結(jié)核性胸膜炎模型大鼠胸腔積液MMP-1和TIMP-1表達

陳 剛 徐旭東 葉 波 喻國燦

結(jié)核性胸膜炎模型大鼠胸腔積液MMP-1和TIMP-1表達

陳 剛 徐旭東 葉 波 喻國燦

目的 探討基質(zhì)金屬蛋白酶1（MMP-1）及其組織抑制物1（TIMP-1）在結(jié)核性胸膜炎胸腔積液不同階段的作用。方法Wistar雄性大鼠60只，將人型結(jié)核菌株H37Rv注入50只實驗組大鼠右側(cè)胸腔內(nèi)，另10只對照組大鼠同側(cè)胸腔注入純化蛋白衍生物（PPD）原液，注入后第1、3、7、15、30天分批處死大鼠，解剖胸腔，記錄胸腔積液量，觀察兩組大鼠胸腔、胸膜和肺組織大體及鏡下病理變化，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）法測定兩組大鼠胸腔積液中MMP-1和TIMP-1濃度。結(jié)果對照組大鼠在注入第1天時胸腔積液量為1.3mL，不能進行MMP-1和TIMP-1有效常規(guī)檢測，第3天后完全吸收。實驗組大鼠15天內(nèi)均有右側(cè)胸腔積液，第1、3、7、15天胸腔積液量分別為（4.9±0.5）mL、（6.3±0.4）mL、（7.2±0.6）mL、（2.5±0.3）mL，第7天最多；胸腔積液中MMP-1和TIMP-1濃度分別為（9.54±0.97）ng/mL和（27.06±2.61）ng/mL、（15.62±1.30）ng/mL和（35.68±2.70）ng/mL、（29.78±1.97）ng/mL和（40.07±3.61）ng/mL、（35.12±2.13）ng/mL和（42.15±3.08）ng/mL，均呈逐漸升高趨勢。結(jié)論結(jié)核性胸膜炎早期局部免疫反應(yīng)以持續(xù)增強為主，MMP-1、TIMP-1在此過程中發(fā)揮作用。

大鼠；結(jié)核性胸膜炎；基質(zhì)金屬蛋白酶1；基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制物1

結(jié)核性胸膜炎是胸膜對結(jié)核桿菌及其代謝產(chǎn)物高度變態(tài)反應(yīng)時產(chǎn)生的胸膜炎癥，基質(zhì)金屬蛋白酶及其組織抑制物在結(jié)核桿菌感染后的細胞招募、組織重塑和破壞中發(fā)揮重要作用[1]，本研究通過檢測結(jié)核性胸膜炎大鼠胸腔積液中基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP-1）及其組織抑制物（TIMP-1）濃度變化，探討其在結(jié)核性胸膜炎早期胸腔積液形成以及胸膜組織修復(fù)與重塑等不同階段中的作用。

1 實驗材料

1.1 動物及藥品 Wistar雄性大鼠60只，體質(zhì)量250～300g，由浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心提供，清潔二級，動物合格證號：SCXK（浙）2008-0033。飼養(yǎng)觀察5天后在大鼠右側(cè)腹股溝內(nèi)側(cè)備皮、消毒，卡介苗（BCG）懸液0.1mL（0.06mg）皮內(nèi)注射。BCG為成都生物制品研究所有限公司生產(chǎn)，批號201209a055。

1.2 結(jié)核分支桿菌菌株制備 用我院結(jié)核中心實驗室傳代的標(biāo)準(zhǔn)人型結(jié)核菌株H37Rv在羅氏培養(yǎng)基上培養(yǎng)3周，刮取菌落，稱重，研磨勻漿后用生理鹽水稀釋制成每毫升含菌量0.03mg的懸液備用。

2 實驗方法

2.1 模型制備 60只大鼠分為實驗組50只，對照組10只，均于BCG接種5周后行胸腔穿刺術(shù)：先胸部備皮，用地西泮注射液0.3mL/只肌肉注射，5min后以5號針頭從右側(cè)肋弓角頂點緊貼劍突側(cè)緣進針約0.5cm后行胸腔穿刺；實驗組50只大鼠胸腔分別注入結(jié)核分支桿菌懸液1mL，對照組10只大鼠胸腔分別注入純化蛋白衍生物（PPD）原液1mL，以第2天順利抽出胸腔積液為模型建立成功；實驗組大鼠分別于胸腔注射后第1、3、7、15、30天分批處死各10只，行胸腔大體及病理學(xué)觀察，同時每只大鼠分別取胸腔積液2mL/只備檢。對照組大鼠分別于胸腔注射后第1、3、7、15、30天分批處死各2只，行胸腔大體及病理學(xué)觀察。

