成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子及Klotho在老年骨質(zhì)疏松患者外周血清中的表達(dá)

蔣喆成　李歡　楊春

【摘要】 目的：研究老年骨質(zhì)疏松患者外周血清成纖維生長(zhǎng)因子（fibroblast growth factor，F(xiàn)GF）及Klotho的表達(dá)。方法：根據(jù)骨影像學(xué)檢查結(jié)果，選取46例老年骨質(zhì)疏松患者（O組）及30例健康者（C組）納入本研究。采用酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)（ELISA）分別檢測(cè)血清中FGF21、FGF23、α-Klotho及β-Klotho的表達(dá)水平，并與雙能X射線骨密度檢測(cè)t值進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果：O組患者血清FGF21的表達(dá)較C組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），但呈現(xiàn)輕度下降趨勢(shì)；與C組相比，O組患者外周血清FGF23表達(dá)顯著升高，且血清α-Klotho及β-Klotho的表達(dá)水平均顯著下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；再者，Pearson相關(guān)性分析提示骨密度t值與血清FGF23的表達(dá)顯著負(fù)相關(guān)，而與血清α-Klotho及β-Klotho的水平顯著正相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：血清FGF23、α-Kloth及β-Klotho的表達(dá)異常可能與骨質(zhì)疏松的發(fā)病機(jī)理有關(guān)，且其可用于臨床輔助診斷骨質(zhì)疏松。

【關(guān)鍵詞】 骨質(zhì)疏松； 成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子； Klotho； 老年

doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2017.1.001 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1674-6805（2017）01-0001-03

【Abstract】 Objective：To determine the serum levels of fibroblast growth fctor and Klotho of aged patients with osteoporosis.Method：On the basis of the clinical results of imageological examination，46 aged osteoporosis patients（O group） and 30 healthy individuals （C group） were enrolled in the present study.Enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA） was respectively applied to detect the serum levels of FGF21、FGF23、α-Klotho and β-Klotho. Moreover，statistical analysis of Pearson correlation was used to analyze the correlationship between T value of dual energy X-ray absorptionmetry and FGF， as well as Klotho.Result：Serum level of FGF21 in O group showed no significantly statistical difference compared with C group（P>0.05），while it displayed a slighter decrease.Compared with C group，patients in O group demonstrated a significant increase of FGF23，and that serum levels of α-Klotho and β-Klotho both significantly down-regulated（P<0.05）；Furthermore，Pearson analysis suggested that T value of bone mineral density was negatively correlated with serum FGF23 level，and negatively correlated with both serum levels of α-Klotho and β-Klotho（P<0.05）.Conclusion：Abnormal serum FGF23，α-Kloth and β-Klotho levels are both highly associated with the pathogenesis of osteoporosis，which could be used as promising biomarkers for auxiliary diagnosis of osteoporosis.

【Key words】 Osteoporosis； Fibroblast growth factor； Klotho； Agedness

First-authors address：The Third Affiliated Hospital of Suzhou University，Changzhou 213003，China

骨質(zhì)疏松是由多種病因引起的一組骨病，出現(xiàn)骨骼向血液凈移動(dòng)的礦物質(zhì)流失，其病理學(xué)表現(xiàn)為單位體積內(nèi)骨組織的減少及骨骼內(nèi)孔隙增大[1-2]。目前，骨質(zhì)疏松的臨床診斷主要依賴于患者主訴的癥狀及影像學(xué)檢查。雙能X射線骨密度檢測(cè)是診斷骨質(zhì)疏松癥的金標(biāo)準(zhǔn)，世界衛(wèi)生組織推薦骨礦物質(zhì)密度低于年青人的標(biāo)準(zhǔn)值2.5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)方差值即可診斷為骨質(zhì)疏松癥[3-4]。然而，骨質(zhì)疏松的發(fā)病機(jī)理尚未完全闡明，廣為認(rèn)可的是其發(fā)病與鈣磷代謝失調(diào)、激素紊亂、活性維生素D攝入減少有關(guān)[4]。大量研究指出慢性終末期腎病患者經(jīng)歷血液透析后，其骨質(zhì)疏松的發(fā)病率較健康對(duì)照組顯著升高[5-6]。本課題組先前研究結(jié)果表明成纖維生長(zhǎng)因子（fibroblast growth factor，F(xiàn)GF）23的異常升高可能參與到終末期腎病患者血液透析后的鈣磷失調(diào)的發(fā)病機(jī)理中[7]。本研究擬觀察老年骨質(zhì)疏松患者外周血清中FGF及其共受體（co-receptor）Klotho的表達(dá)，并試闡明骨質(zhì)疏松的可能發(fā)病機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 一般資料

