香菇、金針菇、黑木耳多糖的提取與測(cè)定

杜娟+時(shí)文靜

摘要：以香菇、金針菇及黑木耳3種常見(jiàn)食用菌為主要原料，研究了食用菌多糖的提取條件和測(cè)定方法。采用熱水浸提、乙醇沉淀的方法提取多糖，然后運(yùn)用苯酚-硫酸法測(cè)多糖含量。分別從液料比、浸提溫度、浸提時(shí)間、乙醇濃度進(jìn)行了單因素試驗(yàn)，在此基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)L9（34）的正交試驗(yàn)，得出3種食用菌多糖提取的最優(yōu)組合。結(jié)果表明，影響香菇和金針菇多糖提取的主次因素是一致的，依次為浸提溫度、乙醇濃度、液料比；而對(duì)于黑木耳，液料比是最顯著的影響因素，其次為乙醇濃度、浸提溫度。最終測(cè)定的多糖含量香菇最高，為3.51%；其次為黑木耳，為3.50%；最低是金針菇，為2.94%。

關(guān)鍵詞：香菇；金針菇；黑木耳；多糖；提??；苯酚-硫酸法

中圖分類號(hào)： R284.2文獻(xiàn)標(biāo)志碼：

文章編號(hào)：1002-1302（2016）08-0347-03

食用菌中的多糖類物質(zhì)是增強(qiáng)免疫活性和抗衰老的有效成分之一，具有抗腫瘤、抗病毒、抗突變、抗輻射和降血壓等功能[1]。從食用菌中提取的多糖可作為配料添加到食藥保健品中，不僅沒(méi)有毒副作用，而且還能提供功效高、質(zhì)量好的產(chǎn)品。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，食用菌中顯著增強(qiáng)癌癥患者抵抗力的生理活性物質(zhì)即為食用菌多糖[2]。香菇、金針菇、黑木耳都是日常生活中常見(jiàn)的食用菌，均含有十分豐富的多糖物質(zhì)。香菇多糖是一種天然人體免疫調(diào)節(jié)劑，具有調(diào)節(jié)人體免疫系統(tǒng)、抗病毒、抗感染以及延緩衰老等作用；金針菇多糖不僅能有效提高人體免疫力，而且還有抗感染、抗氧化、保肝保濕、輔助改善記憶和緩解體力疲勞等保健作用[3]；木耳多糖同樣是一類重要的活性物質(zhì)，在抗腫瘤、抗凝血、抗病毒等方面均有一定的生物活性。本研究主要以香菇、金針菇、黑木耳為原料，利用水提醇沉法提取多糖，并對(duì)提取條件進(jìn)行優(yōu)化，分別從液料比、浸提溫度、浸提時(shí)間、乙醇濃度進(jìn)行單因素試驗(yàn)，在此基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，以確定最佳提取條件。最后運(yùn)用苯酚-硫酸法測(cè)定多糖含量，并驗(yàn)證此方法的可行性。

1材料與方法

1.1材料與儀器

新鮮香菇、金針菇、黑木耳購(gòu)于丹尼斯超市。S2F-06A粗脂肪測(cè)定儀，上海洪紀(jì)儀器設(shè)備有限公司生產(chǎn)；7720N可見(jiàn)分光光度計(jì)，濟(jì)南海能儀器股份有限公司生產(chǎn)。

1.2食用菌多糖的提取方法

將購(gòu)買(mǎi)的新鮮香菇、金針菇、黑木耳洗凈，然后放入烘箱中60 ℃烘干，待完全干燥后取出，于組織搗碎機(jī)中粉碎，過(guò)60目篩，置于干燥器中待用。

分別稱取干燥后的香菇、金針菇、黑木耳子實(shí)體粉末 10.00 g，用脂肪抽提器石油醚回流抽提除去脂肪，殘?jiān)鼡]干溶劑后，加入95%乙醇90 ℃回流提取2次，每次1.5 h，離心，揮干溶劑。將殘?jiān)謩e用300 mL（料液比1 ∶[KG-3]30）蒸餾水浸泡，水浴溫度95 ℃，浸提2 h，提取2次。合并提取液并將其濃縮至30 mL左右，用氯仿萃取3次，以除去蛋白質(zhì)。過(guò)濾后，向?yàn)V液中加入3倍體積的95%乙醇醇析，靜置過(guò)夜，多糖沉淀，過(guò)濾。濾餅分別用無(wú)水乙醇10 mL洗2次、用乙醚 10 mL 洗2次，60 ℃烘干至恒質(zhì)量，即得粗多糖樣品。

1.3食用菌多糖提取的因素研究

1.3.1單因素試驗(yàn)選擇不同液料比，分別為20、25、30、35、40 mL/g，進(jìn)行多糖提取，比較液料比對(duì)多糖提取率的影響；控制浸提溫度分別為80、85、90、95、100 ℃進(jìn)行多糖提取，比較溫度對(duì)多糖提取率的影響；選擇浸提時(shí)間分別為1、2、3、4、5 h進(jìn)行提取，比較時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響；選擇乙醇濃度分別為75%、80%、85%、90%、95%進(jìn)行醇析沉淀，比較乙醇濃度對(duì)多糖提取率的影響。