2.2 標(biāo)本采集 每只大鼠肌肉注射地西泮溶液0.4mL，從劍突處沿胸骨剪開皮膚和胸骨，暴露縱膈和胸腔，觀察胸腔積液在胸內(nèi)的分布，收集、記錄胸腔積液量，觀察胸腔內(nèi)胸膜粘連程度，分別取壁、臟層胸膜和肺組織標(biāo)本，并固定于10%中性甲醛溶液中。

2.3 檢測指標(biāo)及方法

2.3.1 胸腔積液檢測 采用ELISA法測定各組大鼠胸腔積液中MMP-1、TIMP-1的濃度。MMP-1、TIMP-1酶聯(lián)免疫檢測試劑盒為武漢云克隆科技股份有效公司產(chǎn)品，規(guī)格：96T，批號20110920。

2.3.2 組織學(xué)觀察 采用常規(guī)石蠟包埋、蘇木精-伊紅（HE）及抗酸染色方法，鏡下觀察組織病理改變。

2.4 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS23.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，計量資料組間比較采用獨立樣本t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 實驗結(jié)果

3.1 兩組大鼠胸腔大體觀察及胸膜病理檢查 全部大鼠經(jīng)實驗處理后在觀察期內(nèi)無一只死亡。實驗組：第1天：胸腔內(nèi)大量淡黃色胸腔積液，病理檢查可見胸膜下和肺間質(zhì)血管明顯擴張，充血，臟層胸膜下有大量中性粒細胞浸潤；第3天：胸腔積液內(nèi)可見纖維蛋白凝塊，病理檢查見臟層胸膜下浸潤的淋巴細胞數(shù)量增多，可見少量的上皮樣細胞及灶性壞死灶，抗酸染色見大量抗酸桿菌；第7天：胸腔內(nèi)見粘連帶形成，質(zhì)脆易剝，胸膜可見散在糜爛灶，病理檢查見臟、壁層胸膜下及肺間質(zhì)以淋巴細胞浸潤為主，可見明顯的上皮樣細胞團及凝固性壞死；第15天：胸腔積液明顯減少，胸膜增厚，可見粟粒大小黃色結(jié)節(jié)，病理檢查見胸膜炎癥減退，臟、壁層胸膜見大量的上皮樣細胞團和大片干酪樣壞死組織；第30天：胸腔廣泛粘連，胸膜增厚不易剝離，病理檢查見胸膜明顯增厚，炎癥細胞減少，可見大量上皮細胞團及干酪樣壞死，肺間質(zhì)纖維組織增生。對照組大鼠胸腔及胸膜病檢無明顯異常。見圖1（封四）。

3.2 兩組大鼠胸腔積液MMP-1、TIMP-1檢測 實驗組大鼠胸腔內(nèi)注入結(jié)核分支桿菌懸液后第1、3、7、15天胸腔積液量分別為（4.9±0.5）mL、（6.3±0.4）mL、（7.2±0.6）mL、（2.5±0.3）mL；顯示第1天即出現(xiàn)胸腔積液。此后胸腔積液量逐日增多，第7天達到高峰，此后下降，30天時無胸腔積液，胸腔積液中MMP-1和TIMP-1的濃度呈持續(xù)升高趨勢，見表1。對照組，第1天時胸腔積液量為1.3mL，因量少無法行MMP-1、TIMP-1濃度檢測，第3天時胸腔積液完全吸收。

4 討論

胸膜中炎性細胞的浸潤、增生、壞死，以及胸腔積液中纖維蛋白凝塊和粘連帶的形成和轉(zhuǎn)歸是結(jié)核性胸膜炎發(fā)展過程中的重要環(huán)節(jié)。基質(zhì)金屬蛋白酶及其組織抑制物在結(jié)核性胸膜炎發(fā)展中起著重要作用[2]，國內(nèi)有研究者發(fā)現(xiàn)，結(jié)核性胸膜炎患者胸水中MMP-1、TIMP-1濃度明顯高于惡性胸腔積液組，并存在一定鑒別診斷價值[3]。

