基于文獻計量的基因組編輯技術發(fā)展態(tài)勢分析

王慧媛，袁天蔚，阮亮亮，熊燕

1.中國科學院上海生命科學信息中心，上海 200031

2.上海醫(yī)藥臨床研究中心，上海 200032

3.上海生物樣本庫工程技術研究中心，上海 200031

基于文獻計量的基因組編輯技術發(fā)展態(tài)勢分析

王慧媛1，袁天蔚1，阮亮亮2，3，熊燕1

1.中國科學院上海生命科學信息中心，上海 200031

2.上海醫(yī)藥臨床研究中心，上海 200032

3.上海生物樣本庫工程技術研究中心，上海 200031

近年來，以CRISPR為代表的基因組編輯技術發(fā)展迅速，圍繞該技術的一系列基礎和應用研究成為全球研究熱點。利用Web of Science信息檢索平臺中的SCI-Expanded 來源數(shù)據(jù)庫和CiteSpace分析軟件，采用文獻統(tǒng)計、共被引分析和關鍵詞共現(xiàn)分析等文獻計量方法，對基因組編輯技術研究態(tài)勢進行分析，為相關研究提供參考。

基因組編輯；CRISPR；文獻計量；CiteSpace

自2013年首次報道CRISPRCas9系統(tǒng)成功在哺乳動物基因組編輯中應用以來，以CRISPR為代表的基因組編輯技術受到廣泛關注?；蚓庉嫾夹g是對目標基因序列進行插入、刪除或者改變的操作方法。從鋅指核糖核酸酶（ZFN）技術、轉錄激活因子樣效應物核酸酶（TALEN）技術到現(xiàn)在的RNA介導的成簇規(guī)律間隔短回文重復序列系統(tǒng)（CRISPR）技術，基因組編輯技術成為生命科學研究的一項重要技術。尤其是CRISPR技術，自2012年問世以來，在短短幾年內(nèi)迅速席卷全球各實驗室，并展現(xiàn)出廣闊的應用前景，被認為是遺傳研究領域的革命性技術，已應用于作物育種、疾病模型構建、靶向藥物研發(fā)等各個領域。采用文獻統(tǒng)計、共被引分析和關鍵詞共現(xiàn)分析等文獻計量方法，對基因組編輯技術近十年的相關文獻進行分析，總結技術發(fā)展路徑和研究現(xiàn)狀，并對未來的研究熱點趨勢進行展望。

1 基因組編輯技術發(fā)展迅速

基因組編輯依賴于位點特異的核酸內(nèi)切酶在剪切位點通過DNA修復系統(tǒng)觸發(fā)序列修改。目前，在該領域主要有三種技術，即ZFN技術、TALEN技術和CRISPR技術。

TALEN技術與ZFN技術組成了一大類強有力的基因組編輯工具，由一個可編碼的序列特異性DNA結合模塊與一個非特異性的DNA切割結構域所組成，通過誘導DNA雙鏈斷裂來刺激容易出錯的非同源末端連接或在特定基因所在的位置進行的同源定向修復，完成一系列基因編輯操作。CRISPR技術是最新出現(xiàn)的一種基因組編輯工具，與其他基因組編輯工具相比，更易于操作，有更強的可擴展性。

利用Web of Science數(shù)據(jù)庫，檢索2006～2016年的基因組編輯技術相關文獻（檢索時間為2016年11月8日，數(shù)據(jù)更新時間為2016年11月4日）。2006年以來，共獲得基因組編輯技術研究相關文獻8176篇。2015年發(fā)文量為1964篇，是2006年發(fā)文量（62篇）的31.68倍。2016年（數(shù)據(jù)截至2016年11月8日）為2145篇，已經(jīng)比2015年增長了9.22%。2006～2015年，基因組編輯技術研究發(fā)文量的平均年增長率為47.94%，發(fā)文量呈快速增長的趨勢（圖1）。

2 美國引領基因組編輯技術研究

2006～2016年全球發(fā)表的基因組編輯技術論文中，美國以4090篇的發(fā)文量位居世界第一，占全球該領域發(fā)文總量的50.02%。中國以992篇的發(fā)文量排名第二，占全球該領域發(fā)文總量的12.13%，發(fā)文量排名前五的國家還有德國、英國、日本（圖2）。