根據(jù)世界衛(wèi)生組織推薦的骨質(zhì)疏松診斷標(biāo)準(zhǔn)[3-4]，采用雙能X射線骨密度檢測(cè)t值，其數(shù)值低于年青人的標(biāo)準(zhǔn)值2.5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)方差值即可診斷為骨質(zhì)疏松癥。排除標(biāo)準(zhǔn)：糖尿病、慢性腎病、激素使用史、感染及在使用抗生素等。選擇筆者所在醫(yī)院門診2015年8月-2016年4月治療的骨質(zhì)疏松患者46例（O組），其中男26例，女20例，以及健康對(duì)照組（C組）30例，其中男17例，女13例，兩組年齡均為65～85歲。兩組研究對(duì)象一般資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。

1.2 方法

采用酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)ELISA檢測(cè)，抽取肘正中靜脈血檢測(cè)FGF21、FGF23、α-Klotho和β-Klotho的表達(dá)水平。取肘正中靜脈血4～6 ml， 3000 r/min， 4 ℃離心5 min（美國(guó)Thermo公司），取血清。采用雙抗體夾心ABC-ELISA法分別檢測(cè)FGF21（上?？道噬锕荆琄I-H0074c）、FGF23（上海康朗生物公司，klA746Hu）、α-Klotho（江蘇晶美生物公司，F(xiàn)13463-A）及β-Klotho（武漢華美生物公司， CSB-EL012378HU），根據(jù)說明書在各孔中加入標(biāo)準(zhǔn)品或樣品各100 μl，放入孵育箱（美國(guó)Thermo公司），37 ℃孵育90 min。隨即，加入100 μl生物素化抗體工作液，37 ℃孵育60 min。洗滌3次后，加入100 μl酶結(jié)合物工作液，37 ℃孵育30 min。再洗滌5次后，加入 90 μl底物溶液，37 ℃孵育15 min。最后加入50 μl中止液，分別在450 nm和540 nm處測(cè)光密度（OD）值，檢測(cè)物濃度與OD值成正比，以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)，通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線求出標(biāo)本中的檢測(cè)物濃度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以（x±s）表示，采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，采用字2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用Pearson進(jìn)行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果

2.1 兩組研究對(duì)象一般資料比較

兩組研究對(duì)象性別、年齡、體重、體重指數(shù)、血鈣、血磷、血鎂、堿性磷酸酶、甲狀旁腺激素及血沉比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；然而，兩組研究對(duì)象骨折病史比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表1。

2.2 兩組研究對(duì)象血清FGF及Klotho表達(dá)水平比較

與C組相比，O組研究對(duì)象血清FGF21的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），但呈現(xiàn)輕度下降趨勢(shì)，但外周血清FGF23表達(dá)顯著升高，且血清α-Klotho及β-Klotho的表達(dá)水平均顯著下調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表2。

2.3 骨密度值與血清生物標(biāo)記物（FGF和Klotho）相關(guān)性分析

Pearson相關(guān)性分析提示骨密度t值與FGF21無統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），與血清FGF23的表達(dá)顯著負(fù)相關(guān)，而與血清α-Klotho及β-Klotho的水平顯著正相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表3。

3 討論

骨質(zhì)疏松是老年人常見的一類疾病，常易并發(fā)骨關(guān)節(jié)痛，骨折等。本研究結(jié)果表明老年骨質(zhì)疏松患者較健康對(duì)照組血清FGF23顯著升高，且α-Klotho及β-Klotho的表達(dá)顯著下調(diào)。尤為重要的是這三類指標(biāo)均與雙能X射線骨密度t值呈現(xiàn)相關(guān)性，該結(jié)果提示FGF23、α-Klotho及β-Klotho均可用于輔助診斷骨質(zhì)疏松癥。

