基于HPLC-MS/MS法研究馬兜鈴酸Ⅰ和馬兜鈴酸Ⅱ的大鼠肝微粒體酶S9體外代謝

周 慧，付 佳，蔡宗葦

(1.吉林大學(xué)珠海學(xué)院，廣東 珠海 519041；2.香港浸會(huì)大學(xué)化學(xué)系，香港特別行政區(qū))

基于HPLC-MS/MS法研究馬兜鈴酸Ⅰ和馬兜鈴酸Ⅱ的大鼠肝微粒體酶S9體外代謝

周 慧1，付 佳1，蔡宗葦2

(1.吉林大學(xué)珠海學(xué)院，廣東 珠海 519041；2.香港浸會(huì)大學(xué)化學(xué)系，香港特別行政區(qū))

馬兜鈴酸Ⅰ和馬兜鈴酸Ⅱ廣泛存在于馬兜鈴屬植物中，具有腎損傷毒性和致癌致突變毒性。為了研究馬兜鈴酸類化合物的毒性產(chǎn)生機(jī)制，建立了馬兜鈴酸Ⅰ和馬兜鈴酸Ⅱ及其大鼠肝微粒體酶S9代謝物分離與鑒定的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)分析方法。采用體外代謝法分別研究了有氧和厭氧孵育條件下，馬兜鈴酸Ⅰ和馬兜鈴酸Ⅱ在大鼠肝微粒體酶S9作用下的代謝行為，并對(duì)各代謝物進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征。研究結(jié)果顯示：馬兜鈴酸Ⅰ在有氧條件下生成的代謝產(chǎn)物為馬兜鈴酸Ⅰa，在厭氧條件下生成的代謝產(chǎn)物為馬兜鈴內(nèi)酰胺Ⅰ；馬兜鈴酸Ⅱ只在厭氧條件下生成了馬兜鈴內(nèi)酰胺Ⅱ。馬兜鈴內(nèi)酰胺類化合物的生成是馬兜鈴酸Ⅰ和馬兜鈴酸Ⅱ在肝微粒體酶S9代謝過程中毒性產(chǎn)生的主要原因。該結(jié)果對(duì)于更好地理解馬兜鈴酸Ⅰ和馬兜鈴酸Ⅱ的毒性作用機(jī)制，控制毒副反應(yīng)的發(fā)生具有一定意義。

馬兜鈴酸Ⅰ；馬兜鈴酸Ⅱ；肝微粒體；代謝；高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)

馬兜鈴屬植物(馬兜鈴、關(guān)木通等)具有廣泛的生物活性和藥理作用，如抗腫瘤、抗菌、抗炎以及鎮(zhèn)痛等。馬兜鈴酸Ⅰ和馬兜鈴酸Ⅱ是馬兜鈴科植物的活性成分，同時(shí)也被認(rèn)為是腎毒性和致癌致突變性的主要成分[1-7]。但是，關(guān)于馬兜鈴酸類化合物引起毒性的機(jī)制尚不明確，且該類化合物在人體內(nèi)的吸收、分布、代謝及消除過程也未被充分闡明。因此，研究馬兜鈴酸類化合物的體外代謝行為，不僅有助于進(jìn)一步闡釋該類物質(zhì)的體內(nèi)代謝行為，并且也有助于深入研究馬兜鈴酸類化合物的毒理機(jī)制，從而為其毒副作用的防治提供理論依據(jù)。

肝臟是藥物的重要代謝器官，是藥物生物轉(zhuǎn)化的主要場(chǎng)所，該系統(tǒng)富含參與藥物代謝的龐大的依賴細(xì)胞色素的混合功能氧化酶，大多數(shù)藥物的Ⅰ相和Ⅱ相代謝反應(yīng)都是在肝藥酶系統(tǒng)的參與下發(fā)生的。體外肝臟代謝研究不僅可以排除體內(nèi)諸多因素的干擾，還具有反應(yīng)干擾小、操作簡單、代謝條件易于控制等優(yōu)點(diǎn)；同時(shí)，體外代謝還能迅速有效地解決藥物代謝中的關(guān)鍵問題，例如代謝物結(jié)構(gòu)鑒定、代謝途徑推斷等，它可為體內(nèi)代謝研究提供重要的線索和依據(jù)[8-10]。