2006～2015年，基因組編輯技術論文發(fā)文量排名前五的國家中，美國的發(fā)文量增長速度最快，從2006年的36篇增長到2015年的993篇（2016年數(shù)據(jù)不全，此處只做趨勢觀察，不做年度統(tǒng)計），發(fā)文量增長了近26.58倍，平均年增長率達44.90%。中國從2007年才開始有基因組編輯技術的相關文獻報道，發(fā)文量以緩慢的速度平穩(wěn)增長。2012年開始，中國的發(fā)文量快速增長，2014年達到189篇，超越德國，位居全球第二（圖3）。

2006～2016年，在基因組編輯技術領域，美國發(fā)表的論文的篇均被引頻次達到26.93次，h指數(shù)高達135，擁有較多的高質量論文。中國盡管在發(fā)文量上排在全球第二，但其論文的總被引頻次只有15 416次，篇均被引頻次僅為15.54次，在發(fā)文量排名前十位的國家中排名靠后，而法國、加拿大、荷蘭、意大利、西班牙的篇均被引頻次都達到20次以上（表1）。

圖1 2006～2016年基因組編輯技術相關文獻年度分布

圖2 2006～2016年基因組編輯技術論文發(fā)文量前十國家分布

圖3 2006～2016年基因組編輯技術論文發(fā)文量排名前五國家的發(fā)文量年度分布

2006～2016年，全球基因組編輯技術相關論文8176篇，總被引頻次為155 810次，篇均被引頻次為19.06次。將某一時間段各國論文的篇均被引頻次與該時間段全球篇均被引頻次相比，得到各國篇均被引頻次的相對數(shù)值，將這一指標稱為標準引文影響指數(shù)（normalized citation impact，NCI），國際篇均被引頻次作為基線1，NCI可以從一個角度反映一個國家在該領域的研究水平。

發(fā)文量排名前十位的國家中，美國、法國、加拿大、荷蘭和西班牙在基因組編輯領域的研究高于全球平均水平，德國和意大利與全球平均水平相當，英國略低于全球平均水平，而中國和日本的NCI分別為0.82和0.66，低于全球平均水平（圖4）。

3 中國研究機構在基因編輯技術研究領域論文發(fā)文量表現(xiàn)突出

2006～2016年全球基因組編輯技術論文發(fā)文量排名前十位的研究機構如圖5所示。哈佛大學以390篇的發(fā)文量排名首位；中國科學院排名第二（260篇），是唯一進入全球前十的中國研究機構。

2006～2016年，基因組編輯技術論文發(fā)文量排名前十的機構中，美國麻省理工大學的篇均被引頻次最高，達到94.38次，其次是哈佛大學，篇均被引頻次為69.80次。中國科學院盡管發(fā)文量排名第二位，但篇均被引頻次僅為17.41次，與其他機構相比，整體發(fā)文質量仍有一定差距。從h指數(shù)來看，哈佛大學的h指數(shù)較高（74），擁有較多的高質量論文（表2）。

表1 基因組編輯技術論文被引頻次前十國家分布

圖4 2006～2016 年基因組編輯技術發(fā)文量排名前十國家的NCI分布

圖5 2006～2016年全球基因組編輯技術論文發(fā)文量排名前十機構分布

2006～2016年，基因組編輯技術論文發(fā)文量排名前十的中國機構中，中國科學院以260篇的發(fā)文量排名第一，占中國基因組編輯技術研究論文總量的26.21%。從h指數(shù)來看，中國科學院的h指數(shù)為31，遙遙領先于其他國內(nèi)機構。清華大學的篇均被引頻次最高，達到64.10次，其次是北京大學，篇均被引頻次為38.01次。這兩所高校在基因組編輯技術領域的論文總體質量較高（表3）。

4 基因組編輯技術領域的革命性技術——CRISPR技術

為了研究基因組編輯的技術發(fā)展路徑，運用信息可視化軟件CiteSpace 繪制知識圖譜并計量分析數(shù)據(jù)，對2006～2016年基因組編輯相關文獻的共被引和關鍵詞共現(xiàn)情況進行分析（圖6），梳理基因組編輯的技術路徑，可以看出，CRISPR技術無疑是基因組編輯技術領域的革命性突破。CiteSpace是應用于Java 環(huán)境下的可視化軟件，基于對特定領域文獻集合的計量，通過知識圖譜的繪制，能夠對CRISPR技術的知識結構、研究演進以及熱點和前沿主題進行定量與定性分析。

