不同釀酒酵母對啤酒釀造過程中反-2-壬烯醛的影響

王艷丹，蔡 勇，呂慧威*

（1.吉林師范大學(xué)博達(dá)學(xué)院，吉林四平136000；2.長春職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品生物技術(shù)分院，吉林長春130033）

不同釀酒酵母對啤酒釀造過程中反-2-壬烯醛的影響

王艷丹1，蔡 勇2，呂慧威1*

（1.吉林師范大學(xué)博達(dá)學(xué)院，吉林四平136000；2.長春職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品生物技術(shù)分院，吉林長春130033）

從不同生產(chǎn)用酵母菌泥中分離篩選出3株工業(yè)釀酒酵母，編號分別為A、B、C、D。以釀酒酵母C為對照，利用頂空固相微萃取結(jié)合氣質(zhì)聯(lián)用（HS-SPME-GC/MS）法，研究不同酵母在啤酒釀造過程中反-2-壬烯醛（T2N）含量的變化。結(jié)果表明，不同發(fā)酵液中T2N含量差異顯著（P＜0.05），A、B、C、D酵母菌發(fā)酵液中T2N含量分別為13.63 μg/L、9.12 μg/L、10.93 μg/L、7.63 μg/L。4株菌的成品酒中T2N含量均較發(fā)酵液高，監(jiān)測D菌啤酒釀造過程中T2N含量變化結(jié)果顯示：冷麥汁中T2N含量最高為25.93 μg/L，發(fā)酵過程中T2N含量相對最低為6.96 μg/L，冷貯和成品階段T2N含量有所增加，分別達(dá)到9.27 μg/L和11.36 μg/L，但與冷麥汁相比低很多。

釀酒酵母；頂空固相微萃??；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法；啤酒釀造；反-2-壬烯醛

啤酒在生產(chǎn)、貯存和運輸過程中，由于環(huán)境因素影響，風(fēng)味會逐漸發(fā)生變化，產(chǎn)生令人不愉快的異雜味，俗稱“老化味”，使啤酒的飲用性大大降低，同時也縮短了啤酒的貨架期。目前，普遍認(rèn)為引起啤酒風(fēng)味變化的主要物質(zhì)是羰基化合物[1-2]，其中反-2-壬烯醛（trans-2-nonenal，T2N）是典型代表，它是由于麥芽脂質(zhì)降解而形成的一種具有紙板味的老化物質(zhì)[3-4]，可作為原料新鮮度的指示劑。由于啤酒老化過程的復(fù)雜性[5]，解決啤酒生產(chǎn)和貯藏過程中的老化問題，一直是一個嚴(yán)峻的課題。

啤酒是麥汁經(jīng)釀酒酵母發(fā)酵而成的，其風(fēng)味主要由酵母在麥汁中代謝產(chǎn)生的總體代謝產(chǎn)物決定。有研究表明，釀酒酵母發(fā)酵過程中會產(chǎn)生具有抗老化能力的還原性物質(zhì)，如亞硫酸鹽、還原酮和還原型谷胱甘肽等[6]，這類物質(zhì)可以和許多氧自由基發(fā)生反應(yīng)，對維持胞內(nèi)氧化還原環(huán)境具有一定作用，能夠顯著延長啤酒的風(fēng)味保鮮期。以往對啤酒老化程度的研究主要集中于老化物質(zhì)檢測方法的開發(fā)和對成品啤酒貯存過程的研究[7-8]，對釀造過程老化物質(zhì)變化的研究報道較少，尹花等[9]跟蹤了啤酒發(fā)酵過程中多種老化指示物質(zhì)的變化情況，但沒有考慮不同釀酒酵母間的差異。因此，要從根本上解決啤酒老化問題，還需要從酵母菌種本身的選擇出發(fā)，選擇抗氧化能力較強的啤酒酵母工業(yè)菌株。

本研究以T2N含量為評價指標(biāo)，采用頂空固相微萃?。╤eadspace solid-phase microextraction，HPLC）氣質(zhì)聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）法檢測不同酵母釀造啤酒中冷麥汁、發(fā)酵液及成品酒中T2N的含量，探索四株不同工業(yè)釀酒酵母對啤酒釀造過程中麥汁老化程度的影響。此外，通過監(jiān)測啤酒廠釀造過程中T2N含量的變化，可以及時調(diào)整原料的使用情況以及控制原料的貯存條件，并且可實現(xiàn)生產(chǎn)工藝的過程控制，從而定向進(jìn)行啤酒新鮮度的改善，持續(xù)提高產(chǎn)品的競爭力。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