本研究擬采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)法研究馬兜鈴酸Ⅰ和馬兜鈴酸Ⅱ的代謝行為，并總結(jié)其質(zhì)譜碎裂特征。在此基礎(chǔ)上，分析馬兜鈴酸Ⅰ和馬兜鈴酸Ⅱ與大鼠肝微粒體S9組分在有氧和厭氧條件下孵育產(chǎn)生的體外代謝產(chǎn)物，結(jié)合串聯(lián)質(zhì)譜信息，對(duì)其代謝物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。希望該研究能夠?yàn)槊鞔_馬兜鈴酸類化合物的毒理機(jī)制，控制毒副反應(yīng)的發(fā)生提供方法學(xué)參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與裝置

HP 1100液相色譜：美國Hewlett-Packard公司產(chǎn)品；Esquire 4000離子阱質(zhì)譜儀：德國Bruker公司產(chǎn)品；Sanorius BSl10S分析天平：北京賽多利斯有限公司產(chǎn)品；Eppendorf 5810R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)：德國Eppendorf 公司產(chǎn)品；MDF-382E型超低溫冰箱：日本SANYO公司產(chǎn)品。

1.2 主要材料與試劑

馬兜鈴酸Ⅰ和馬兜鈴酸Ⅱ標(biāo)準(zhǔn)品：美國Acros公司產(chǎn)品；還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷磷酸(NADPH)：日本Oriental Yeast Co.公司產(chǎn)品；二甲基亞砜(DMSO)：澳大利亞AJAX Chemicals公司產(chǎn)品；甲醇、乙腈：均為色譜純，美國Tedia公司產(chǎn)品；純凈水：由Milli-Q超純水處理系統(tǒng)制得；其他試劑均為分析純。

清潔級(jí)雄性SD大鼠10只，其質(zhì)量為(200±20) g，由香港中文大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.3 實(shí)驗(yàn)條件

1.3.1 色譜條件 色譜柱：Waters Symmetry C18柱(150 mm×2.1 mm, 3.5 μm)；流動(dòng)相：0.1%甲酸水溶液(A)，乙腈(B)；洗脫條件：0～5 min(30%～42%B)，5～10 min(42%～46%B)，10～15 min(46%～50%B)，15～35 min(50%～65%B)；流速0.3 mL/min；柱溫28 ℃；進(jìn)樣體積5 μL。

1.3.2 質(zhì)譜條件 電噴霧電離源(ESI)，正離子全掃描模式，質(zhì)量掃描范圍m/z100～500，噴霧電壓4.0 kV，干燥氣溫度300 ℃，干燥氣流速8.0 L/min，霧化氣壓力200 Pa，源內(nèi)碰撞誘導(dǎo)解離氣為氦氣。

1.4 肝微粒體S9組分的制備

雄性SD大鼠在濕度和溫度可控制的動(dòng)物房適應(yīng)1周，自由進(jìn)水進(jìn)食，動(dòng)物房燈光按12 h方式自動(dòng)交替開關(guān)。一周后，處死SD大鼠，迅速取出肝臟，用冰冷的生理鹽水清洗并稱其質(zhì)量；將肝臟剪成小塊后，用4倍質(zhì)量的冰冷的磷酸緩沖液(PBS 緩沖液，pH 7.4，100 mmol/L)制成20%勻漿，于4 ℃下以9 000 r/min離心10 min，棄去上層脂質(zhì)和下層沉淀物后的上清液即為大鼠肝微粒體S9組分。

1.5 體外代謝反應(yīng)及樣品制備

1.5.1 有氧條件下的體外孵育 分別取60 μmol馬兜鈴酸Ⅰ和馬兜鈴酸Ⅱ標(biāo)準(zhǔn)溶液于1.5 mL聚苯乙烯管中，加入4 μmol NADPH，5 μmol葡萄糖-6-磷酸，8 μmol氯化鎂和1.65 μmol氯化鉀，混勻后置于37 ℃水浴中預(yù)孵育5 min，再加入500 μL蛋白質(zhì)濃度為2.0 g/L肝微粒體S9組分的KCl-PBS緩沖溶液，分別得到馬兜鈴酸Ⅰ和馬兜鈴酸Ⅱ在有氧條件下的孵育體系。將孵育體系置于37 ℃水浴中，孵育0 min和60 min后，分別取100 μL孵育混合溶液，加入2倍體積的冰冷的乙酸乙酯，萃取2次，收集上清液，合并后于37 ℃氮?dú)飧稍?；最后?0 μL甲醇溶解樣品，供LC/MS測(cè)定。每組平行做3份。

