基于nano LC-LTQ/Orbitrap MS分析山羊角中蛋白質(zhì)多肽類物質(zhì)

劉 睿，朱振華，錢大瑋，段金廒

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心，中藥資源產(chǎn)業(yè)化與方劑創(chuàng)新藥物國家地方聯(lián)合工程研究中心，江蘇 南京 210023；2.江蘇省海洋藥用生物資源研究與開發(fā)重點實驗室，江蘇 南京 210023；3.江蘇省方劑高技術(shù)研究重點實驗室，江蘇 南京 210023)

基于nano LC-LTQ/Orbitrap MS分析山羊角中蛋白質(zhì)多肽類物質(zhì)

劉 睿1,2,3，朱振華1,3，錢大瑋1,3，段金廒1,3

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心，中藥資源產(chǎn)業(yè)化與方劑創(chuàng)新藥物國家地方聯(lián)合工程研究中心，江蘇 南京 210023；2.江蘇省海洋藥用生物資源研究與開發(fā)重點實驗室，江蘇 南京 210023；3.江蘇省方劑高技術(shù)研究重點實驗室，江蘇 南京 210023)

基于shotgun混合蛋白質(zhì)鑒定思路，研究山羊角水提液中蛋白質(zhì)類、肽類物質(zhì)組成。采用超高分辨的線性離子阱-靜電場軌道阱質(zhì)譜(LTQ/Orbitrap MS)，從山羊角水提液中大于3 ku部位鑒定出52個蛋白質(zhì)，從小于3 ku部位鑒定出1 288個肽段，這些肽段源于46個蛋白質(zhì)。鑒定出的蛋白質(zhì)主要為角蛋白、膠原蛋白、角蛋白相關(guān)蛋白等結(jié)構(gòu)蛋白。根據(jù)每個氨基酸出現(xiàn)的頻次，將蛋白質(zhì)上的肽段標(biāo)記，繪制熱圖(heat map)，據(jù)此推測山羊角水提液中多肽類物質(zhì)形成的過程為：從蛋白質(zhì)的熱區(qū)(hot regions)中經(jīng)過降解、脫落、溶出，形成水提液中的各種肽段。該方法能夠快速、高效地分析鑒定山羊角水提液中蛋白質(zhì)肽類物質(zhì)組成，可用于角類動物藥蛋白質(zhì)類物質(zhì)組成與分析，也可為中藥動物藥的系統(tǒng)研究提供借鑒與方法參考。

山羊角；蛋白質(zhì)；肽類；shotgun；鑒定

山羊角(CapraeHircusCornu)味咸、性寒，具清熱、鎮(zhèn)驚、散瘀止痛之功效，《醫(yī)林纂要》中記載山羊角“功用近羚羊角”。由于羚羊角資源日漸緊缺，無法滿足臨床需求，國家行業(yè)部門研究比較了羚羊角與其他角類在抗驚厥、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、解熱等方面的功效特點[1-3]，于1987年6月發(fā)布《衛(wèi)生部關(guān)于推廣應(yīng)用鵝喉羚羊角、黃羊角、山羊角的通知》([87]衛(wèi)藥字第33號文)指出：“鵝喉羚羊角、黃羊角、山羊角同羚羊角具有相似功效，可以作為藥材供藥用”。因前兩者為國家二級保護動物，禁止捕殺，因此，目前中醫(yī)臨床調(diào)劑、中藥制藥行業(yè)等常以山羊角替代羚羊角使用，療效確切[4]。

山羊角的傳統(tǒng)用法為水煎煮得其提取液。現(xiàn)代研究表明，山羊角中含有豐富的蛋白質(zhì)類、肽類、核苷類物質(zhì)[5-6]，但山羊角水提液中的物質(zhì)組成有待深入研究。角質(zhì)類中藥經(jīng)高溫提取后，通常以蛋白質(zhì)經(jīng)非特異性降解得到的多肽片段為主[7]，這些肽段的親水性、疏水性、分子質(zhì)量分布、重復(fù)片段情況等與其生物活性密切相關(guān)。