1.3.2正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，從液料比、浸提溫度、乙醇濃度這3個(gè)因素進(jìn)行正交試驗(yàn)，從而進(jìn)一步確定最優(yōu)的提取條件。

1.4.1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備準(zhǔn)確稱取在105 ℃下干燥至恒質(zhì)量的分析純葡萄糖對(duì)照品100 mg（稱準(zhǔn)至0.000 2 g），加水溶解，轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，定容，配制成1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。再取25 mL 1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液用水定容至 500 mL，使得溶液濃度為50 μg/mL。

1.4.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液（50 μg/mL）0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.2、1.6 mL于7支具塞試管中，各用蒸餾水補(bǔ)至2.0 mL，然后加入6%苯酚溶液1.0 mL及濃硫酸5.0 mL，搖勻，于沸水浴中加熱10 min，冷卻，于490 nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度，以吸光度（D）為縱坐標(biāo)，葡萄糖濃度（C）為橫坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得回歸方程。

1.4.3換算因子的測(cè)定[4]準(zhǔn)確稱取60 ℃干燥至恒質(zhì)量的香菇、金針菇、黑木耳粗多糖各0.1 g，加入適量水溶解后轉(zhuǎn)移至500 mL容量瓶中，定容，作為多糖儲(chǔ)備液。準(zhǔn)確吸取上述溶液1.0 mL，按“1.4.2”節(jié)操作方法測(cè)定吸光度，由回歸方程計(jì)算出粗多糖溶液中葡萄糖的濃度（C0）。按下式計(jì)算出換算因子：

[JZ（]f=m/（C0D0）。[JZ）][JY]（1）

式中：m為粗多糖質(zhì)量（μg）；C0為粗多糖液中葡萄糖的濃度；D0為粗多糖的稀釋倍數(shù)。

1.4.4樣品溶液的制備精確稱取香菇、金針菇、黑木耳粗多糖樣品粉末各0.1 g，置于燒瓶中，加95%乙醇100 mL，90 ℃ 提取1 h，過(guò)濾，濾餅用95%熱乙醇洗滌數(shù)次，然后將濾餅連同濾紙一起放入燒瓶中，加入100 mL蒸餾水，100 ℃提取1 h，過(guò)濾，濾餅用熱蒸餾水洗滌數(shù)次，洗液并入濾液，冷卻后轉(zhuǎn)移至500 mL容量瓶中，定容，搖勻備用。

1.4.5多糖含量的測(cè)定準(zhǔn)確吸取上述樣品溶液1.0 mL于具塞試管中，按“1.4.2”節(jié)方法操作，測(cè)定樣液中葡萄糖的含量。平行測(cè)定3次，由回歸方程計(jì)算樣液中葡萄糖的含量，按下式計(jì)算樣品中多糖的含量：

[JZ（]多糖含量=（C·D·f/m）× 100%。[JZ）][JY]（2）

式中：C為樣品溶液中的葡萄糖濃度；D為樣品溶液的稀釋倍數(shù)；f為換算因子；m為樣品的質(zhì)量（μg）。

1.4.6穩(wěn)定性試驗(yàn)分別取3種樣品溶液適量，按“1.4.2”節(jié)方法，測(cè)其吸光度，每隔30 min測(cè)1次，連續(xù)測(cè)定6次，記錄結(jié)果。

1.4.7精密度試驗(yàn)分別取3種樣液適量，按“1.4.2”節(jié)方法，重復(fù)測(cè)定吸光度5次，記錄數(shù)據(jù)。

1.4.8回收率試驗(yàn)取3種多糖樣品溶液1.0 mL于3支試管中，分別加入0.1 mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液（50 μg/mL），按“1.4.2”節(jié)方法，測(cè)其吸光度，重復(fù)操作3次，計(jì)算回收率。

2結(jié)果與分析

2.1單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1液料比對(duì)食用菌多糖提取率的影響不同液料比下所得提取率見(jiàn)圖1，在10～40 mL/g范圍內(nèi)，隨著液料比的增加，3種食用菌多糖的提取率均是先增后減，且在液料比為 30 mL/g 時(shí)，香菇多糖和金針菇多糖的提取率較高，而黑木耳多糖則是在35 mL/g左右。這主要是因?yàn)橐毫媳仍谝欢?程度上決定了多糖的提取率，當(dāng)其過(guò)低時(shí)會(huì)導(dǎo)致多糖提取不充分，而過(guò)高時(shí)又不易提取，因此選擇合適的液料比至關(guān)重要。

