干細(xì)胞標(biāo)志Nanog在食管鱗癌組織中表達(dá)及預(yù)后關(guān)系

麻成方++余征++李紹鵬++李志華++魏春勇++汪禮旭++洪瓊川

摘要：目的 探討食管鱗癌組織中干細(xì)胞標(biāo)志Nanog表達(dá)及其與腫瘤病理特征和預(yù)后的關(guān)系。方法 采用免疫組化方法測(cè)定60例食管鱗癌組織和10例癌旁組織中干細(xì)胞標(biāo)志Nanog的表達(dá)情況，比較它在組織中的表達(dá)差異，及其與食管癌相關(guān)臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果 在60例患者中，26例出現(xiàn)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，Nanog在轉(zhuǎn)移組中表達(dá)率分別為61.5%（16/26），在非轉(zhuǎn)移組中分別為26.5%（9/34），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P值<0.05。食管鱗癌原發(fā)灶分化程度不同，Nanog表達(dá)存在差異，但是同T和N分期沒(méi)有明顯的相關(guān)性（P>0.05）。Nanog為陽(yáng)性表達(dá)其轉(zhuǎn)移率顯著高于為陰性表達(dá)者。結(jié)論 食管鱗癌組織中Nanog 表達(dá)與患者術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移有一定關(guān)系，該檢測(cè)有助于預(yù)后的評(píng)價(jià)。

關(guān)鍵詞：食管鱗癌；Nanog

Expression and Clinical Significances of Nanog in Esophagea Squamous Carcinoma

MA Cheng-fang1， YU Zheng2， LI Shao-peng1， LI Zhi-hua1， WEI Chun-yong1， WANG Li-xu1， HONG Qiong-chuan1

（1.Department of Cardiothoracic Surgery， Longgang District Central Hospital of Shenzhen，Shenzhen 518116， Guangdong，China；

2. Department of Physical Examination， People Hospital of Shenzhen Longgang District，Shenzhen 518116， Guangdong，China）

Abstract：Objective To investigate the expression of Nanog in esophageal squamous carcinoma and their correlations with the pathologic parameter of cancer and prognosis.Methods The expression of Nanog in 60 surgical specimens of esophageal squamous carcinoma and 10 paracarcinoma tissues was detected by immunohistochemistry method. The correlations between the expression of Nanog and the clinical pathological characteristics were analyzed statistically.Results Relapse and metastasis of 26 cases was detected in all patients. In metastasis group， the positive expression rate of Nanog was 61.5 %（16/26））. And the positive expression rate of Nanog in non-metastasis group was 26.5%（9/34）.The difference was signigicant （ P < 0. 05）. Expression of Nanog signigicantly correlated with differentiation， but was not associated with T stage or N stage . Metastatic rate in positive expression was higher than in negative expression.Conclusion The expression of Nanog related with progression and prognosis of esophageal squamous carcinoma， they are both hopeful predictors for patients with esophageal squamous carcinoma.

Key words：Esophageal squamous carcinoma；Nanog

食管癌是我國(guó)高發(fā)腫瘤之一，食管鱗癌術(shù)后的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移是目前臨床常見的現(xiàn)象，總體治療效果不佳，如何有效的評(píng)估預(yù)測(cè)是目前國(guó)內(nèi)外研究的一個(gè)熱點(diǎn)。近年出現(xiàn)的干細(xì)胞理論證實(shí)與腫瘤的發(fā)生、侵潤(rùn)和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，迄今已在多種惡性腫瘤中鑒定出具有干細(xì)胞性質(zhì)的惡性腫瘤細(xì)胞。作為全能或多能性干細(xì)胞的標(biāo)志，Nanog基因是維系干細(xì)胞自我更新的關(guān)鍵性基因。本研究采用免疫組化方法對(duì)食管鱗癌組織中干細(xì)胞標(biāo)志Nanog表達(dá)情況進(jìn)行分析，探討其與食管鱗癌臨床特征及預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2011年1月～2012年12月在我院胸外科住院治療并確診的食管鱗癌患者60例，其中男性32例，女性28例。年齡38～71歲，中位年齡為49歲。根據(jù)食管鱗癌TNM分期（AJCC2009）標(biāo)準(zhǔn)，ⅡA期28例，ⅡB期11例，ⅢA期21例。26（43.3%）例患者確診復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，其中9例為吻合口復(fù)發(fā)，10例為單個(gè)臟器轉(zhuǎn)移，7例為多發(fā)臟器或淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。所有患者術(shù)前未行放化療，術(shù)前檢查及術(shù)中探查均未發(fā)現(xiàn)明確遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。術(shù)后行輔助PF或TP方案化療4～6個(gè)周期。隨訪時(shí)仍生存37例，已死亡23例。