基于串聯(lián)質(zhì)譜的shotgun技術(shù)是近年發(fā)展起來的用于混合蛋白質(zhì)、混合多肽快速鑒定的方法之一[5,7]。已有研究采用LC-MS/MS法分析賽加羚羊角提取物中的肽段信息，且確定這些肽段的來源蛋白為Ⅰ型角蛋白(Keratin, type Ⅰ)、Ⅱ型角蛋白(Keratin, type Ⅱ)、Ⅰ型膠原(Collagen Ⅰ)等[8]。本工作擬采用nano LC-LTQ/Orbitrap MS技術(shù)對山羊角水提液中的蛋白質(zhì)肽類物質(zhì)進行系統(tǒng)分析，確定其中蛋白信息、肽段序列、來源蛋白、分子質(zhì)量分布、片段重復(fù)情況等重要信息，希望為進一步開展山羊角功效物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供依據(jù)，也為中藥動物藥的系統(tǒng)研究提供借鑒與方法參考。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

戴安U3000 Nano RSLC納升液相系統(tǒng)：美國Dionex公司產(chǎn)品；Thermo LTQ Orbitrap XL質(zhì)譜儀：美國Thermo Fisher公司產(chǎn)品；Millipore Mini Pellicon超濾系統(tǒng)：美國Merck Millipore公司產(chǎn)品；BP 211D 電子天平：德國Sartorius公司產(chǎn)品；Rotavapor R-210旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：瑞士Buchi公司產(chǎn)品；Freezone 4.5 plus冷凍干燥機：美國Labconco公司產(chǎn)品。

十二烷基硫酸鈉(SDS)，二硫蘇糖醇(DTT)，碳酸氫銨，胰蛋白酶(Promega質(zhì)譜測序級)，乙腈，甲醇，甲酸等：均為質(zhì)譜級，德國Merck公司產(chǎn)品。

山羊角藥材：收集于江蘇省淮安市盱眙縣，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)段金廒教授鑒定為?？苿游锷窖駽aprahircusLinnaeus的角。

1.2 樣品制備

將山羊角去角塞、洗凈、粉碎后，加入10倍量的水煎煮兩次，第一次煎煮10 h，第二次煎煮8 h，合并濾液，以10 000 r/min離心10 min，取上清液，用超濾系統(tǒng)對上清液進行分段處理，選擇超濾膜的截留分子質(zhì)量為3 ku，經(jīng)超濾分離后，收集分子質(zhì)量低于3 ku的部位(F1)和高于3 ku的部位(F2)，分別濃縮，冷凍干燥后，置于-20 ℃保存。

取5 mg F2部位凍干粉，用50 mmol/L碳酸氫銨復(fù)溶，加入1%胰蛋白酶，于37 ℃反應(yīng)過夜，然后于90 ℃孵育5 min滅活后，以10 000 r/min離心10 min，取上清液，保存留用。

1.3 實驗條件

1.3.1 色譜條件 戴安U3000 nano RSLC納升液相系統(tǒng)，Reprosil C18 AQ色譜柱(75 μm×150 mm, 5 μm)；上樣量5 μL；流速400 nL/min；流動相：A為乙腈-甲酸水溶液(2∶0.2∶98，V/V/V)，B為乙腈-甲酸水溶液(80∶0.2∶20，V/V/V)；線性梯度洗脫：2%～30%B，150 min。

1.3.2 質(zhì)譜條件 選用Thermo LTQ Orbitrap XL質(zhì)譜儀進行肽段分析，噴霧電壓2.5 kV，離子傳輸毛細(xì)管溫度200 ℃；質(zhì)譜一級全掃描范圍為m/z300～2 000，分離寬度為3 u；串聯(lián)質(zhì)譜分析采用一級質(zhì)譜數(shù)據(jù)依賴的二級質(zhì)譜掃描模式，依次選取一級質(zhì)譜中離子強度最高的5個離子進行碰撞誘導(dǎo)解離(CID)二級串聯(lián)質(zhì)譜分析；采用Xcalibur軟件進行數(shù)據(jù)采集。