1.5.2 厭氧條件下的體外孵育 厭氧條件下的孵育溶液的制備與有氧條件下的相同。接下來，在孵育體系中通入15 min氬氣并密封，將孵育體系置于37 ℃水浴中，孵育0 min和60 min后，分別取100 μL孵育混合溶液，按照有氧條件下的樣品制備方法得到馬兜鈴酸Ⅰ或馬兜鈴酸Ⅱ在厭氧條件下的體外孵育樣品。每組平行做3 份。

2 結(jié)果與討論

2.1 馬兜鈴酸Ⅰ和馬兜鈴酸Ⅱ的液相色譜-質(zhì)譜分析

馬兜鈴酸Ⅰ和馬兜鈴酸Ⅱ及其代謝產(chǎn)物的LC/MS提取離子流色譜圖示于圖1。

圖1 馬兜鈴酸Ⅰ(a)和馬兜鈴酸Ⅱ(b)及其代謝產(chǎn)物(c～e)的LC/MS提取離子流色譜圖Fig.1 Selective ion chromatogram of aristolochic acid Ⅰ (a), aristolochic acid Ⅱ (b) and their in-vitro metabolites (c-e)

馬兜鈴酸Ⅰ的保留時(shí)間為17.12 min，準(zhǔn)分子離子為[M+NH4]+m/z359和[M+H]+m/z342。m/z359離子在二級(jí)質(zhì)譜中生成碎片離子m/z324 [M+H—H2O]+、m/z298 [M+H—CO2]+和m/z296 [M+H—NO2]+，其中m/z298離子的豐度最高，其裂解途徑示于圖2，這與文獻(xiàn)[11]報(bào)道的馬兜鈴酸Ⅰ的碎裂方式一致。

馬兜鈴酸Ⅱ的保留時(shí)間為16.65 min，準(zhǔn)分子離子為[M+NH4]+m/z329和[M+H]+m/z312。m/z329離子在二級(jí)質(zhì)譜中生成碎片離子m/z294 [M+H—H2O]+、m/z268[M+H—CO2]+(基峰)和m/z238[M+H—CO2—CH2O]+，其裂解途徑示于圖3?？梢钥闯?，馬兜鈴酸Ⅱ與馬兜鈴酸Ⅰ具有相似的電噴霧質(zhì)譜規(guī)律，即在一級(jí)質(zhì)譜中易形成[M+NH4]+加合離子，在二級(jí)質(zhì)譜中易發(fā)生CO2中性碎片丟失。

圖2 馬兜鈴酸Ⅰ的二級(jí)質(zhì)譜圖(a)和裂解途徑(b)Fig.2 MS2 of aristolochic acid Ⅰ [M+NH4]+m/z 359 (a) and fragmentation pathways proposed (b)

圖3 馬兜鈴酸Ⅱ的二級(jí)質(zhì)譜圖(a)和裂解途徑(b)Fig.3 MS2 of aristolochic acid Ⅱ [M+NH4]+m/z 329 (a) and fragmentation pathways proposed (b)