1.2免疫組化

1.2.1 60例標(biāo)本取自食管癌術(shù)后標(biāo)本中的無(wú)壞死癌灶，并在其中隨機(jī)抽取10例癌旁組織（距癌灶4 cm以上）作為對(duì)照，經(jīng)4%多聚甲醛溶液固定，常規(guī)脫水石蠟包埋，連續(xù)切片，切片厚度4～6 μm。均經(jīng)HE染色并由組織學(xué)證實(shí)為鱗狀細(xì)胞癌。

1.2.2采用免疫組化方法檢測(cè)食管鱗癌組織、癌旁組織中干細(xì)胞標(biāo)志Nanog的表達(dá)情況，操作步驟嚴(yán)格按照免疫組化單克隆抗體試劑盒（Santa Cruz公司）說(shuō)明進(jìn)行檢測(cè)，并由有經(jīng)驗(yàn)的病理科醫(yī)師單盲閱片。Nanog陽(yáng)性表達(dá)為細(xì)胞核染色，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)>10%為陽(yáng)性表達(dá)。

1.3預(yù)后評(píng)價(jià)方法 患者每3～4個(gè)月復(fù)查血清CEA、X線（包括食管鋇餐和胸片），彩超（頸部和腹部），每6～12個(gè)月復(fù)查胸腹部CT和消化內(nèi)鏡，如CT提示吻合口、肺、肝或局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移時(shí)，盡可能行局部穿刺活檢證實(shí)，以CT提示時(shí)間為轉(zhuǎn)移發(fā)生時(shí)間。采用轉(zhuǎn)移發(fā)生時(shí)間進(jìn)行預(yù)后評(píng)價(jià)。隨訪截止至2014 年12 月。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，比較Nanog表達(dá)與臨床參數(shù)之間的關(guān)系時(shí)采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Nanog表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 Nanog陽(yáng)性表達(dá)主要表現(xiàn)為腫瘤細(xì)胞核染色，見圖1，在轉(zhuǎn)移組中陽(yáng)性表達(dá)率為61.5 %（16/26），而非轉(zhuǎn)移組為26.5%（9/34），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。且在原發(fā)灶分化程度不同的組織中，Nanog的陽(yáng)性率表達(dá)也不同，低/未分化組呈高表達(dá)率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；在不同T和N分期中Nanog表達(dá)雖然存在差異，但是無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

圖1 Nanog在細(xì)胞核的陽(yáng)性表達(dá)（光鏡40×）

2.2 Nanog表達(dá)與術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移關(guān)系 在60例食管鱗癌組織中，Nanog為陽(yáng)性表達(dá)14例，其中發(fā)生復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移11例；Nanog為陰性表達(dá)21例，其中復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移5例。不同表達(dá)狀態(tài)與復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05。Nanog陽(yáng)性表達(dá)者轉(zhuǎn)移發(fā)生率為78.6%（11/14），顯著高于陰性表達(dá)者的23.8%（5/21）。

2.3 Nanog表達(dá)與食管鱗癌臨床病例特征的關(guān)系，見表1。

3 討論

食管癌是現(xiàn)階段全球最常見的惡性腫瘤之一，近年來(lái)我國(guó)食管癌的發(fā)病率及死亡率逐年增高。在我國(guó)食管癌占全部惡性腫瘤死因的第4位[1]。目前食管癌的主流治療措施是以手術(shù)為主聯(lián)合放化療的綜合治療，其治療后的5年生存率只有約14%[1]，造成這種困境的原因是大部分的患者術(shù)后出現(xiàn)了復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，是臨床亟待解決的重點(diǎn)問(wèn)題。

現(xiàn)階段腫瘤治療和評(píng)價(jià)預(yù)后的標(biāo)準(zhǔn)主要是TNM分期，但由于個(gè)體的差異和腫瘤的異質(zhì)性，已無(wú)法準(zhǔn)確反映腫瘤的術(shù)后復(fù)發(fā)和預(yù)后狀況。隨著現(xiàn)代分子生物技術(shù)的發(fā)展，如能找尋出食管癌中有預(yù)后價(jià)值的生物標(biāo)志物，將其與臨床病理指標(biāo)（組織學(xué)分級(jí)和腫瘤分期）結(jié)合，建立一種分子分期的新系統(tǒng)，將對(duì)指導(dǎo)個(gè)體化治療和評(píng)價(jià)預(yù)后很有幫助[2]。因此，尋找能評(píng)價(jià)其預(yù)后的腫瘤標(biāo)志物已成為目前食管癌臨床和基礎(chǔ)研究的主要熱點(diǎn)。