釀酒酵母C：本實驗室保藏；酵母A、B、D：從不同啤酒廠的酵母菌泥中篩選分離得到；生產(chǎn)用酵母菌泥：來自不同啤酒廠；麥芽汁：四平市某啤酒廠。

1.1.2 主要試劑

反-2-壬烯醛標(biāo)準(zhǔn)品（色譜純）：美國Sigma公司；瓊脂、無水乙醇（色譜純）、NaCl、葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、可溶性淀粉、麥芽糖、甘油、鼠李糖、（NH4）2SO4、NH4NO3、尿素（均為分析純）：天津市濱?？频匣瘜W(xué)試劑有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

麥芽汁培養(yǎng)基：11°P麥芽汁，121℃濕熱滅菌18 min，固體培養(yǎng)基加0.15%瓊脂，pH值約5.8。

碳源同化測試培養(yǎng)基：（NH4）2SO45.0g/L，KH2PO41.0g/L，NaCl 0.1 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，CaCl20.1 g/L，酵母膏0.2 g/L，瓊脂15.0 g/L，pH值6.5，121℃滅菌18 min。加待測碳源（葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、可溶性淀粉、麥芽糖、甘油、鼠李糖溶液）2%。調(diào)節(jié)pH值為6.0。

氮源同化測試培養(yǎng)基：葡萄糖20.0g/L，K2HPO41.0g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，瓊脂15.0 g/L，121℃滅菌20 min。加待測氮源（（NH4）2SO4、NH4NO3、尿素溶液）0.5%。調(diào)節(jié)pH值為6.0。

發(fā)酵糖測試培養(yǎng)基：蛋白胨5.0 g/L、NaCl 5.0 g/L，1.6%溴甲酚紫乙醇溶液2.0 mL/L，分裝于試管，放入Durham小管，121℃滅菌20 min。含量為20%的葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、半乳糖溶液112℃滅菌30 min。滅菌后，每管中加入20%無菌糖液0.5 mL。調(diào)節(jié)pH值為6.0。

1.2 儀器與設(shè)備

303-0S恒溫培養(yǎng)箱：深圳市鼎鑫宜實驗設(shè)備有限公司；LIOO JS-500雙目生物顯微鏡：上海光學(xué)儀器廠；HS-1300潔凈工作臺：成都一科儀器設(shè)備有限公司；75 μm CAR-PDMS萃取頭的SPME裝置：德國SIGMA-Aldrich公司；Clarus600 GC/MS氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國PE公司；UGC-12MF氮吹儀：北京優(yōu)晟聯(lián)合科技有限公司；FE20型pH計：瑞士Mettler Toledo集團公司；UV-1800型紫外可見分光光度計：日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株的篩選

對不同啤酒廠獲得的發(fā)酵狀況較好酵母菌泥進(jìn)行菌株初篩，初篩前先進(jìn)行活化復(fù)壯，至供試培養(yǎng)液菌體密度為1×108個/mL，將處理后的酵母液稀釋至10-6，吸取10-6稀釋度的酵母稀釋液0.5 mL注入麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基中，涂勻均勻，于28℃培養(yǎng)72～96 h，監(jiān)測菌落生長情況[10]。

觀察固體培養(yǎng)基上形成菌落的形態(tài)，根據(jù)大小、顏色、邊緣等特征進(jìn)行初篩[10]，結(jié)合細(xì)胞顯微形態(tài)篩選出3株菌，分別接種于麥芽汁斜面培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)48～72 h備用。

1.3.2 生理生化實驗

（1）碳源同化測試[11]：取斜面培養(yǎng)基活化的新鮮菌體一環(huán)，懸浮于1 mL無菌水中，取0.5 mL滴到碳源同化管中。28℃靜置培養(yǎng)2周，每天觀察并記錄結(jié)果。取一張白紙，畫一條寬度為3/4 mm的黑線，搖動同化管，使菌體充分懸浮，將白紙貼近同化，透過菌懸浮液觀察黑線，若黑線清晰可見，表明此菌不能同化該碳源，結(jié)果記錄為“－”，如果黑線模糊或者完全看不見，表明可以同化該碳源記錄為“+”。