二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)采用PEAKS 7.5軟件進行搜庫鑒定分析，選擇?？?Bovidae，Uniport下載，bovidae_uniprot-taxonomy_9895，2015-6-28下載)數(shù)據(jù)庫，檢索參數(shù)設(shè)置為：前體離子誤差10×10-6，子離子誤差1 u，半胱氨酸殘基固定修飾(氨甲酰甲基化57.02 u)，甲硫氨酸殘基可變修飾(氧化+15.99 u)，N-端乙?；?+42.01 u)，氨基甲?；?+43.01 u)；允許2個位點誤切，假陽性率(FDR)≤1%；根據(jù)山羊角水提液樣品不同，選擇不同酶切方式：非酶切(No enzyme)或胰蛋白酶酶切(Trypsin)；其他為默認(rèn)參數(shù)，在上述檢索條件下所得分值有顯著性意義(p<0.05)，被認(rèn)定為有效的鑒定結(jié)果。

2 結(jié)果與討論

2.1 山羊角水提液中蛋白質(zhì)類物質(zhì)鑒定

基于shotgun蛋白質(zhì)鑒定方法，從山羊角F2部位中共鑒定了52個蛋白質(zhì)(唯一肽段數(shù)≥2)，其中13個角蛋白(Keratin, KRT)、4個膠原蛋白(Collagen)、3個角蛋白相關(guān)蛋白(Keratin-associated protein, KAPs)、2個微管蛋白(Tubulin)、1個熱休克蛋白(Heat shock protein)和一些其他未知功能蛋白等。以角蛋白為例，Ⅰ型角蛋白的唯一肽段數(shù)為5，而其總肽段數(shù)為84，鑒定的肽段在蛋白質(zhì)中的覆蓋率達(dá)到56.07%，可確定為角蛋白(sp|P02534|K1M1_SHEEP)。

山羊角中含有大量的角蛋白、膠原蛋白等水溶性蛋白質(zhì)，在高溫煎煮條件下，蛋白質(zhì)原有的結(jié)構(gòu)被破壞，如發(fā)生二硫鍵斷裂、空間結(jié)構(gòu)改變、非特異性水解等，從而產(chǎn)生變性蛋白或非特異性降解蛋白溶出，進入水提液中。山羊角水提液經(jīng)超濾分離后，F(xiàn)2部位主要為分子質(zhì)量大于3 ku的變性蛋白或蛋白碎片。通過本實驗的鑒定方法無法確定這些蛋白質(zhì)經(jīng)過變性、降解后，以哪些變性蛋白或降解蛋白的形式存在于水提液中，僅能確定水提液中存在的變性蛋白或降解蛋白是源于這52個蛋白質(zhì)。

2.2 山羊角水提液中肽類成分的分析與鑒定

山羊角水提液經(jīng)超濾分段后，F(xiàn)1部位主要成分為分子質(zhì)量小于3 ku的肽段，根據(jù)F1的MS/MS質(zhì)譜碎片信息，采用非酶切(No enzyme)模式進行數(shù)據(jù)庫比對分析，從F1中共分析鑒定了1 288個多肽的氨基酸序列信息，這些肽段為46個蛋白質(zhì)的降解產(chǎn)物(唯一肽段數(shù)≥2)，其中包括19個角蛋白(KRT)，4個角蛋白相關(guān)蛋白(KAPs)。

在鑒定的1 288個肽段中，對每個氨基酸殘基出現(xiàn)的次數(shù)進行統(tǒng)計，其出現(xiàn)頻次示于圖1。其中，谷氨酸(Glu, E)出現(xiàn)次數(shù)最多，達(dá)2 002次；其他的親水氨基酸，如天冬氨酸(Asp, D)、甘氨酸(Gly, G)、賴氨酸(Lys, K)、天冬酰胺(Asn, N)、谷氨酰胺(Gln, Q)、精氨酸(Arg, R)、絲氨酸(Ser, S)及蘇氨酸(Thr, T)出現(xiàn)次數(shù)均大于800次；疏水氨基酸僅有丙氨酸(Ala, A)、異亮氨酸(Ile, I)、亮氨酸(Leu, L)及纈氨酸(Val, V)出現(xiàn)次數(shù)大于800次。親水氨基酸出現(xiàn)的次數(shù)總和為11 182次，疏水氨基酸出現(xiàn)的次數(shù)總和為6 860次。以上結(jié)果表明，山羊角水提液中的肽段多數(shù)具有親水性。肽段的分子質(zhì)量分布統(tǒng)計結(jié)果示于圖2?？梢?，肽段的分子質(zhì)量介于715.27～3 763.63 u之間，其中，81.68%的肽段分子質(zhì)量低于2 000 u。通常認(rèn)為，肽段的分子質(zhì)量低于2 000 u將有利于肽段透過生物屏障發(fā)揮功效[9]。

