一株產(chǎn)胞外多糖土壤細(xì)菌培養(yǎng)條件的優(yōu)化

尚天翠， 衛(wèi) 剛， 趙 玉

(1. 伊犁師范學(xué)院 生物與地理科學(xué)學(xué)院，伊寧 835000； 2. 新疆伊寧衛(wèi)生學(xué)校 專業(yè)基礎(chǔ)學(xué)科，伊寧 835000)

一株產(chǎn)胞外多糖土壤細(xì)菌培養(yǎng)條件的優(yōu)化

尚天翠1， 衛(wèi) 剛2， 趙 玉1

(1. 伊犁師范學(xué)院 生物與地理科學(xué)學(xué)院，伊寧 835000； 2. 新疆伊寧衛(wèi)生學(xué)校 專業(yè)基礎(chǔ)學(xué)科，伊寧 835000)

對(duì)從新疆伊犁霍城縣大西溝野生櫻桃李林分離篩選的一株具有產(chǎn)胞外多糖能力的土壤細(xì)菌L20309的發(fā)酵條件進(jìn)行了初步研究。結(jié)果表明，土壤細(xì)菌L20309 產(chǎn)胞外多糖的最佳碳源、氮源分別為葡萄糖和蛋白胨，碳氮源最佳質(zhì)量濃度分別為20 g/L和30 g/L；最佳培養(yǎng)條件為:培養(yǎng)基初始pH 7.0，培養(yǎng)基裝量500 mL/L，接種量5%，培養(yǎng)溫度28℃。在此條件下培養(yǎng)72 h，土壤細(xì)菌L20309產(chǎn)胞外多糖2.562 μg/mL。

土壤細(xì)菌；胞外多糖；培養(yǎng)基優(yōu)化；發(fā)酵

微生物胞外多糖(exopolysaccharides,EPS)不僅是微生物適應(yīng)所在環(huán)境的代謝產(chǎn)物，而且是具有自我保護(hù)的一類長(zhǎng)鏈化合物[1-2]。因具有容易分離，性質(zhì)穩(wěn)定等生物學(xué)特點(diǎn)，在醫(yī)藥、食品等多個(gè)行業(yè)具有潛在的發(fā)展前景[3-6]，已成為人們研究的熱點(diǎn)之一。所以，研究和開發(fā)微生物產(chǎn)胞外多糖的性能具有廣闊的商業(yè)價(jià)值。但是營養(yǎng)物質(zhì)(碳源、氮源)和發(fā)酵培養(yǎng)條件(溫度、pH值、裝液量等)影響微生物產(chǎn)胞外多糖，從而影響了細(xì)菌的生長(zhǎng)速率和胞外多糖的積累[7]。張熹等[8]的研究結(jié)果表明，影響胞外多糖產(chǎn)糖效果的最適碳源和氮源分別是葡萄糖和硫酸銨。張曉玲等[9]研究了枯草芽孢桿菌胞外多糖產(chǎn)生的發(fā)酵培養(yǎng)條件，最終得到了高純度的多糖，為提取高產(chǎn)量的胞外多糖提供了理論依據(jù)。因此，目前的首要工作是優(yōu)化微生物胞外多糖的培養(yǎng)條件。本文通過L9(34)正交試驗(yàn)優(yōu)化了土壤細(xì)菌L20309產(chǎn)胞外多糖的培養(yǎng)條件，旨在為發(fā)酵工藝提供實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

土壤細(xì)菌L20309，由新疆伊犁霍城縣的大西溝分離純化得到，保藏在伊犁師范學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室。

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(ABA)：牛肉膏5.0 g、蛋白胨10.0 g、NaCl 5.0 g、瓊脂粉16～20 g、蒸餾水1L、pH 7.2～7.4。

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基+土壤浸提液：葡萄糖 1 g、 蒸餾水800 mL、牛肉膏3.0 g、K2HPO40.5 g、CaCO30.5 g、蛋白胨5.0 g、土壤浸提液200 mL、瓊脂 16～20 g、pH 7.2～7.4 。