（2）氮源同化測試：方法用碳源同化，以被測試的氮源代替碳源。

（3）發(fā)酵糖測試：菌懸液制備、接種及培養(yǎng)方式同碳源同化測試，28℃培養(yǎng)48 h，觀察各試管內(nèi)顏色變化(溴甲酚紫)及Durham小管內(nèi)有無氣泡產(chǎn)生。視氣體有無記錄實驗結(jié)果，無氣體產(chǎn)生表明不發(fā)酵該碳源，記錄為“－”，有氣體產(chǎn)生的管表明可以發(fā)酵該碳源，記錄為“+”。

以上每個測試均做3個平行管。

1.3.3 發(fā)酵方法

在1 000 mL三角瓶中進(jìn)行啤酒主發(fā)酵小型試驗。具體方法如下：將麥汁加水，使糖度達(dá)到10°Bx，0.05 MPa滅菌20 min。冷卻后搖動充氧，沉淀。將50 mL酵母菌種接入，使最終細(xì)胞濃度為1×106CFU/mL。在10℃生化培養(yǎng)箱中發(fā)酵，每天觀察發(fā)酵情況。發(fā)酵7 d左右糖度至4.0°Bx時結(jié)束（嫩啤酒），此階段為主發(fā)酵。

1.3.4 T2N含量測定樣品前處理方法

用移液槍準(zhǔn)確移取5 mL麥芽汁和待測樣品于22 mL頂空瓶中，加入足量NaCl使其處于飽和狀態(tài)，并用高純度氮氣將瓶中的空氣吹走，然后迅速壓蓋密封，置于沸水浴中煮沸120min，再于50℃恒溫水浴中用75μmCAR/PDMS萃取頭萃取90 min，待檢測[12-14]。

1.3.5 儀器分析條件

GC條件：色譜柱：HP-5MS毛細(xì)管色譜柱（60m×0.32mm ×0.25 μm）；載氣：氦氣（純度≥99.99%）；流速：1 mL/min；升溫程序：柱溫箱初始溫度為60℃，以3℃/min的速度升至100℃，再以10℃/min升至250℃，維持7 min，最后以10℃/min升至290℃，維持5 min；進(jìn)樣口溫度：280℃；分流方式：無分流進(jìn)樣。

MS條件：電離方式采用電子電離（electron ionization，EI）源，設(shè)置電離電壓70 eV，離子源溫度250℃，傳輸線溫度250℃；測定模式選擇離子監(jiān)測（selected ion monitoring，SIR），溶劑延遲3 min，全掃描質(zhì)核比范圍29～300m/z[13]。

1.3.6 T2N檢測方法

采用SPME-GC/MS方法測定樣品中的T2N含量。用保留時間和離子碎片比例定性，用外標(biāo)法定量，用峰面積計算標(biāo)準(zhǔn)工作液和待測樣液中的T2N含量值均應(yīng)在儀器檢測的線性范圍內(nèi)，其質(zhì)量濃度與響應(yīng)值有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R為0.991～0.998范圍內(nèi)。

1.3.7 統(tǒng)計分析

上述實驗均做3個平行，并用SPSS 20.0分析軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的篩選及形態(tài)觀察

觀察四株菌在固體培養(yǎng)基上菌落的形態(tài)特征，結(jié)果見表1。并分別進(jìn)行生理化實驗，結(jié)果見表2。

表1 篩選菌株的形態(tài)特征Table 1 Morphological characteristics of selected strains

表2 篩選菌株的生理生化特性Table 2 Physiological and biochemical characteristics of selected strains

由表1可知，來自不同啤酒廠的菌泥中分離篩選出三株菌A、B、D與釀酒酵母C形態(tài)相似，可作為啤酒發(fā)酵實驗菌株。由表2可知，在碳源同化測試中，供試菌株均能迅速利用葡萄糖、果糖和蔗糖；均不能利用乳糖和可溶性淀粉，且同化半乳糖、麥芽糖、甘油和鼠李糖的能力存在明顯差異。發(fā)酵糖測試結(jié)果表明：所有菌株均能快速發(fā)酵葡萄糖、果糖和蔗糖，Durham小管內(nèi)充有氣體；而在半乳糖和乳糖的發(fā)酵能力上存在差異。氮源同化結(jié)果表明：四株菌均能很好的利用（NH4）2SO4，在尿素和NH4NO3的利用上存在差異。