CRISPR是一類廣泛分布于細菌和古菌基因組中的重復結構。研究表明，CRISPR與一系列相關蛋白、前導序列一起，能為原核生物提供對抗噬菌體等外源基因的獲得性免疫能力。這種結構的作用機理可能與真核生物的RNA干擾過程類似，最早于1987年在大腸桿菌（Escherichia coli）K12的凋亡蛋白抑制因子（inhibitor of apoptosis protein）基因側翼序列中被發(fā)現(xiàn) 。2005年左右，CRISPR位點附近高度保守的Cas基因（CRISPR-associated genes）引起了研究者關注。Cas基因是一類基因家族，編碼具有核酸酶和解旋酶結構域的蛋白質。2005年，Daniel等[2]在原核生物中發(fā)現(xiàn)了基因序列中包含45個CRISPR-Cas系統(tǒng)的蛋白家族和多個CRISPRCas亞型的集合，這些集合顯示了高度的靈敏性和特異性。2007年3月，Barrangou等[3]在《Science》上發(fā)表文章稱，CRISPR與Cas構成的CRISPR-Cas系統(tǒng)能夠使細菌抵抗噬菌體，從而免受病毒和質粒侵害，在此基礎上，研究人員逐步探明了CRISPR-Cas系統(tǒng)詳細的免疫機制，為CRISPR-Cas系統(tǒng)發(fā)展成為通用的RNA介導的可編程DNA核酸內(nèi)切酶輔平了道路，這篇文章成為了CRISPRCas系統(tǒng)作為基因組編輯工具的奠基性研究。隨后，科學家們陸續(xù)對CRISPR-Cas的作用機制進行了深入研究，例如2008年荷蘭瓦赫寧根大學的Brouns等[4]發(fā)表在《Science》上的文章，報道了原核生物中小CRISPR RNA（small CRISPR RNAs）介導的抗病毒防御，闡述了包含在CRISPR-Cas中的病毒衍生序列如何使用來自宿主的CRISPR相關蛋白Cas介導抵抗感染的抗病毒反應。直到2012年8月，加州大學伯克利分校的Jinek等[5]發(fā)表在《Science》雜志上的文章，正式提出利用RNA介導CRISPR-Cas系統(tǒng)可實現(xiàn)基因組編輯，證明CRISPRCas系統(tǒng)可作為基因組編輯工具，CRISPR-Cas基因組編輯技術瞬間吸引了全球研究者的目光。該文章被引用1290次，成為近幾年來CRISPR技術大熱的起點。

表2 2006～2016年基因組編輯技術論文發(fā)文量排名前十機構的被引頻次及h指數(shù)

表3 2006～2016年基因組編輯技術論文發(fā)文量排名前十的中國機構的被引頻次及h指數(shù)

圖6 基因組編輯技術文獻的共被引知識圖譜示意

5 有效性驗證和應用研究是基因組編輯技術研究的熱點

利用作者從論文中抽取用于表征論文的主題特征的關鍵詞，可以分析出一定研究領域的熱點和前沿主題。在CiteSpace軟件中，選擇網(wǎng)絡節(jié)點類型為“keywords”（關鍵詞），參數(shù)閾值設置為“top 50”（每年出現(xiàn)頻次最高的前50 位關鍵詞），繪制關鍵詞共現(xiàn)知識圖譜（圖7）。分析2006～2016年基因組編輯技術相關的8176篇文獻，共出現(xiàn)14 142個關鍵詞。綜合來看，2006～2013年，頻次和中介中心性較高的關鍵詞分別是zinc f nger nuclease（鋅指核酸酶 ）、DNA express system（DNA表達系統(tǒng)）、Escherichia coli（大腸桿菌）、DNA binding specif city（DNA結合特異性）、homologous recombination（同源重組）、雙鏈斷裂fragment-length-polymorphism（片段多態(tài)性）、endonuclease（核酸內(nèi)切酶）等。這期間的研究熱點在于對上一代基因組編輯技術ZFNs、TALANs等的深入研究和對CRISPR技術的分子機制研究。2013年以后的高頻詞和高中介中心性關鍵詞為prokaryote（原核細胞）、mice（ 小 鼠）、mammalian cell（哺乳細胞）、CRISPR/Cas9、pluripotent stem cell（多能干細胞）等，研究熱點集中在以CRISPR技術為代表的基因組編輯技術在不同系統(tǒng)中的有效性驗證及應用。