FGF23參與到鈣磷代謝調(diào)節(jié)中，其主要通過FGF受體及其共受體Klotho作用于腎臟、甲狀腺、甲狀旁腺等器官[8]。在慢性腎臟病患者外周血清中，F(xiàn)GF23的表達(dá)水平顯著升高可促進(jìn)腎病的進(jìn)展[8]。本課題組先前研究發(fā)現(xiàn)終末期腎病患者血清FGF23表達(dá)顯著升高[7]，但在經(jīng)過血液濾過后，F(xiàn)GF23的表達(dá)顯著下調(diào)，且該效應(yīng)有助于逆轉(zhuǎn)終末期腎病進(jìn)一步惡化。本研究顯示盡管骨質(zhì)疏松患者和健康對(duì)照組血清血鈣未見顯著差異，但FGF23在骨質(zhì)疏松患者血清中顯著上調(diào)，這表明FGF23可能參與骨質(zhì)疏松的發(fā)病機(jī)制中，血鈣濃度失調(diào)并不參與其中。先前研究亦表明骨質(zhì)疏松患者血鈣濃度未見顯著的降低，這與本研究結(jié)果相一致[9]。

FGF23通過其C-端與共受體α-Klotho結(jié)合，然后FGF可提供結(jié)合位點(diǎn)與FGF23的N-相結(jié)合，從而形成FGF23-α-Klotho結(jié)合體[10]。Koyama等[11]研究結(jié)果表明骨質(zhì)疏松患者血清中可溶性Klotho顯著降低，且可溶性Klotho的表達(dá)與FGF23呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。Klotho分為可溶型及跨膜型。本研究中，骨質(zhì)疏松患者血清α-Klotho的水平顯著降低，且與骨質(zhì)疏松呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。如前所述，F(xiàn)GF23與骨密度t值呈現(xiàn)正相關(guān)。盡管本研究未進(jìn)行FGF23與α-Klotho相關(guān)性分析，但據(jù)此筆者推測(cè)FGF23不僅僅與可溶性Klotho負(fù)相關(guān)，與α-Klotho亦可呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)性。更為重要的是，α-Klotho的降低與骨質(zhì)疏松發(fā)病相關(guān)，這提示上調(diào)α-Klotho的表達(dá)有助于骨質(zhì)疏松的治療。

Klotho包括α型、β型及γ型[10]。本研究中，骨質(zhì)疏松患者血清β-Klotho顯著下降，這與α-Klotho結(jié)果相一致。此外，筆者觀察到FGF21未見明顯變化，究其原因可能與FGF21參與到脂質(zhì)代謝異常，血管硬化等疾病機(jī)制中，而未參與到-鈣磷代謝及骨細(xì)胞活性調(diào)節(jié)[12]。α-Klotho及β-Klotho作為抗衰老相關(guān)活性物質(zhì)，除分別與FGF23和FGF21參與到機(jī)體生理調(diào)解中，其在老年相關(guān)疾病進(jìn)展中具有重要作用[10]。骨質(zhì)疏松是一類與衰老密切相關(guān)的骨代謝疾病，本研究中α-Klotho及β-Klotho均顯著下調(diào)，這提示治療骨質(zhì)疏松除可通過激活成骨細(xì)胞活性和/或降低破骨細(xì)胞活性外，尚可通過延緩生物體的衰老進(jìn)程，從而治療骨質(zhì)疏松癥。

綜上所述，骨質(zhì)疏松的發(fā)病機(jī)制可能與血清FGF23、α-Kloth及β-Klotho的表達(dá)異常有關(guān)。后續(xù)大量研究可進(jìn)一步探討FGF-Klotho信號(hào)通路在骨質(zhì)疏松癥發(fā)病機(jī)理中的作用，進(jìn)而可將其用于骨質(zhì)疏松的輔助診斷中。

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（收稿日期：2016-09-06）