2.2 不同的酵母發(fā)酵液中T2N含量測定

2.2.1 T2N標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

本實驗所用麥汁經(jīng)高溫煮沸后的反-2-壬烯醛（T2N）含量可達(dá)25μg/L，在麥汁中添加T2N標(biāo)準(zhǔn)品0、5μg/L、10μg/L、15 μg/L、20 μg/L、25 μg/L，對樣品進(jìn)行前處理，并用氣質(zhì)聯(lián)用儀（GC-MS）檢測其峰面積，結(jié)果扣除空白，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見圖1。由圖1可知，分別以各自的峰面積（y）對T2N標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度（x）進(jìn)行回歸計算，得到回歸方程：y=7 228.2x+3 069，R2=0.998 4，此方法檢出限為0.5 μg/L，該標(biāo)準(zhǔn)曲線可以用作結(jié)果的定量分析。

圖1 T2N標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of T2N

2.2.2 發(fā)酵液中T2N含量的測定

監(jiān)測四株酵母滿罐期（0 d）、發(fā)酵2 d、4 d、6 d及主發(fā)酵結(jié)束（8 d）過程中T2N含量的變化，結(jié)果見圖2。主發(fā)酵結(jié)束時T2N含量測定結(jié)果方差分析結(jié)果見表3。

圖2 4株酵母菌從滿罐到主發(fā)酵結(jié)束T2N含量變化趨勢Fig.2 Changes trend of T2N contents from the full tank to the end of the main fermentation by four different yeast strains

由圖2可知，此過程中四株酵母發(fā)酵液中T2N含量均呈下降趨勢，主發(fā)酵結(jié)束時酵母D發(fā)酵液中T2N含量最低為7.63 μg/L，酵母A發(fā)酵液中T2N含量最高達(dá)13.63 μg/L，且與冷麥芽汁的25.51 μg/L相比，發(fā)酵液中T2N含量均下降，其原因可能是反-2-壬烯醛屬于羰基化合物，而酵母對羰基化合物有較強的還原能力，發(fā)酵過程中，酵母能將醛類還原為醇類物質(zhì)，醇類作為中間產(chǎn)物參與到酵母的代謝途徑中，使得發(fā)酵液中的T2N含量較麥芽汁中降低。由此可知，四株釀酒酵母中，D菌在發(fā)酵過程中對醛類物質(zhì)的還原能力最強，其次是B菌和C菌，A菌還原能力最弱。酵母的種類直接影響了發(fā)酵液中的老化物質(zhì)的含量，選擇合適的釀酒酵母對啤酒老化物質(zhì)T2N含量的控制至關(guān)重要。

表3 主發(fā)酵結(jié)束時T2N含量測定結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis of determination results of T2N contents at the end of the main fermentation

由表3方差分析可知，不同的酵母在主發(fā)酵結(jié)束時測定的T2N含量差異顯著（P＜0.05）。

2.2.3 成品酒中T2N含量的測定

將上述四種主發(fā)酵液經(jīng)后熟、冷貯制成成品酒，測定四株菌對應(yīng)的成品酒中T2N含量，結(jié)果見圖3。由圖3可知，四株菌成品酒中T2N含量均較發(fā)酵液有所上升，其中A菌成品酒中T2N含量最高，為18.30 μg/L，B菌成品酒含14.05 μg/L的T2N，C菌成品酒中含T2N為15.21 μg/L，D菌成品酒中T2N含量最低，為11.19 μg/L，四株菌成品酒中T2N含量差異顯著（P＜0.05）。由此可見，與釀酒酵母C菌相比，B和D兩株菌經(jīng)發(fā)酵得到的成品酒中T2N含量均有所降低，D菌降低的幅度更大，更適宜作啤酒釀造菌株。

圖3 4株酵母菌發(fā)酵液及成品酒中T2N含量差異Fig.3 Difference of T2N contents in fermentation broth and beer of four yeast strains