2013年以來，基因組編輯技術領域不斷取得突破性進展，大部分都是圍繞CRISPR技術展開。科學家們紛紛在細菌、斑馬魚、小鼠、小麥、水稻、哺乳動物甚至人類等不同生物系統(tǒng)上驗證CRISPR的有效性，例如，Hsu等[6]利用產(chǎn)膿鏈球菌（Streptococcus pyogenes）中的Cas酶（SpCas）和RNA，在小鼠和人類細胞的DNA中進行了插入、修改、敲除基因片段，首次證明了Cas9核酸酶能用于哺乳動物細胞基因組的編輯；Cong等[7]將多個引導序列編碼到單個CRISPR陣列中，使得能夠同時編輯小鼠基因組內(nèi)的多個位點，展示CRISPR技術在小鼠體內(nèi)進行多位點編輯的有效性；Jiang等[8]利用CRISPR-Cas系統(tǒng)進行RNA指導的細菌基因組編輯，利用Cas9核酸內(nèi)切酶結合雙股RNA在肺炎鏈球菌和大腸埃希氏菌基因組中實現(xiàn)精確的基因突變；Hwang等[9]發(fā)現(xiàn)細菌II型CRISPR-Cas能夠在斑馬魚胚胎中誘導產(chǎn)生靶向遺傳修飾，其效果與ZFN和TALEN的效果相類似；Ding等[10]利用CRISPR技術進行人多能干細胞基因組編輯，并指出CRISPR較ZFN和TALEN具有極大的優(yōu)勢，CRISPR更易于操作，也具有更強的擴展性；Shan等[11]利用CRISPR-Cas系統(tǒng)定點突變了水稻和小麥兩個作物的OsPDS和TaMLO等5個基因，首次證實CRISPR-Cas系統(tǒng)能夠用于植物的基因組編輯；Niu等[12]利用CRISPR技術實現(xiàn)猴的基因編輯，提示該技術進行人基因組編輯的可能性。

圖7 基因組編輯技術的關鍵詞共現(xiàn)知識圖譜示意

同時，以CRISPR為代表的基因組編輯技術在疾病治療、動植物品種改造等應用方面的研究也取得較大進展。研究人員已經(jīng)利用CRISPR技術在疾病治療領域取得諸多突破，包括構建衰老模型[13]、改造艾滋病毒[14]等，尤其是成功編輯T細胞[15]，為與自身免疫相關的1型糖尿病、艾滋病、癌癥等多發(fā)性疾病提供了新的治療途徑。在癌癥治療領域，研究人員利用CRISPR技術鑒別和篩選癌癥相關基因[16]、精準控制基因表達[17]、構建癌癥類器官[18]等。此外，CRISPR也可用于設計干細胞，開發(fā)疾病研究和藥物測試模型[19]，并有望應用到誘導多能干細胞中[20]，實現(xiàn)個性化的干細胞治療，造福多種遺傳學疾病的患者。在動植物分子育種方面，在利用CRISPR-Cas系統(tǒng)定點突變了水稻和小麥基因的基礎上，Ji等[21]利用CRISPR-Cas特異識別病毒和外源DNA的特性，將CRISPR切割系統(tǒng)引入植物，在植物中建立了DNA病毒防御體系；CRISPR技術也被廣泛用于山羊、豬、狗等動物品種的改良上。除了應用于疾病治療和物種改良，CRISPR在其他應用領域也發(fā)揮著重要的作用，如銷除“轉基因”生物中特定序列[22]、光控CRISPR-Cas9系統(tǒng)[23]、制備新型gRNA文庫[24]等。

