高效液相色譜法測定雞蛋蛋黃和蛋清中的膽甾醇

謝娟平

（安康學院化學化工學院，陜西安康 725000）

高效液相色譜法測定雞蛋蛋黃和蛋清中的膽甾醇

謝娟平

（安康學院化學化工學院，陜西安康 725000）

為建立雞蛋膽甾醇提取及含量測定的高效液相色譜法，本研究采用皂化后用石油醚萃取雞蛋中的膽甾醇，然后用RP-HPLC法進行含量測定。試驗中以Shim-pack VP-ODS柱為分離柱，以乙腈-異丙醇（70：30，V/V）為流動相，流速為1.0 m L·m in-1，柱溫為30℃，檢測波長220 nm。結果顯示，雞蛋中含有豐富的膽甾醇，蛋黃和蛋清的膽甾醇含量分別為5 352.5和254.1 mg·kg-1，蛋黃中的膽甾醇含量遠大于蛋清中的含量。以所測得的峰面積為縱坐標，膽甾醇濃度為橫坐標，線性回歸方程為y=76.45x-0.052，相關系數(shù)（r）為0.999 2，重復性實驗的相對標準偏差為1.32%。該方法的加樣回收率為100.1%，相對標準偏差為1.02%。此方法簡單，可重復性好，適合于雞蛋中膽甾醇的含量測定。

高效液相色譜法；蛋黃；蛋清；膽甾醇

膽甾醇又稱膽固醇，是動物組織細胞不可缺少的重要物質，其不僅參與形成細胞膜，而且是合成膽汁酸，維生素D以及甾體激素的原料［1］。自然界中的膽固醇主要存在于動物性食物中，植物中沒有膽固醇。膽固醇在體內有著廣泛的生理作用，但當其過量時便會導致高膽固醇血癥，對機體產(chǎn)生不利的影響［2］。雞蛋是一種高膽固醇食物，特別是蛋黃中膽固醇的含量較高，而飼料和生活環(huán)境等因素的變化可影響雞蛋總甾醇的含量［3］。因此，測定雞蛋中的蛋清與蛋黃膽甾醇含量，對于指導居民合理飲食具有重要意義。雞蛋中膽甾醇含量測定的方法主要有比色法、高效液相色譜法和氣相色譜法［4-6］。國家標準方法為氣相色譜法，其測定結果在很大程度上受到載氣純度的影響，而比色法簡單快速，但由于共存脂類也會與顯色劑反應而干擾，高效液相色譜法相對而言是一種準確度、精密度都較好的方法，但其流動相的比例，色譜條件對分離結果影響較大［7-8］。本文采用皂化后用石油醚萃取雞蛋中的膽甾醇，再用高效液相色譜法檢測的方法測定雞蛋蛋清和蛋黃中的膽甾醇含量，并通過精密度試驗、重復性試驗、加樣回收率試驗來評價該方法的可行性，以期為雞蛋中膽甾醇含量測定提供一種操作簡單，精密度較高的方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

LC-10ATVP高效液相色譜儀（日本島津）；AR1140/C型電子分析天平（北京OHAUS公司）；KQ-600DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；旋轉蒸發(fā)儀（RE-52A，鄭州市亞榮儀器有限公司）。膽甾醇標準品；乙腈（色譜純，批號：AS1122-001）；異丙醇、石油醚、氫氧化鉀均為分析純；無水乙醇（優(yōu)級純）；濃氨水。雞蛋，安康市紫陽縣洪山鎮(zhèn)農(nóng)戶提供。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件

Shim-pack VP-ODS色譜柱（150 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：乙腈-異丙醇（70：30，V/V）；流速：1.0 m L·min-1；柱溫：30℃；檢測波長：220 nm；室溫：25℃，每次進樣20μL。