2.1.2浸提溫度對(duì)食用菌多糖提取率的影響不同浸提溫度下測(cè)定的多糖提取率見(jiàn)圖2，隨著溫度的上升，多糖的提取率也呈上升趨勢(shì)。這是由于浸提溫度較低時(shí)，溶質(zhì)的滲透能力和溶解能力也比較低，不利于多糖的浸出，從而導(dǎo)致多糖的提取率較低。但在90 ℃后變化很小，故90 ℃左右為較佳溫度。

2.1.4乙醇濃度對(duì)食用菌多糖提取率的影響不同乙醇濃度下所得多糖提取率見(jiàn)圖4，結(jié)果表明，多糖提取率隨著乙醇濃度的升高而上升，在95%的濃度下提取效果較好。這與乙醇沉淀多糖的原理是相通的，即通過(guò)降低水溶液的介電常數(shù)使多糖脫水從而產(chǎn)生沉淀來(lái)分離多糖，乙醇濃度越大，多糖的沉淀率越高。

2.2正交試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1香菇多糖的提取從表2可以看出，處理組合A2B3D2提取率最高，為2.16%。通過(guò)極差分析，A、B、D 3個(gè)因素中浸提溫度為最主要因素，其次為乙醇濃度，最后是液料比[CM（25]，比較k值得最優(yōu)組合為A2B3D3，進(jìn)行試驗(yàn)得提取率為[CM）]

2.29%，高于A2B3D2條件下的提取率，故香菇多糖的最佳提取條件為A2B3D3，即液料比為30 mL/g，溫度為92 ℃，乙醇濃度為95%。

2.2.2金針菇多糖的提取從表2可以看出，處理組合A2B3D2，提取率最高，為3.03%。通過(guò)極差分析，3個(gè)因素對(duì)提取率的影響大小依次為浸提溫度、乙醇濃度、液料比，理論上最佳提取條件為A2B3D3，經(jīng)驗(yàn)證得，A2B3D3條件下的提取率為3.27%，高于3.03%，故金針菇多糖的最佳提取條件為A2B3D3，即液料比30 mL/g，溫度92 ℃，乙醇濃度95%。

2.2.3黑木耳多糖的提取從表2可以看出，處理組合A3B2D3提取率最高，為2.52%。通過(guò)極差分析，3個(gè)因素對(duì)提取率的影響為液料比>乙醇濃度>浸提溫度，最佳提取條件為A3B3D3，進(jìn)行試驗(yàn)得提取率2.49%，低于2.52%，表明A3B2D3組合才是木耳多糖的最佳提取條件，即液料比 32 mL/g，溫度90 ℃，乙醇濃度95%。

2.3食用菌多糖含量的測(cè)定

2.3.1[JP3]葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制求得回歸方程C=24.08×D+0.011，r=0.990。式中：C為葡萄糖濃度，D為測(cè)定的吸光度。

2.3.2換算因子的測(cè)定本試驗(yàn)中測(cè)得的換算因子為f香菇=3.427，f金針菇=3.046，f黑木耳=7.192。

2.3.3多糖含量的測(cè)定結(jié)果從表3可以看出，3種食用菌多糖含量的測(cè)定結(jié)果，香菇中多糖含量最高，其次為黑木耳，金針菇多糖含量最低。

3結(jié)論

影響香菇、金針菇多糖提取率的主次因素是一致的，依次為浸提溫度、乙醇濃度、液料比； 影響黑木耳多糖提取率的最顯著因素為液料比，然后依次為乙醇濃度、浸提溫度。正交試驗(yàn)結(jié)果，香菇、金針菇在液料比30 mL/g、浸提溫度90 ℃、乙醇濃度95%的條件下提取率較高，黑木耳多糖的最佳提取條件則是液料比32 mL/g、浸提溫度90 ℃、乙醇濃度95%。在對(duì)多糖含量的測(cè)定試驗(yàn)中，通過(guò)穩(wěn)定性試驗(yàn)、精密度試驗(yàn)及回收率試驗(yàn)，表明苯酚-硫酸法簡(jiǎn)單易行，結(jié)果可靠，是較好的測(cè)定方法。3種多糖含量的測(cè)定結(jié)果由高到低依次順序?yàn)橄愎?、黑木耳、金針菇?/p>

參考文獻(xiàn)：

[1]郭春沅. 真菌多糖的免疫調(diào)節(jié)作用[J]. 中國(guó)食用菌，2000，19（3）：6-7.

[2]周日寶. 湖南藥用真菌的研究[J]. 湖南林業(yè)科技，1994，21（3）：55-59.

[3]劉孝永，陳蕾蕾，裘紀(jì)瑩，等. 金針菇多糖研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)食物與營(yíng)養(yǎng)，2012，18（5）：63-67.

[4]鐘世紅，衛(wèi)瑩芳，古銳，等. 苯酚-硫酸比色法測(cè)定紅毛五加皮多糖的含量[J]. 時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2010，21（2）：266-267.