2.2 馬兜鈴酸Ⅰ和馬兜鈴酸Ⅱ體外大鼠肝微粒體S9代謝產(chǎn)物分析

馬兜鈴酸Ⅰ和大鼠肝微粒體S9組分在有氧條件下孵育60 min后的反應(yīng)體系與相同條件下孵育0 min后的反應(yīng)體系相比，在總離子流色譜圖中，保留時(shí)間16.25 min處檢測(cè)到馬兜鈴酸Ⅰ的代謝產(chǎn)物峰(圖1c)，其準(zhǔn)分子離子[M+NH4]+m/z345比馬兜鈴酸Ⅰ的準(zhǔn)分子離子[M+NH4]+m/z359減少了14 u，這可能是馬兜鈴酸Ⅰ的甲氧基丟失亞甲基形成羥基所致。MS2中的碎片離子為m/z328、310、284、282，均比對(duì)應(yīng)的馬兜鈴酸Ⅰ在同樣條件下所得的MS2碎片離子m/z342、324、298、296減少了14 u，說明兩者具有相似的斷裂方式，故可初步推斷其代謝產(chǎn)物與馬兜鈴酸Ⅰ的結(jié)構(gòu)相似。分析馬兜鈴酸Ⅰ在有氧孵育下代謝產(chǎn)物的二級(jí)質(zhì)譜發(fā)現(xiàn)，其裂解規(guī)律與文獻(xiàn)[12-13]報(bào)道的馬兜鈴酸Ⅰa相同，故鑒定為馬兜鈴酸Ⅰa，質(zhì)譜圖及裂解途徑示于圖4a。其中，m/z328離子為馬兜鈴酸Ⅰa的[M+H]+峰，m/z310、284、282離子為馬兜鈴酸Ⅰa [M+H]+離子分別脫去水(—H2O)、二氧化碳(—CO2)以及丟失硝基(—NO2)而得到的碎片離子。

馬兜鈴酸Ⅰ在厭氧條件下孵育的代謝產(chǎn)物保留時(shí)間為19.52 min(圖1d)，準(zhǔn)分子離子為[M+H]+m/z294。m/z294離子在二級(jí)質(zhì)譜中分別丟失甲基(—CH3)、乙?；?—CH3CO)以及同時(shí)丟失乙酰基和甲醛(—CH3CO—CH2O)而生成m/z279、251、221碎片離子，其質(zhì)譜圖及裂解途徑示于圖4b。這與文獻(xiàn)[12-13]報(bào)道的馬兜鈴內(nèi)酰胺Ⅰ的質(zhì)譜裂解規(guī)律一致，據(jù)此推測(cè)馬兜鈴酸Ⅰ在厭氧孵育條件下的代謝產(chǎn)物為馬兜鈴內(nèi)酰胺Ⅰ。

同樣，分別在有氧和厭氧條件下對(duì)馬兜鈴酸Ⅱ和大鼠微粒體S9組分進(jìn)行孵育，但僅檢測(cè)到厭氧條件下孵育的代謝產(chǎn)物(圖1e)，其保留時(shí)間為18.68 min，準(zhǔn)分子離子為[M+H]+m/z264。在二級(jí)質(zhì)譜中，m/z264離子丟失一分子甲醛(CH2O)產(chǎn)生m/z234離子；同時(shí)丟失CH2O和CO產(chǎn)生m/z206離子；同時(shí)丟失CH2O、CO和HCN產(chǎn)生m/z179離子，其質(zhì)譜圖及裂解途徑示于圖4c。結(jié)合文獻(xiàn)[12-13]報(bào)道，推測(cè)馬兜鈴酸Ⅱ在厭氧孵育條件下的代謝產(chǎn)物為馬兜鈴內(nèi)酰胺Ⅱ。

以上研究結(jié)果表明，馬兜鈴酸Ⅰ和馬兜鈴酸Ⅱ的代謝反應(yīng)類型與孵育體系中是否含氧密切相關(guān)。馬兜鈴酸Ⅰ在有氧條件下的代謝反應(yīng)主要是去甲基化，生成無毒的馬兜鈴酸Ⅰa，從而起到解毒作用；而在厭氧條件下的代謝反應(yīng)是硝基還原，生成毒性較強(qiáng)的馬兜鈴內(nèi)酰胺Ⅰ。馬兜鈴酸Ⅱ在有氧條件下沒有發(fā)生變化，只有在厭氧條件下發(fā)生了硝基還原反應(yīng)，生成毒性較弱的馬兜鈴內(nèi)酰胺Ⅱ。由此可見，馬兜鈴酸的毒性成分主要來源于馬兜鈴酸在厭氧條件下的代謝產(chǎn)生的馬兜鈴內(nèi)酰胺類成分。據(jù)文獻(xiàn)[14]報(bào)道，馬兜鈴內(nèi)酰胺類成分能夠入腎小管上皮細(xì)胞，并蓄積于胞漿內(nèi)，進(jìn)而發(fā)生毒性作用。另一方面，由于馬兜鈴內(nèi)酰胺類成分具有較強(qiáng)的親電能力，能與DNA堿基環(huán)外氨基親電結(jié)合，生成相應(yīng)的加合產(chǎn)物，直接損傷DNA[15]。