在多種系統(tǒng)中成功應用CRISPR技術之后，科學家們更加關注CRISPR技術應用于人類基因組編輯。2015年，我國中山大學生命科學學院黃軍就在《Protein & Cell》雜志發(fā)表文章稱，其團隊成功修改了人類胚胎的DNA，為治療地中海貧血癥提供了可能[25]。這是CRISPR技術首次應用于人類胚胎編輯，盡管引發(fā)了基因組編輯技術倫理和監(jiān)管問題的巨大爭議，但仍是該基因組編輯技術應用研究的重要突破，黃軍就也因此入選了《Nature》2015年度十大人物。

6 總結與展望

隨著基因組編輯技術飛速發(fā)展，尤其是CRISPR技術的不斷應用與探索，相關研究發(fā)文量逐年迅速增長。美國引領了基因組編輯技術的研究，其發(fā)文量占全球發(fā)文量的近一半，且發(fā)文質量整體水平較高。中國后來居上，在基因組編輯領域的研究實力強勁，尤其是中國科學院，在發(fā)文量上僅次于哈佛大學，其發(fā)文整體實力與高質量論文量在國內(nèi)也處于領先地位。基因組編輯技術發(fā)展過程中，CRISPR技術無疑是該領域的革命性技術。

近年來，基因組編輯的研究熱點都圍繞著CRISPR技術展開，從作用機制到不同系統(tǒng)的有效性驗證，再到技術應用，基因組編輯的應用潛力不斷被挖掘，在藥物開發(fā)、疾病治療、動植物改造等領域發(fā)揮著越來越重要的作用。利用基因組編輯技術尋找、確定和制備藥物篩選靶（分子藥靶）已成為新藥研發(fā)的新思路；基因組編輯技術越來越普遍地用于作物育種。此外，研究人員也在不斷探索如何減少基因組編輯技術的脫靶效應，提高系統(tǒng)效率和特異性，尋找更高效的編輯系統(tǒng)或工具等，對脫靶效應的研究使得該技術更為精準，“精準基因組編輯”正逐步實現(xiàn)。而具有多重功能或更大識別序列的新系統(tǒng)也在不斷被發(fā)現(xiàn)。此外，隨著基因組編輯技術成功應用于人類胚胎，該技術的快速發(fā)展所帶來的倫理和監(jiān)管問題也得到廣泛關注和探討。

［1］ ISHINO Y，SHINAGAWA H，MAKINO K，et al．Nucleotide sequence of the iap gene，responsible for alkaline phosphatase isozyme conversion in Escherichia coli，and identif cation of the gene product[J]. Journal of Bacteriology，1987，169（12）：5429-5433.

［2］ DANIEL H H，JEREMY D S，EMMANUEL F M，et al. A guild of 45 CRISPR-associated（Cas）protein families and multiple CRISPR/Cas subtypes exist in prokaryotic genomes[J]. PLoS Computational Biology，2005，1（6）：0474-0483.

［3］ BARRANGOU R，F(xiàn)REMAUX C，DEVEAU H，et al. CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes[J]. Science，2007，315：1709-1712.

［4］ BROUNS S，JORE M，LUNDGREN M，et al．Small CRISPR RNAs guide antiviral defense in prokaryotes[J]. Science，2008，321（5891）：960-964.

［5］ JINEK M，CHYLINSKI K，F(xiàn)ONFARA L，et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity[J]. Science，2012，337（6096）：816-821.

［6］ HSU P D，SCOTT D A，WEINSTEIN J A，et al. DNA targeting specif city of RNA-guided Cas9 nucleases[J]. Nature Biotechnology，2013，31（9）：827-832.

［7］ CONG L，RAN F A，COX D，et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems[J]. Science，2013，339（6121）：819-823.

［8］ JIANG W，BIKARD D，COX D，et al. RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems[J]. Nature Biotechnology，2013，31（3）：233-239.

［9］ HWANG W Y，F(xiàn)U Y，REYON D，et al. Eff cient genome editing in zebraf sh using a CRISPR-Cas system[J]. Nature Biotechnology，2013，31（3）：227-229.

［10］ DING Q，REGAN S N，XIA Y，et al. Enhanced eff ciency of human pluripotent stem cell genome editing through replacing TALENs with CRISPRs[J]. Cell Stem Cell，2013，12（4）：393-394.