MMP-1存在于類上皮組織細胞、朗罕氏巨細胞、淋巴細胞、巨噬細胞以及肉芽腫性反應(yīng)的成纖維細胞中，在結(jié)核分支桿菌感染后的巨噬細胞聚集、肉芽腫形成、基質(zhì)膠原破壞以及肺與胸膜的纖維化中發(fā)揮重要作用[4-6]。研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)核桿菌感染早期MMP-1出現(xiàn)上調(diào)，后期轉(zhuǎn)而出現(xiàn)下調(diào)，肉芽腫反應(yīng)的程序發(fā)生逆轉(zhuǎn)，由初始組織的破壞性炎癥反應(yīng)轉(zhuǎn)變?yōu)榭寡追磻?yīng)，從而通過纖維化和愈合來減少組織破壞[7]，在抗結(jié)核治療后痰液中的MMP-1濃度也明顯降低[8]。本研究顯示，結(jié)核性胸膜炎發(fā)展過程中大鼠胸腔積液中MMP-1濃度呈持續(xù)升高狀態(tài)，提示大鼠胸腔結(jié)核桿菌感染早期即出現(xiàn)明顯白細胞聚集等炎癥反應(yīng)，隨后MMP-1濃度的持續(xù)升高可能與胸腔白細胞繼續(xù)增多、結(jié)核桿菌增殖、肉芽腫形成、干酪樣壞死等相關(guān)，第15天時MMP-1濃度仍持續(xù)升高，可能與期間胸膜肉芽腫形成、干酪樣壞死繼續(xù)加重以及胸腔積液中纖維條索形成增多相關(guān)。

表1 結(jié)核性胸膜炎模型大鼠胸腔積液MMP-1、TIMP-1濃度及MMP-1/TIMP-1比值（ng/mL，±s）

表1 結(jié)核性胸膜炎模型大鼠胸腔積液MMP-1、TIMP-1濃度及MMP-1/TIMP-1比值（ng/mL，±s）

注：與前一時間點比較，*P＜0.05；MMP-1：基質(zhì)金屬蛋白酶-1；TIMP-1：基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制物-1

檢測指標(biāo)MMP-1 TIMP-1 MMP-1/TIMP-1只數(shù)10 10 10第1天9.54±0.97 27.06±2.61 0.35±0.009第3天15.62±1.30* 35.68±2.70* 0.44±0.018*第7天29.78±1.97* 40.07±3.61* 0.75±0.021*第15天35.12±2.13* 42.15±3.08 0.83±0.011*

TIMP是多種MMP的天然特異性抑制因子，與激活的膠原酶、明膠酶等結(jié)合成復(fù)合體，從而發(fā)揮抑制作用，在正常生理狀態(tài)下，MMPs與TIMPs維持相對動態(tài)平衡狀態(tài)；本研究中實驗組大鼠胸水MMP-1/ TIMP-1比值亦呈逐漸升高趨勢，提示大鼠胸腔局部存在MMP-1/TIMP-1動態(tài)平衡破壞，與MMP-1相關(guān)的免疫反應(yīng)呈總體增強趨勢，在結(jié)核性胸膜炎胸膜腔局部炎癥反應(yīng)、組織破壞與修復(fù)中發(fā)揮著重要作用。此外，還有研究發(fā)現(xiàn)胸腔積液中TIMP-1水平升高與結(jié)核性胸膜炎殘留胸膜增厚相關(guān)[9]；參照結(jié)核性胸膜炎不同時期胸腔大體及病理學(xué)觀察，我們發(fā)現(xiàn)，與胸水中MMP-1濃度逐漸升高相伴隨的是臟壁層胸膜增厚、干酪樣壞死以及胸水中纖維條索分隔、粘連的不斷加重，因此胸水中MMP-1水平或可成為結(jié)核性胸膜炎病情嚴重程度的間接參考指標(biāo)；同時，以MMP-1活性和信號通路為目標(biāo)的免疫治療，或可延緩病情進展，成為結(jié)核性胸膜炎標(biāo)準(zhǔn)抗結(jié)核治療外的一種輔助治療。

［1］Elkington PT，D'Armiento JM，F(xiàn)riedland JS，et al.Tuberculosis immunopathology：the neglected role of extracellular matrix destruction［J］.Sci Transl Med，2011，3（71）：71-76.

［2］Sundararajan S，Babu S，Das SD，et al.Comparison of localized versus systemic levels of Matrix metalloproteinases（MMPs），its tissue inhibitors（TIMPs）and cytokines in tuberculous and non-tuberculous pleuritis patients［J］.Hum Immunol，2012，73（10）：985-991.

