霉素、莫西沙星、鏈霉素五種藥物間不同藥物組合對(duì)海分枝桿菌的殺菌效果，發(fā)現(xiàn)利福平和阿米卡星藥物組合殺菌效果最好，鏈霉素和克拉霉素藥物組合最差。該文獻(xiàn)還推薦使用海分枝桿菌作為耐多藥結(jié)核病的研究模型，用于藥敏試驗(yàn)研究。

3.4 快速生長分枝桿菌藥敏試驗(yàn) 臨床上快速生長分枝桿菌感染所致疾病中主要以龜、膿腫、偶然分枝桿菌為常見，“專家共識(shí)”推薦常規(guī)藥敏試驗(yàn)應(yīng)包括阿米卡星、伊米配能、多西環(huán)素、氟喹諾酮類藥物、磺胺類、頭孢西丁、克拉霉素、利奈唑胺和妥布霉素。采用微量肉湯稀釋法進(jìn)行常用幾種藥物的敏感試驗(yàn)，結(jié)果以MIC值報(bào)告，藥物濃度及具體步驟參見文獻(xiàn)報(bào)道[1],對(duì)于結(jié)果的報(bào)告，由于亞胺培南不穩(wěn)定，龜和膿腫分枝桿菌需要長時(shí)間孵育，因此這2個(gè)菌種的藥敏不報(bào)告亞胺培南結(jié)果，CLSI推薦妥布霉素僅用來做龜分枝桿菌藥敏試驗(yàn)。對(duì)于其他快速生長分枝桿菌的藥敏試驗(yàn)可參照龜、膿腫、偶然分枝桿菌的方法，若患者在規(guī)范治療半年后，分枝桿菌培養(yǎng)仍為陽性則考慮需重新進(jìn)行NTM的藥敏試驗(yàn)。目前關(guān)于快速生長分枝桿菌藥敏試驗(yàn)的質(zhì)量控制，推薦使用外來分枝桿菌(M.peregrinum)(ATCC700686)作為質(zhì)控菌株或金黃色葡萄球菌(ATCC29213)作為替代。文獻(xiàn)[17]報(bào)道快速生長分枝桿菌群對(duì)阿米卡星和克拉霉素的耐藥率分別為62.07%和12.07%，其中龜分枝桿菌對(duì)阿米卡星和克拉霉素耐藥率分別為57.41%和9.26%，膿腫分枝桿菌對(duì)阿米卡星和克拉霉素耐藥率分別為70.00%和10.00%。

綜上所述，近些年來耐多藥結(jié)核病以及HIV感染者合并結(jié)核病患者數(shù)量有增加的趨勢，這也導(dǎo)致結(jié)核病人的免疫力下降，更易于感染NTM。結(jié)核病與NTM病臨床特征相似，但治療差異甚大，實(shí)驗(yàn)室快速、準(zhǔn)確地診斷出MTB和NTM對(duì)于臨床治療結(jié)核病與非結(jié)核分枝桿菌病至關(guān)重要。因此推薦有條件的實(shí)驗(yàn)室對(duì)NTM進(jìn)行分型檢測，這對(duì)制定合理的治療方案非常關(guān)鍵。NTM主要損害肺部，多數(shù)NTM對(duì)抗結(jié)核藥物耐藥，緩慢生長型和快速生長型NTM臨床治療用藥存在差異，盡管還沒有標(biāo)準(zhǔn)的藥敏試驗(yàn)方法，但NTM治療前仍有必要進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，依據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果及時(shí)調(diào)整用藥方案?？傊?，對(duì)NIM進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的分型診斷和有效的藥敏試驗(yàn)，不論是對(duì)治療非結(jié)核分枝桿菌病或是控制結(jié)核病疫情都是十分迫切的。

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天津市衛(wèi)生局科技基金項(xiàng)目資助(2014KZ035)

1.天津市海河醫(yī)院 檢驗(yàn)科，300350;2.天津市呼吸疾病研究所，300350

郭明日(1982-)，男，主管檢驗(yàn)師，研究生。

10.14126/j.cnki.1008-7044.2017.02.054

R 516

A

1008-7044(2017)02-0246-04

2016-04-04)