1.2.2 溶液配制

膽甾醇標準溶液：精密稱取膽甾醇標準品約0.250 g，用無水乙醇溶解并定容至25 m L的容量瓶中，得膽甾醇標準液，濃度為10 mg·mL-1，作為儲備液。取膽甾醇儲備液0、0.50、1.00、2.00、4.00、6.00 m L于10 m L容量瓶中，無水乙醇稀釋定容，得到濃度為0、0.50、1.00、2.00、4.00、6.00 mg·m L-1的膽甾醇標準溶液，用0.45μm微孔濾膜過濾，待測。氫氧化鉀-乙醇溶液：精密稱取氫氧化鉀56.11 g，用無水乙醇溶解并定容至500 mL的容量瓶中，得濃度為2.0 mol· L-1的氫氧化鉀-乙醇溶液。

1.2.3 樣品處理

取安康市紫陽縣洪山鎮(zhèn)農(nóng)戶提供土雞雞蛋12批。每批10枚，隨機抽取3枚，打碎，分別精密稱取雞蛋清和雞蛋黃按下述方法操作，同法測定12批，取平均值作為樣本測定值。

精密稱取蛋清約30 g，加等量水，充分攪拌均勻。取上述溶液置于250 m L的圓底燒瓶中，加入2.0 mol·L-1氫氧化鉀-乙醇溶液50 m L，于85℃水浴皂化45 m in，皂化過程中始終保持旋轉攪拌狀態(tài)，皂化液冷卻至室溫后，加飽和氯化鈉水溶液25 m L移至分液漏斗中，用石油醚60 m L分3次萃取，將石油醚層合并，用蒸餾水30 m L多次洗滌石油醚層至pH為中性，石油醚層用無水硫酸鈉脫水濾過，回收石油醚，殘渣用無水乙醇定容至25 m L，超聲處理30 m in，用0.45μm濾膜過濾，得蛋清樣品，待測。

精密稱取蛋黃約56 g，加等量水，充分攪拌均勻后加入濃氨水5.6 m L，混勻，再加入20 m L無水乙醇，混勻，用石油醚150 m L分3次提取，合并提取液，回收石油醚，置于250 mL的圓底燒瓶中，加入2.0 mol·L-1氫氧化鉀-乙醇溶液50 mL，于85℃水浴皂化45 min，以下操作同蛋清處理。

2 結果與分析

2.1 標準曲線

用LC-10ATVP高效液相色譜儀測定標準系列溶液，溶液進樣為20μL，每個濃度標準溶液重復進樣3次。膽固醇保留時間為11.55 min，標準溶液色譜圖見圖1。以峰面積為縱坐標，膽甾醇標準溶液濃度（mg·m L-1）為橫坐標，繪制標準曲線，線性回歸方程為y=76.45x-0.052，相關系數(shù)（r）為0.9992，在0～120μg線性良好。

圖1 膽甾醇標準溶液的色譜

2.2 精密度

取同一蛋清溶液，連續(xù)進樣5次，結果膽甾醇峰面積相對標準偏差為1.92%，表明精密度良好。

2.3 重復性

取同一批雞蛋蛋清6份，精密稱定，按1.2.3節(jié)下制備供試品溶液，按樣品測定方法測定其含量分別為74.48、74.52、74.59、74.55、74.83和74.71 mg·kg-1，相對標準偏差為1.32%，表明該方法的重復性良好。

2.4 加樣回收率

取已測定含量的雞蛋蛋清6份，每份約30 g，精密稱定，精密加入膽甾醇適量，按1.2.3節(jié)下制備供試品溶液，按樣品測定方法測定，計算回收率，結果見表1。相對標準偏差為1.02%，表明方法的準確度良好。

表1 加樣回收率實驗結果

2.5 樣品測定

在標準溶液色譜分析條件下進樣測定，以保留時間定性，峰面積定量，樣品圖譜見圖2。結果前3批樣品膽甾醇的平均含量為，蛋清中的含量為250.3 mg·kg-1，蛋黃中的含量為5 420 mg· kg-1。其余各批樣品中膽甾醇的含量及12批樣品平均含量見表2。