［3］俞彤，魯沈源，施勁東，等.金屬基質(zhì)蛋白酶1及其組織抑制物1在結(jié)核性和腫瘤性胸腔積液鑒別診斷中的價值［J］.中國臨床醫(yī)學(xué)，2010，17（5）：645-647.

［4］Chen WL，Sheu JR，Chen RJ et al.Mycobacterium tuberculosis Upregulates TNF-α Expression via TLR2/ERK Signaling and Induces MMP-1 and MMP-9 Production in Human Pleural Mesothelial Cells［J］.PLoS One，2015，10（9）：e 0137979.

［5］Wang CH，Lin HC，Lin SM，et al.MMP-1（-1607G）polymorphism as a risk factor for fibrosis after pulmonary tuberculosis in Taiwan［J］.Int J Tuberc Lung Dis，2010，14（5）：627-634.

［6］Hoheisel G1，Sack U，Hui DS，et al.Immunohistochemical localization of matrix metalloproteinases（MMP）and tissue inhibitors of metalloproteinases（TIMP）in tuberculous pleuritis［J］.Pneumologie，2004，58（5）：305-308.

［7］Mehra S，Pahar B，Dutta NK，et al.Transcriptional reprogramming in nonhuman primate（rhesus macaque）tuberculosis granulomas［J］.PLoS ONE，2010，5（8）：e12266.

［8］Ugarte-Gil CA，Elkington P，Gilman RH，et al.Induced sputum MMP-1，-3&-8 concentrations during treatment of tuberculosis［J］.PLoS ONE，2013，8（4）：e61333.

［9］Ki-Eun Hwang，Young-Jun Shon，Byong-Ki Cha，et al.Tissue Inhibitor of Metalloproteinase-1 Is Responsible for Residual Pleural Thickening in Pleural Tuberculosis［J］.To-hoku J.Exp.Med，2015，235（4）：327-333.

（收稿：2016-04-09 修回：2016-08-10）

Expression of MMP-1 and TIMP-1 in Pleural Effussion in Tuberculous Pleurisy Rats

CHEN Gang,XU Xudong,YE Bo,YU Guocan. Department of Tuberculosis Surgery,Zhejiang Provincial Tuberculosis Treatment Center,Zhejiang TCM and Western Medicine Integrated Hospital,Hangzhou(310003),China

Objective To investigate the effects of matrix metalloproteinase-1（MMP-1）and tissue inhibitors of met alloproteinase（TIMP-1）in the process of development of tuberculous pleurisy in rats.MethodsFifty male Wistar rats that were injected into the right pleural cavity with H37Rv of mycobacterium tuberculosis,were set as the experimental group.Another 10 rats that were injected with 1 mL purified protein derivative（PPD）solution,served as control group.The rats were were killed in batches on Day 1,Day 3,Day 7,Day 15 and Day 30 after injection,then the chest were dissected to record the amount of pleural effusion and to observe the morphological and pathological changes of pleural and lung.MMP-1 and TIMP-1 concentrations in pleural effusion of each rat were measured by enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）method.ResultsThe amount of pleural effusion in control group was 1.3 mL on Day 1 after injection of PPD solution,which made control rats not eligible for routine;pleural effusion completely absorbed on Day 3.The rats of experimental group had pleural effusion in the right pleural cavity within the first 15 days and the amount of pleural effusion on Day 1,Day 3,Day 7 and Day 15 were as follows:4.9±0.5mL, 6.3±0.4mL,7.2±0.6mL,2.5±0.3mL,the maximum amount was on Day 7;the concentrations of MMP-1 and TIMP-1 in pleural effusion were as follows:9.54±0.97ng/mL and 27.06±2.61ng/mL,15.62±1.30ng/mL and 35.68±2.70ng/mL,29.78± 1.97ng/mL and 40.07±3.61ng/mL,35.12±2.13ng/mL and 42.15±3.08ng/mL,both of which showed a gradually increasing trend.ConclusionThe local immune response is increasing at early stage of tuberculous pleurisy.TIMP-1 and MMP-1 play a role in a series of processes,including the local inflammatory response,tissue necrosis and repair in the thoracic cavity.

rats;tuberculous pleurisy;matrix metalloproteinase-1;tissue inhibitors of metalloproteinase

杭州市醫(yī)藥衛(wèi)生科技計劃項目（No.2012B010）

浙江省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院（浙江省結(jié)核病治療中心）結(jié)核外科（杭州310003）

陳剛，Tel：15857106949；E-mail：cgang06@sina.com