近年來(lái)國(guó)內(nèi)外提出的腫瘤干細(xì)胞理論為這個(gè)問(wèn)題的解決提供了新途經(jīng)。前期大量研究顯示腫瘤組織內(nèi)一部分具有干細(xì)胞特征的癌細(xì)胞，又稱癌干細(xì)胞（cancer stem cells，CSCs），是誘發(fā)及維持腫瘤不斷生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移、耐藥的源頭[3]。迄今為止已相繼在乳腺癌[4]、胰腺癌[5]、肝癌[6]和胃癌[7]等多種惡性腫瘤中鑒定出干細(xì)胞性質(zhì)的惡性腫瘤細(xì)胞。2003年國(guó)外學(xué)者將在胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cells，ESCs）內(nèi)新發(fā)現(xiàn)的重要基因Ecat4（ES cell associated transcripts 4）命名為 Nanog[8]，近年研究發(fā)現(xiàn)，它與CSCs關(guān)系密切，是維持干細(xì)胞自我更新和亞全能性的關(guān)鍵性基因，同時(shí)也是全能或多能性的干細(xì)胞標(biāo)志物[9]。Nanog 在某些生殖細(xì)胞腫瘤如睪丸原位癌、精原細(xì)胞瘤和胚胎性癌細(xì)胞株NCCIT等[10]，以及體細(xì)胞腫瘤如乳腺癌、胃癌和前列腺癌等[11]的表達(dá)已有相繼報(bào)道，它與這些腫瘤的生物學(xué)行為密切相關(guān)，高水平表達(dá)者進(jìn)展快、易發(fā)生復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移及預(yù)后差。在本研究中，60例食管鱗癌組織中有25例出現(xiàn)Nanog蛋白的陽(yáng)性表達(dá)，這些陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞在腫瘤組織中的分布形態(tài)多為點(diǎn)狀聚集，罕有灶狀或巢形聚集，說(shuō)明即使Nanog陽(yáng)性表達(dá)，也只是少部分細(xì)胞表達(dá)，這和某些學(xué)者提出的腫瘤干細(xì)胞在腫瘤組織中只占很少一部分的理論是符合的[12]。同時(shí)，Nanog陽(yáng)性表達(dá)率高的患者術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移發(fā)生率明顯高于陰性表達(dá)者，也說(shuō)明Nanog蛋白高表達(dá)的腫瘤侵襲性要高于低表達(dá)的腫瘤患者。

本研究通過(guò)對(duì)Nanog的分析發(fā)現(xiàn)，表達(dá)為陽(yáng)性表達(dá)的患者其轉(zhuǎn)移率明顯高于均為陰性患者。該項(xiàng)指標(biāo)的高表達(dá)提示腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)較低表達(dá)者更高，屬于預(yù)后不良因素。綜上所述，檢測(cè)食管癌術(shù)后患者Nanog的表達(dá)，可作為預(yù)測(cè)術(shù)后早期復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移及預(yù)后判斷有臨床意義的指標(biāo)，從而更好的指導(dǎo)個(gè)體化治療，提高患者的生存質(zhì)量。

參考文獻(xiàn)：

[1]He B， Yin B， Wang B， et al. MicroRNAs in esophageal cancer [J]. Mol Med Rep， 2012， 6（3）： 459-465.

[2]Helliwell TR. Molecular markers of metastasis in squamous carcinoma[J].J Pathol，2001， 194： 289-293.

[3]Reya T， Morrison SJ， Clarke MF， et al. Stem cells， cancer， and cancer stem cells [J]. Nature， 2001， 414（6859）：105-111.

[4]史亞飛，曹明智.乳腺癌干細(xì)胞的研究進(jìn)展[J].中華腫瘤防治雜志，2009，16（22）：1814-1817.

[5]朱峰，王敏，秦仁義，等.人胰腺癌干細(xì)胞對(duì)吉西他濱的敏感性及其分子機(jī)制研究[J].華中科技大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2010，39（3）：281-287.

[6]Yang ZF，Ho DW，Ng MN，et al.Significance of CD90+ cancer stem cells in human liver cancer[J]. Cancer Cell，2008，13（2）：153-166.

[7]李亞卓，趙坡.SGC-7901和MGC-803腫瘤干細(xì)胞中不同分子標(biāo)志表達(dá)的觀察[J].中華腫瘤防治雜志，2009，16（3）：167-171.

[8]Mitsui K，Tokuzawa Y，Itoh H，et al. The homeoprotein Nanog is required for maintenance of pluripotency in mouse epiblast and ES cells[J].Cell，2003，113（5）：631-642.

[9]Schwarz-Cruz-y-Celis A， Meléndez-Zajgla J. Cancer stem cells[J].Rev Invest Clin， 2011， 63（2）：179-186.

[10]You J S，Kang J K，Seo D W，et al. Depletion of embryonic stem cell signature by histone deacetylase inhibitor in NCCIT cells： involvement of Nanog suppression[J].Cancer Res，2009，69（ 14） ： 5716 -5725.

[11]Jcter C R，Badeanx M，ChoY C，et al. Functional evidence that the self - renewal gene NANOG regulates human tumor development[J]. Stem Cells，2009，27（5）：993 -1005.

[12]余宏，張昌明，吳永壽.腫瘤干細(xì)胞及其耐藥性的研究進(jìn)展[J].癌癥，2010，29（3）：279-283. 編輯/羅茗柯