［11］ SHAN Q W，WANG Y P，LI J，et al. Targeted genome modif cation of crop plants using a CRISPR-Cas system[J]. Nature Biotechnology，2013，31（8）：686-688.

［12］ NIU Y，SHEN B，CUI Y，et al. Generation of gene-modif ed cynomolgus monkey via Cas9/RNA-mediated gene targeting in one-cell embryos[J]. Cell，2014，156（4）：836-843.

［13］ ITAMAR H，BERENICE A B，BEN M，et al. A platform for rapid exploration of aging and diseases in a naturally short-lived vertebrate[J]. Cell，2015，160（5）：1013-1026.

［14］ LIAO H K，GU Y，DIAZ A，et al. Use of the CRISPR/Cas9 system as an intracellular defense against HIV-1 infection in human cells[J]. Nature Communication，2015，6.

［15］ KATHRIN S，STEVEN L，ERIC B，et al. Generation of knock-in primary human T cells using Cas9 ribonucleoproteins[J]. PNAS，2015，112（33）：10437-10442.

［16］ TAGLIABRACCI V S，WILEY S E，GUO X，et al. A single kinase generates the majority of the secreted phosphoproteome[J]. Cell，2015，161（7）：1619-1632.

［17］ HART T，CHANDRASHEKHAR M，AREGGER M，et al. High-Resolution CRISPR screens reveal fitness genes and genotype-specific cancer liabilities[J]. Cell，2015，163（6）：1515-1526.

［18］ DROST J，VAN JAARSVELD R H，PONSIOEN B，et al. Sequential cancer mutations in cultured human intestinal stem cells[J]. Nature，2015，521（7550）：43-47.

［19］ SMITH C，ABALDE-ATRISTAIN L，HE C，et al. Eff cient and allele-specif c genome editing of disease loci in human iPSCs[J]. Molecular Therapy，2015，23（3）：570-577.

［20］ HOWDEN S E，MAUFORT J P，DUFFIN B M，et al. Simultaneous reprogramming and gene correction of patient fibroblast[J]. Stem Cell Reports，2015，5（6）：1109-1118.

［21］ JI X，ZHANG H W，ZHANG Y，et al. Establishing a CRISPR-Cas-like immune system conferring DNA virus resistance in plants[J]. Nature plants，2015，1（10）.

［22］ CALIANDO B J，VOIGT C A. Targeted DNA degradation using a CRISPR device stably carried in the host genome[J]. Nature Communication，2015，6.

［23］ NIHONGAKI Y，KAWANO F，NAKAJIMA T，et al. Photoactivatable CRISPR-Cas9 for optogenetic genome editing[J]. Nataure Biotechnology，2015，33（7）：755-760.

［24］ VIDIGAL J A，VENTURA A. Rapid and eff cient one-step generation of paired gRNA CRISPR-Cas9 libraries[J]. Nature Communication，2015，6.

［25］ LIANG P，XU Y，ZHANG X，et al. CRISPR/Cas9-mediated gene editing in human tripronuclear zygotes[J]. Protein Cell，2015，6（5）：363-272.

Development trend analysis of genome editing technologies based on bibliometric

WANG Huiyuan1，YUAN Tianwei1，RUAN Liangliang2，3，XIONG Yan1

1. Shanghai Information Center for Life Sciences, CAS, Shanghai 200031, China
2. Shanghai Clinical Research Center, Shanghai 200032, China
3. Shanghai Engineering Research Center of Biobank, Shanghai 200031, China

In recent years, new genome editing technologies represented by CRISPR based on novel and eff cient DNA targets have been widely applied in biology and life science research area. Based on SCI-Expanded database in Web of Science and Citespace analysis software, development trend of genome editing is analyzed through bibliometric analysis methods.

genome editing; CRISPR; bibliometric; CiteSpace

10.3969/j.issn.1674-0319.2017.01.002

王慧媛，碩士，館員。主要從事生命科學及相關領域學科情報和戰(zhàn)略情報研究。

E-mail：hywang1213@sibs.ac.cn

國家自然科學基金委員會-中國科學院學科發(fā)展戰(zhàn)略研究合作項目（L1222037），上海市科學技術委員會科研計劃項目（15DZ2292100，16DZ0500600）