LB培養(yǎng)基(種子培養(yǎng)基)：牛肉膏5.0 g、蛋白胨10.0 g、NaCl 5.0 g、蒸餾水1L、pH 7.0～7.2。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖2%、蛋白胨2%、MgSO40.05%、Na2HPO40.2%、NaH2PO40.1%、pH 7.0。

1.2 儀器與設(shè)備

YXQ-LS-75SII立式壓力蒸汽滅菌器(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)；HC-3018R高速冷凍離心機(jī)(安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司)；HSP-250恒溫恒濕培養(yǎng)箱(金壇市鑫鑫實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)；HH.S21-8數(shù)顯恒溫水浴鍋(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)；BS-1E智能型振蕩培養(yǎng)箱(金壇市正基儀器有限公司)；UV2600PC紫外、可見分光光度計(jì)(上海舜宇恒平科學(xué)有限儀器公司)；QYC-200全溫培養(yǎng)搖床(上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司)；TB-214電子天平(北京丹佛儀器有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 發(fā)酵方法[10]

將菌株活化后接種到裝有種子培養(yǎng)基的三角瓶中，28℃，160 r/min振蕩培養(yǎng)18 h。然后每瓶以5%的接種量將種子培養(yǎng)液接種到裝有發(fā)酵培養(yǎng)液的三角瓶中, 28℃，160 r/min振蕩培養(yǎng) 40 h。

1.3.2 分離多糖[10]

取適量發(fā)酵液于8000 r/min、離心15 min，取上清液10 mL，加入3倍體積的95%乙醇在4℃冰箱沉淀過夜。再次離心后將沉淀用蒸餾水定容到10 mL，采用苯酚-硫酸法測(cè)定胞外多糖。

1.3.3 多糖發(fā)酵單因素試驗(yàn)

為提高產(chǎn)糖效率，通過設(shè)計(jì)單因素實(shí)驗(yàn)，恒溫培養(yǎng)40 h，測(cè)定產(chǎn)糖量，選擇營養(yǎng)及發(fā)酵因子中的最佳水平，如表 1 。

表 1 單因素試驗(yàn)的因子與水平Table1 Factors and levels for single factor test

1.3.4 4因素3水平正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)4因素3水平正交試驗(yàn)，確定最優(yōu)的培養(yǎng)基組合，如表2。

表2 正交試驗(yàn)因素與水平Table 2 Factors and levels of orthogonal test

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基成分的確定

2.1.1 最適碳源

土壤細(xì)菌L20309經(jīng)活化培養(yǎng)后，以5%的接種量接入到碳源分別為可溶性淀粉、葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麥芽糖的發(fā)酵培養(yǎng)基中， 28℃，160 r/min振蕩培養(yǎng) 40 h，測(cè)定胞外多糖產(chǎn)量(圖1)。從圖1中可以看出，菌株對(duì)這6種碳源均可以利用，但葡萄糖作為發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源效果最佳，其產(chǎn)糖量達(dá)到了1.440 59 μg/mL，蔗糖次之，果糖和乳糖利用率最低。因此，葡萄糖是產(chǎn)胞外多糖效果最好的碳源。

圖1 碳源對(duì)土壤細(xì)菌L20309多糖產(chǎn)量的影響Fig 1 Effects of carbon sources on soil bacterium L20309 EPS production

2.1.2 最適碳源濃度

碳源只有在較適合濃度時(shí)，才能促進(jìn)菌株的生長(zhǎng)，并產(chǎn)生代謝產(chǎn)物。確定最佳碳源的種類為葡萄糖后，還需考察其最佳質(zhì)量濃度，才能更高效地進(jìn)行發(fā)酵。按照以上同樣的培養(yǎng)條件，將碳源質(zhì)量濃度分別設(shè)置為5、10、15、20、25、30和35 g/L，28℃，160 r/min振蕩培養(yǎng) 40 h，測(cè)定胞外多糖產(chǎn)量(圖2)。由圖2可知，當(dāng)碳源濃度為20 g/L時(shí)，產(chǎn)胞外多糖最高。因此，20 g/L是產(chǎn)胞外多糖效果最好的碳源濃度。