2.2.4 啤酒發(fā)酵過程中T2N含量的變化趨勢

為探究啤酒釀造過程中T2N含量的變化趨勢，以D酵母菌為研究對象，跟蹤啤酒廠釀造過程，分析冷麥汁、滿罐、主酵、后熟、冷貯、成品酒六個階段T2N的含量變化[9,15-16]，結(jié)果見圖4。由圖4可知，麥汁中添加酵母菌D后，在達(dá)到滿罐時T2N含量由25.93 μg/L大幅下降至7.25 μg/L，其原因是在啤酒發(fā)酵初期，酵母具有較強的還原能力，將T2N還原成對應(yīng)的醇類，并參與到相應(yīng)的生化循環(huán)中[17]。相對于麥汁，在后續(xù)的整個發(fā)酵過程中，T2N含量均維持在較低的水平，主酵過程與滿罐時T2N含量幾乎相同，而在后期的后熟、冷貯階段，T2N含量略有增加，在冷貯至成品階段T2N有較明顯的上升趨勢，出現(xiàn)此現(xiàn)象可能是由于酵母菌具有一定的還原能力，當(dāng)達(dá)到一定限度時，過量的T2N不再被還原成醇類物質(zhì)。此外，在成品的包裝、殺菌等高溫環(huán)境操作過程中，使發(fā)酵液中脂氧合酶（lipoxygenase，LOX）酶活性升高，脂質(zhì)降解造成T2N物質(zhì)含量上升。因此，在啤酒的后期貯存應(yīng)盡量控制在較低溫度中進(jìn)行。

圖4 麥汁和發(fā)酵過程中T2N含量的變化趨勢Fig.4 Variation of T2N contents in wort and fermentation broth during fermentation process

3 結(jié)論

與麥芽汁相比，四株酵母菌的發(fā)酵液中T2N含量均有所下降，且不同發(fā)酵液中T2N含量差異顯著（P＜0.05），其中酵母D發(fā)酵液中檢測到的T2N含量最低，為7.63 μg/L。結(jié)果表明，D酵母菌對醛類物質(zhì)的還原能力最強，酵母的種類直接影響了發(fā)酵液中T2N的含量，為從菌種選擇方面提高啤酒品質(zhì)奠定基礎(chǔ)。

四株酵母菌的成品酒中T2N含量均較發(fā)酵液中高。對D酵母菌的發(fā)酵過程進(jìn)行監(jiān)測，可知T2N含量變化趨勢：冷麥芽汁中最高，為25.93 μg/L，滿罐時達(dá)到最低，為7.25 μg/L，隨著發(fā)酵進(jìn)行，在主酵、后熟階段T2N含量略有上升，后期冷貯和成品階段T2N含量仍有所增加，最終成品酒中含量為11.36 μg/L。掌握T2N含量在啤酒釀造過程中的變化趨勢，有助于在不同階段采取措施控制老化物質(zhì)的含量。

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Effect of differentSaccharomyces cerevisiaeon trans-2-nonenal in beer brewing process

WANG Yandan1,CAI Yong2,LV Huiwei1*(1.BODA College,Jilin Normal University,Siping 136000,China;2.School of Food and Biological Technology,Changchun Vocational Institute of Technology,Changchun 130033,China)

Three strains of industrialSaccharomyces cerevisiaewere isolated and screened from different yeast mud used for production,and numbered A,B,C,D.UsingS.cerevisiaeC as the control,the changes of trans-2-nonenal(T2N)contents in beer fermented by different yeasts during brewing process were researched by headspace solid-phase microextraction(HS-SPME)combined with gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS).The results showed that the difference of T2N content in different fermentation broth was significant(P＜0.05).The T2N contents in the yeast A,B,C,D fermentation broth were 13.63 μg/L,9.12 μg/L,10.93 μg/L and 7.63 μg/L,respectively.T2N contents in the beer fermented by four yeast strains were higher than that in the fermented broth.The T2N contents changes in the yeast D beer brewing process showed that T2N content in cold wort was the highest of 25.93 μg/L,and was relatively lowest of 6.96 μg/L in the fermentation process,then the T2N contents increased in the cold storage and the finished product stage,up to 9.27 μg/L and 11.36 μg/L,respectively,but much lower than that of the cold wort.

Saccharomyces cerevisiae;HS-SPME;GC-MS;beer brewing;trans-2-nonenal

TS262.5

0254-5071（2017）01-0088-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.01.018

2016-11-10

吉林省教育廳“十二五”科學(xué)技術(shù)研究項目（2015585）

王艷丹（1988-），女，助教，碩士，研究方向微生物發(fā)酵與代謝調(diào)控。

*通訊作者：呂慧威（1982-），女，工程師，碩士，研究方向為微生物代謝控制發(fā)酵及啤酒釀造工藝。