3 結(jié)論

本研究利用體外肝微粒體代謝方法結(jié)合高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，建立了馬兜鈴酸及其體外代謝產(chǎn)物的分析方法。研究表明，馬兜鈴酸Ⅰ和馬兜鈴酸Ⅱ在體外肝微粒體代謝中主要發(fā)生硝基還原和去甲基反應(yīng)。其中，由硝基還原反應(yīng)形成的馬兜鈴內(nèi)酰胺類化合物是馬兜鈴酸產(chǎn)生毒性作用的主要原因，該方法對(duì)于闡明馬兜鈴酸的毒理有重要意義。

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圖4 馬兜鈴酸Ⅰ和馬兜鈴酸Ⅱ的代謝產(chǎn)物的二級(jí)質(zhì)譜圖和裂解途徑Fig.4 MS2 and fragmentation pathways proposed of metabolites of aristolochic acid Ⅰ and aristolochic acid Ⅱ

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Research of Aristolochic Acid Ⅰ, Aristolochic Acid Ⅱ and Their Metabolites in Rat Liver Microsomes Using HPLC-MS/MS

ZHOU Hui1, FU Jia1, CAI Zong-wei2

(1.DepartmentofChemistryandPharmacy,ZhuhaiCollegeofJilinUniversity,Zhuhai519041,China;2.DepartmentofChemistry,HongKongBaptistUniversity,HongKongSAR,China)

Aristolochic acids (AAs), derived from aristolochia plant species, are a mixture of structural-related compounds. Aristolochic acid Ⅰ and aristolochic acid Ⅱ are reported to be the major components that are associated with kidney damage toxicity and carcinogenic mutagenicity toxicity. Since the toxicity mechanism of action of Aristolochic acids are still unclear, it is necessary to develop a sensitive analytical method to facilitate these studies. In this work, a rapid and sensitive method based on high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS) was applied for the determination of aristolochic acid Ⅰ, aristolochic acid Ⅱ and their major metabolites in samples from in vitro metabolism studies. Aristolochic acid Ⅰ and aristolochic acid Ⅱ were incubated with rat liver microsome S9 fractions under aerobic and anaerobic conditions. The incubation samples were analyzed by HPLC-MS/MS. The obtained results showed that the in vitro metabolic pathways of aristolochic acid Ⅰ and aristolochic acid Ⅱ are different. The metabolites of aristolochic acid Ⅰ was detected and characterized as aristolochic acid Ⅰa under aerobic condition and aristololactam Ⅰ under anaerobic condition, respectively; however, in the case of aristolochic acid Ⅱ, the only metabolite of aristolochic acid Ⅱ was identified as aristololactam Ⅱ under the anaerobic condition. Besides, the fragmentation behaviors of aristolochic acid Ⅰ, aristolochic acid Ⅱ and their metabolites in rat liver microsomes S9 fractions were characterized and summarized. The results indicated that the production of aristololactams is the main cause of the toxicity of aristolochic acid Ⅰ and aristolochic acid Ⅱ in the metabolism of rat liver microsome S9. This study have a certain significance for better understanding of the toxicity mechanism of action of aristolochic acid Ⅰ and aristolochic acid Ⅱ, as well as for toxicity monitoring of aristolochia plants.

aristolochic acid Ⅰ; aristolochic acid Ⅱ; rat liver S9 fractions; metabolism; high perform liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS)

2016-03-04;

2016-03-27

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81403077)；廣東省自然科學(xué)基金博士啟動(dòng)項(xiàng)目(2014A030310494)資助

周 慧(1982—)，女(漢族)，吉林長春人，副教授，從事質(zhì)譜分析研究。E-mail: zhouhuimslab@163.com

蔡宗葦(1962—)，男(漢族)，福建福州人，教授，從事質(zhì)譜分析研究。E-mail: zwcai@hkbu.edu.hk

O657.63

A

1004-2997(2017)01-0030-07

10.7538/zpxb.2017.38.01.0030