2.1.3 最適氮源

氮源也是細(xì)菌生長(zhǎng)所需要的一種重要物質(zhì)。按照以上的培養(yǎng)條件，發(fā)酵培養(yǎng)基以20 g/L葡萄糖為碳源，分別以蛋白胨、酵母膏、酵母浸粉、牛肉膏、硫酸銨、氯化銨為氮源，28℃，160 r/min振蕩培養(yǎng) 40 h，測(cè)定胞外多糖產(chǎn)量(圖3)。從圖3可見，以蛋白胨作為發(fā)酵培養(yǎng)基的氮源時(shí)，土壤細(xì)菌L20309的產(chǎn)糖量最大，產(chǎn)糖量達(dá)到1.24568 μg/mL。因此，蛋白胨是產(chǎn)胞外多糖效果最好的氮源。

圖2 碳源質(zhì)量濃度對(duì)土壤細(xì)菌L20309多糖產(chǎn)量的影響Fig 2 Effects of sucrose concentrations on soil bacterium L20309 EPS production

圖3 氮源對(duì)土壤細(xì)菌L20309多糖產(chǎn)量的影響Fig 3 Effects of nitrogen sources on soil bacterium L20309 EPS production

2.1.4 最適氮源濃度

氮源濃度也是影響細(xì)菌產(chǎn)胞外多糖的關(guān)鍵因素。按照以上的發(fā)酵培養(yǎng)條件，分別設(shè)置蛋白胨濃度為5、10、15、20、25、30和35 g/L，28℃，160 r/min振蕩培養(yǎng)40 h，測(cè)定胞外多糖產(chǎn)量(圖4)。由圖4可知，產(chǎn)糖效果最好的是30 g/L的蛋白胨濃度。因此，土壤細(xì)菌L20309發(fā)酵培養(yǎng)基的氮源濃度選擇30 g/L最好。

圖4 氮源質(zhì)量濃度對(duì)土壤細(xì)菌L20309多糖產(chǎn)量的影響Fig 4 Effects of nitrogen concentrations on soil bacterium L20309 EPS production

2.2 影響土壤細(xì)菌L20309產(chǎn)胞外多糖效果的培養(yǎng)條件

2.2.1 最適溫度

在碳源、氮源質(zhì)量濃度分別為20和30 g/L的條件下，溫度分別設(shè)為18、23、28、33和38℃，28℃，160 r/min振蕩培養(yǎng) 40 h，測(cè)定胞外多糖產(chǎn)量(圖5)。由圖5可知，當(dāng)溫度為28℃時(shí)產(chǎn)糖量最大，產(chǎn)糖量為1.509 94 μg/mL，溫度高于28℃后細(xì)菌產(chǎn)糖量下降。因此，選擇28℃為最佳發(fā)酵溫度。

圖5 溫度對(duì)土壤細(xì)菌L20309多糖產(chǎn)量的影響Fig 5 The effect of temperature on soil bacterium L20309 EPS production

2.2.2 最適pH值

在其他條件不變，確定發(fā)酵培養(yǎng)基的培養(yǎng)溫度為28℃的條件下，分別以4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0為初始pH值，28℃，160 r/min振蕩培養(yǎng) 40 h，測(cè)定胞外多糖產(chǎn)量(圖6)。從圖6可見，土壤細(xì)菌L20309在6.0～8.0的pH值范圍內(nèi)生長(zhǎng)較好，當(dāng)pH值為7.0時(shí)產(chǎn)糖量最大，產(chǎn)糖量為1.68003 μg/mL。因此，選擇7.0為最佳初始pH值。

2.2.3 選擇最適裝液量

在其他條件不變，確定發(fā)酵培養(yǎng)基的pH 7.0的條件下，設(shè)置裝液量為20、30、40、50、60和70 mL的發(fā)酵培養(yǎng)基(150 mL搖瓶)，28℃，160 r/min振蕩培養(yǎng) 40 h，測(cè)定胞外多糖產(chǎn)量(圖7)。由圖7可以看出，產(chǎn)胞外多糖最好的裝液量為50 mL(150 mL搖瓶)時(shí)。因此，選擇裝液量50 mL(150 mL搖瓶)為最好。