圖1 山羊角水提液F1所有肽段中氨基酸的出現(xiàn)頻次Fig.1 Frequencies of the amino acids in all identified peptides in F1 of Caprae Hircus Cornu

圖2 山羊角水提液F1中所有肽段的分子質(zhì)量分布Fig.2 MW distribution of the identified peptides in F1 of Caprae Hircus Cornu

通過nano LC-MS/MS結(jié)合蛋白質(zhì)搜庫鑒定的思路，鑒定了山羊角水提液中可溶性肽段與蛋白質(zhì)信息。肽段的氨基酸序列表明，這些肽段多數(shù)源于KRT和KAPs，鑒定結(jié)果可在一定程度上解釋山羊角水提液中肽段的形成過程。根據(jù)每個氨基酸出現(xiàn)的頻次，將蛋白質(zhì)上的肽段標(biāo)記，繪制“熱圖(heat map)”，示于圖3。圖中，顏色越紅，表明氨基酸出現(xiàn)頻次越高，蛋白質(zhì)的這部分肽段可被認(rèn)為是一個“熱區(qū)(hot regions)”，處于熱區(qū)內(nèi)的氨基酸為出現(xiàn)頻次較高的氨基酸序列，表明這些肽段的序列易于降解、脫落、溶出，最終形成提取液中的各種肽段[10]。

以角蛋白(Keratin 34，E3VW79_SHEEP)為例，山羊角水提液中共有221個肽段源于該蛋白，其中14個是唯一肽段，唯一肽段數(shù)>2，可確定該蛋白為山羊角水提液中肽段的來源蛋白之一。肽段(G69-R82)的鑒定圖和肽段在Keratin 34中的分布情況示于圖4。根據(jù)MS/MS圖譜與蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫比對搜庫結(jié)果，確定肽段的氨基酸序列，以肽段GNEKETMQ-FLNDR為例，m/z791.37的主要碎片離子峰包括y1+(175.12)、y2+(290.15)、y3+(404.19)、y4+(517.27)、y5+(664.34)、y6+(792.40)、y7+(923.44)、y8+(1 024.49)、y9+(1 153.53)、y10+(1 281.64)、b3+(301.11)、b5+(558.25)、b6+(659.30)。經(jīng)鑒定，GNEKETMQFLNDR源于Keratin 34，E3VW79_SHEEP蛋白的G69-R82肽段。GNEKETMQFLNDR可能的產(chǎn)生過程為：在高溫煎煮過程中，蛋白質(zhì)變性、溶出，釋放出肽段S67-L114，而后，肽段進一步降解，釋放出更多短肽段，其中G69-R82肽段GNEKETMQFLNDR可能是進一步水解釋放的產(chǎn)物。

注：每個氨基酸的出現(xiàn)頻次用不同顏色表示圖3 角蛋白Keratin 34的熱圖Fig.3 Heat maps of Keratin 34

圖4 肽段(G69-R82)(a)的鑒定圖和Keratin 34中的肽段分布圖(b)Fig.4 Identification of a hydrolysis peptide (G69-R82) (a) and sequence of Keratin 34 and the distribution of identified peptides (b)

3 結(jié)論

角類動物藥的臨床使用不可或缺，近年來的研究表明，山羊角作為羚羊角的替代資源應(yīng)用廣泛，且功效確切。根據(jù)傳統(tǒng)民間兒科驗方“羚羊清肺散”開發(fā)的現(xiàn)代中藥“金振口服液”，工業(yè)生產(chǎn)以山羊角替代羚羊角制備而成，經(jīng)臨床驗證，以羚羊角和以山羊角制備的金振口服液均具有良好的解熱、抗炎作用和清熱解毒、祛痰止咳的功效[4]。