圖2 蛋黃樣品的色譜

表2 樣品膽甾醇含量測定結果mg·kg-1

可以看出，雞蛋中含有豐富的膽甾醇，且蛋黃中的膽甾醇遠大于蛋清中的膽甾醇，所測得的雞蛋蛋黃和蛋清的膽甾醇含量分別為5 352.5和254.1 mg·kg-1。在本文色譜條件下，用常規(guī)液相色譜法檢測雞蛋蛋黃和雞蛋蛋清中的膽甾醇，加樣回收率為100.1%，相對標準偏差為1.02%，方法簡單，可重復性好。

3 討論

隨著生活水平的提高，人們越來越注重飲食健康與安全。雞蛋是日常生活中普遍食用品和天然營養(yǎng)品。然而雞蛋蛋黃中含有大量膽固醇，如果人體每天攝入量過多，則可形成高脂。因此，雞蛋中膽甾醇的測定具有重要的意義。但是，雞蛋中膽甾醇含量測定的國標方法為氣相色譜法，其測定結果在很大程度上受到載氣純度的影響，研究報道較多的是全蛋膽甾醇含量的測定，本文成功地用常規(guī)液相色譜分別對雞蛋蛋黃和雞蛋蛋清中的膽甾醇進行了測定，本方法比較簡單，回收率高，重復性和檢測精度良好，適合于雞蛋中膽甾醇的含量測定。

楊琴等［9］報道，白皮普通雞蛋蛋黃和全蛋的膽固醇平均含量分別為12 760和3 402.6 mg·kg-1；王立克等［10］報道羅曼褐雞、閩中麻雞和淮南雞的蛋黃中膽固醇平均含量分別為13 140、15 700和16 320 mg·kg-1；楊朋坤等［11］報道綠殼蛋和烏雞蛋蛋黃膽固醇平均含量分別為7 550和8 990 mg· kg-1。本實驗所用雞蛋為安康當?shù)胤硼B(yǎng)的山間土雞雞蛋，其蛋黃的膽甾醇含量為5 352.5 mg·kg-1，明顯低于上述文獻報道，推測雞蛋中膽甾醇的含量可能受雞的品種、飼養(yǎng)方式、生理因素和檢測方法等多種因素的影響，具體因素需進一步研究。但此結果對于指導當?shù)鼐用襁x擇性合理食用雞蛋具有指導意義。

［1］ 楊月欣.中國食物成分表［M］.北京：北京大學醫(yī)學出版社，2002：135-137.

［2］ 王鏡巖，朱圣庚，徐長法.生物化學·上冊［M］.北京：高等教育出版社，2002：114-116.

［3］ 王曉亮，徐桂云，鄭江霞，等.不同飼養(yǎng)方式對綠殼蛋雞產(chǎn)蛋性能和蛋品質的影響［C］∥中國家禽科學研究進展：第十四次全國家禽科學學術討論會論文集.哈爾濱：中國農(nóng)業(yè)科學技術出版社，2009：458-462.

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［10］ 王立克，胡忠澤，羅學振，等.不同品種雞蛋中膽固醇含量的比較研究［J］.安徽科技學院學報，2006，20（1）：5-7.

［11］ 楊朋坤，盧冉，田亞東，等.綠殼蛋和烏雞蛋膽固醇含量的測定［J］.家畜生態(tài)學報，2011，32（2）：75-79.

（責任編輯：盧福莊）

Q548+.1

A

0528-9017（2017）01-0134-03

文獻著錄格式：謝娟平.高效液相色譜法測定雞蛋蛋黃和蛋清中的膽甾醇［J］.浙江農(nóng)業(yè)科學，2017，58（1）：134-136.

10.16178/j.issn.0528-9017.20170143

2016-07-11

陜西省科技廳農(nóng)業(yè)攻關項目（2010K01-19）；大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練項目（201211397009，2013sxjy005）

謝娟平（1972-），女，教授，碩士，研究方向為分離分析及天然產(chǎn)物開發(fā)，E-mail：xjp_731205@126.com。