圖6培養(yǎng)基初始pH對(duì)土壤細(xì)菌L20309多糖產(chǎn)量的影響Fig 6 The effect of culture medium initial pH value on soil bacterium L20309 EPS production

2.2.4 選擇最適接種量

以同樣的條件，裝液量為50 mL(150 mL搖瓶)，分別接入 2%、5%、8%、11%和14%的接種量，28℃，160 r/min振蕩培養(yǎng) 40 h，測(cè)定胞外多糖產(chǎn)量，結(jié)果見圖8。由圖8可知，產(chǎn)糖效果最好的接種量是5%。因此，選擇5%為最佳接種量。

圖7 培養(yǎng)基裝量對(duì)土壤細(xì)菌L20309多糖產(chǎn)量的影響Fig 7 Effects of culture medium volumes on soil bacterium L20309 EPS production

圖8 接種量對(duì)土壤細(xì)菌L20309多糖產(chǎn)量的影響Fig 8 The effect of inoculation quantity on soil bacterium L20309 EPS production

2.2.5 培養(yǎng)條件的正交試驗(yàn)

以單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)為基礎(chǔ)，確定土壤細(xì)菌L20309發(fā)酵培養(yǎng)的影響條件，設(shè)計(jì)4個(gè)因素3個(gè)水平，采用 L9(34)進(jìn)行正交試驗(yàn)，結(jié)果如表3。

由表3可以看出，影響土壤細(xì)菌L20309產(chǎn)胞外多糖效果最好的發(fā)酵條件為：A2B2C3D2，即培養(yǎng)基初始pH7.0，培養(yǎng)溫度28℃，接種量5%，培養(yǎng)基裝量50 mL(150 mL搖瓶)。由表3方差分析可以看出， 影響胞外多糖產(chǎn)量效果最好的因素大小順序?yàn)椋築>D>C>A，也就是培養(yǎng)基初始pH值>接種量>培養(yǎng)基裝量>培養(yǎng)溫度。因此，當(dāng)碳源、氮源確定的情況下，初始pH值是影響土壤細(xì)菌L20309產(chǎn)胞外多糖的主要因素。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of orthogonal experiment

2.3 發(fā)酵曲線分析

上述實(shí)驗(yàn)已經(jīng)探究出了該細(xì)菌的最佳培養(yǎng)條件：溫度28℃、pH 7.0、裝液量500 mL/L、接種量5%。以最佳培養(yǎng)條件下每隔12 h測(cè)定發(fā)酵液多糖產(chǎn)量和菌量(D600 nm)，結(jié)果見圖9。

圖9 土壤細(xì)菌L20309生長(zhǎng)和產(chǎn)胞外多糖Fig 9 The growth of soil bacterium L20309 and producing exopolysaccharides

由圖9可知，12～72 h為細(xì)菌的快速生長(zhǎng)期，72 h細(xì)菌生長(zhǎng)量達(dá)到了最大，同時(shí)產(chǎn)糖量也達(dá)到了最大，產(chǎn)糖量為1.732 50 μg/mL，之后細(xì)菌進(jìn)入衰退期，生長(zhǎng)量和產(chǎn)糖量都在逐漸減小。因此，該菌發(fā)酵產(chǎn)糖效果最好的培養(yǎng)時(shí)間是72 h。

3 討論與結(jié)論

研究報(bào)道，微生物的營養(yǎng)成分、培養(yǎng)條件等在一定程度上影響著胞外多糖的結(jié)構(gòu)、生理功能以及胞外多糖產(chǎn)量[11-13]。本研究也表明發(fā)酵培養(yǎng)基利用不同的碳源發(fā)酵，最終影響細(xì)菌的產(chǎn)糖效果，這與劉天華等[14]的研究結(jié)果一致。不僅如此，添加不同的氮源，胞外多糖產(chǎn)量也表現(xiàn)出較大的變化[15]。本研究以蛋白胨、酵母膏、酵母浸粉、牛肉膏，硫酸銨、氯化銨為氮源時(shí)，發(fā)現(xiàn)氮源為蛋白胨時(shí)，土壤細(xì)菌L20309的產(chǎn)糖量最大。因此該菌株產(chǎn)胞外多糖最理想的碳源是葡萄糖，濃度為20 g/L，氮源為蛋白胨，濃度為30 g/L。