山羊角水提液中主要含有的蛋白質(zhì)類、肽類物質(zhì)為角蛋白、膠原蛋白、角蛋白相關(guān)蛋白等的降解產(chǎn)物，這些蛋白質(zhì)屬于結(jié)構(gòu)蛋白，在動物表皮、蹄甲、角質(zhì)等組織中含量豐富，角蛋白是外胚層細(xì)胞的結(jié)構(gòu)蛋白，是動物體毛發(fā)、蹄甲、角、鱗片等的重要組成成分，具有保護機體的作用；膠原蛋白是細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)蛋白，是動物結(jié)締組織中的主要成分；橋粒蛋白是細(xì)胞骨架的組成部分，參與細(xì)胞的角質(zhì)形成。山羊角在高溫煎煮條件下，蛋白分子間或分子內(nèi)的二硫鍵斷裂、水解，會有部分角蛋白或膠原蛋白溶出，并可能與多肽形成混合物，這些混合多肽為非特異性降解的產(chǎn)物[11]。山羊角水提液中的混合多肽成分，如肽段VKARLESEINTYRG、RLESEINTYRG、TYRGLLDSE和SKLPSNP-CATTN等，均源于角蛋白Keratin 34(E3VW79_SHEEP)的C末端肽段V361-N392，VKARLES-EINTYRGLLDSEDSKLPSNPCATTN只是裂解位點不同。

一直以來角類動物藥的物質(zhì)基礎(chǔ)研究缺乏合適的方法學(xué)，本實驗在前期研究基礎(chǔ)上，建立了基于nano LC-LTQ/Orbitrap MS的shotgun技術(shù)分析山羊角中蛋白質(zhì)多肽類物質(zhì)的研究策略，可快速分析并鑒定山羊角水提液中混合蛋白質(zhì)類、多肽類物質(zhì)組成，其結(jié)果可為角類動物藥，乃至中藥動物藥的蛋白質(zhì)、肽類物質(zhì)基礎(chǔ)研究奠定基礎(chǔ)。

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Analysis and Identification of Proteins and Peptides from Goat Horn (CapraeHircusCornu) Using nano LC-LTQ/Orbitrap MS

LIU Rui1,2,3, ZHU Zhen-hua1,3, QIAN Da-wei1,3, DUAN Jin-ao1,3

(1.JiangsuCollaborativeInnovationCenterofChineseMedicinalResourcesIndustrialization,NationalandLocalCollaborativeEngineeringCenterofChineseMedicinalResourcesIndustrializationandFormulaeInnovativeMedicine,NanjingUniversityofChineseMedicine,Nanjing210023,China;2.JiangsuKeyLaboratoryofResearchandDevelopmentinMarineBio-resourcePharmaceutics,Nanjing210023,China;3.JiangsuKeyLaboratoryforHighTechnologyResearchofTCMFormulae,Nanjing210023,China)

The objective of the present study was to study the proteins and peptides of goat horn (CapraeHircusCornu, GH) based on the shotgun strategy. By using LTQ/Orbitrap MS, proteins and peptides were identified from GH aqueous extract. In total, 52 proteins were identified from GH fraction with the molecular weight larger than 3 ku, and 1 288 peptides were identified from GH fraction with the molecular weight lower than 3 ku, and these peptides were hydrolyzed from 46 proteins. The identified proteins were keratin, collagen, keratin-associated protein, etc. It can be speculated that the particular “hot regions” in the amino acid sequence which were easier to proteolysis, drop, dissolve and generate a number of peptides. According to the present strategy, proteins and peptides derived from GH aqueous extract can be rapid and efficient identified. The strategy can be applied in analysis and identification of proteins in animal horn derived TCMs, and provide a reference for investigate the material basis of animal horn derived TCMs.

goat horn (CapraeHircusCornu, GH); protein; peptides; shotgun; identification

2016-11-16;

2016-12-26

國家自然科學(xué)基金項目(81202861，81274017)；江蘇高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程項目(PAPD)；江蘇省高校“青藍(lán)工程”優(yōu)秀青年骨干教師項目(2016年)；江蘇省“333工程”第三層次項目(2016年)資助

劉 睿(1982—)，男(漢族)，南京人，副研究員，從事中藥動物藥物質(zhì)基礎(chǔ)研究。E-mail: cpulr@126.com

段金廒(1956—)，男(漢族)，寧夏中衛(wèi)人，教授，從事中藥資源化學(xué)研究。E-mail: dja@njucm.edu.cn

O657.63

A

1004-2997(2017)01-0109-07

10.7538/zpxb.2017.38.01.0109