本研究在碳源為20 g/L葡萄糖，氮源為30 g/L蛋白胨確定的情況下，設(shè)計(jì)4個(gè)因素3個(gè)水平的正交試驗(yàn)，對(duì)影響產(chǎn)胞外多糖的因素進(jìn)行了評(píng)價(jià)，繼而確定了L20309產(chǎn)胞外多糖最優(yōu)培養(yǎng)條件：溫度28 ℃、pH 7.0、裝液量50 mL(150 mL搖瓶)、接種量5%。從培養(yǎng)條件優(yōu)化的主次因素來看，初始pH值是影響土壤細(xì)菌L20309產(chǎn)胞外多糖的主要因素，初始pH 6.0～8.0的范圍內(nèi)產(chǎn)糖較好，低于或高于這個(gè)范圍產(chǎn)糖效果都會(huì)明顯下降；接種量控制在5%適宜，低于5%影響產(chǎn)糖效果，耗時(shí)耗力，高于5%浪費(fèi)菌種；裝液量不足或過多都會(huì)影響菌體產(chǎn)糖的積累[16]，裝液量為50 mL(150 mL搖瓶)適宜；溫度是影響微生物生長(zhǎng)的因素之一，因此在發(fā)酵過程中要控制好溫度，過高或過低都會(huì)影響微生物的發(fā)酵程度，較適宜的發(fā)酵溫度是23℃～33℃。

利用最優(yōu)培養(yǎng)條件對(duì)土壤細(xì)菌L20309進(jìn)行了搖培發(fā)酵，從細(xì)菌的生長(zhǎng)曲線和產(chǎn)糖結(jié)果來看，在培養(yǎng)12～72 h內(nèi)，細(xì)菌的生長(zhǎng)量和產(chǎn)糖量都在增加，72 h菌量及產(chǎn)糖量達(dá)到最大，72 h之后逐漸衰退，因此發(fā)酵時(shí)間選擇72 h適宜，表明穩(wěn)定期是產(chǎn)糖積累的最佳時(shí)期。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明本研究分離的一株土壤細(xì)菌L20309具有產(chǎn)糖能力，可以為今后的微生物工業(yè)領(lǐng)域提供相關(guān)的實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)。

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The optimizition of exopolysacchrides production by an soil bacterium

SHANG Tian-cui1, WEI Gang2, ZHAO Yu1

(1. School of Biology and Geography Science, Yili Normal University， Yining 835000;2. The Professional Foundation Course, Yining Health School, Yining 835000, China)

The soil bacterium L20309 with production capacity of extracellular polysaccharide was isolated from theprunusdivaricatain Daxigou of Xinjiang and the fermentation conditions were optimized. Results showed that the better carbon and nitrogen sources for it to produce extracellular polysaccharide were glucose and peptone, and the optimal mass concentrations of carbon and nitrogen sources were 20 g/L and 30 g/L, respectively. The optimal growth conditions were pH 8.0 of the medium, the loading sample of 500 mL/L, the inoculum of 5% of 28℃. When cultured under such condition for 72 h, the polysaccharide product could reach to 2.562 μg/mL.

soil bacterium; extracellular polysaccharide; medium composition; fermentation

2016-04-20；

2016-06-02

新疆維吾爾自治區(qū)自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2015211C294)

尚天翠，碩士，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，研究方向?yàn)橹参锱c微生物資源利用,E-mail：shang2000_1@163.com

Q936;TQ920.6

B

2095-1736(2017)01-0103-04

doi∶10.3969/j.issn.2095-1736.2017.01.103