響應(yīng)面法優(yōu)化蛇床子中蛇床子素的酶法提取工藝

寧娜??+韓建軍??+胡宇莉++鄒宗堯??+郁建生

摘要：采用蛇床子素作為原料，通過酶法從蛇床子中提取蛇床子素，并以蛇床子素提取率為指標(biāo)，研究料液比、酶種類、酶用量等因素的影響。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取酶用量、酶解溫度、酶解時(shí)間以及酶解pH值進(jìn)行了4因素3水平的Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)。結(jié)果表明，最優(yōu)提取條件為料液比 1 g ∶[KG-*3]30 mL、酶用量（纖維素酶 ∶[KG-*3]果膠酶=1 ∶[KG-*3]1）10.4 mg/g、酶解溫度46 ℃、酶解時(shí)間125 min、酶解pH值4.6，在此條件下蛇床子素的提取率可達(dá)95.13 %。

關(guān)鍵詞：蛇床子；蛇床子素；復(fù)合酶；提?。豁憫?yīng)曲面法

中圖分類號(hào)： R284.2文獻(xiàn)標(biāo)志碼：

文章編號(hào)：1002-1302（2016）08-0169-05

床子為傘形科植物蛇床[Cnidium monnieri （L.） Cuss.]的干燥成熟果實(shí)，具有燥濕祛風(fēng)、殺蟲止癢、溫腎壯陽之功效，臨床上用于陰癢帶下、宮冷不孕等癥[1]。蛇床子中含有香豆素類[2]、酚苷類[3]、揮發(fā)油[4]等多種化學(xué)成分，其中蛇床子素是蛇床子藥材的質(zhì)控成分[1]。體內(nèi)藥理研究表明蛇床子素具有抗炎[5]、神經(jīng)保護(hù)[6]、降血糖[7]等活性。

目前已報(bào)道的從蛇床子中提取蛇床子素的方法主要有乙醇回流法[8-9]、超聲法[10]、微波法[11]等。生物酶解技術(shù)是通過生物酶破壞植物細(xì)胞壁從而促進(jìn)有效成分提取，該方法具有提取效率高、反應(yīng)條件溫和、專一性強(qiáng)且易于控制等優(yōu)點(diǎn)[12-14]。現(xiàn)在越來越多的研究將生物酶解技術(shù)應(yīng)用于中藥有效成分的提取中，以達(dá)到提高有效成分的提取率、縮短提取時(shí)間、減少提取溶劑用量等目的[15-17]。采用生物酶解技術(shù)提取蛇床子中蛇床子素的研究尚未見報(bào)道。本研究采用生物酶提取蛇床子中蛇床子素成分，并通過響應(yīng)面法優(yōu)化該提取工藝，為蛇床子中蛇床子素的工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

1材料與方法

1.1試劑與儀器

蛇床子藥材購于河北安國中藥材市場(chǎng)，經(jīng)鑒定為傘形科植物蛇床子[Cnidium monnieri （L.） Cuss.]的干燥成熟果實(shí)；蛇床子素標(biāo)準(zhǔn)品購自中國食品藥品檢定研究院；纖維素酶（酶活性為22 000 U/g）購自寧夏和氏璧生物技術(shù)有限公司；水為重蒸水，乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純。

Agilent 1100高效液相色譜儀（手動(dòng)進(jìn)樣器、在線脫氣機(jī)、四元泵、DAD檢測(cè)器和Agilent ChemStation 色譜工作站），美國Agilent公司生產(chǎn)；SK8200H 超聲清洗器，上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司生產(chǎn)；pHS-3C精密pH計(jì)，上海光學(xué)儀器廠生產(chǎn)；METTLER AE240型十萬分之一電子天平，德國梅特勒公司生產(chǎn)；RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠生產(chǎn)；DK-S26電熱恒溫水浴鍋，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司生產(chǎn)；FZ102微型植物粉碎機(jī)，天津泰斯特儀器有限公司生產(chǎn)。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1HPLC法測(cè)定蛇床子素的含量

1.2.1.1色譜條件Agiletn Zorbax SB-C18柱（5 μm，4.6 ×250.0 mm2）；流動(dòng)相：乙腈/水（65/35，V/V）；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測(cè)波長：322 nm；進(jìn)樣量：10 μL。該色譜條件下理論塔板數(shù)以蛇床子素峰計(jì)算不低于3 000。該色譜條件下測(cè)定蛇床子素標(biāo)準(zhǔn)品及蛇床子藥材得到的色譜圖見圖1。

1.2.1.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制精密稱定蛇床子素對(duì)照品 12.5 mg 置于25 mL容量瓶中，并用無水乙醇定容至刻度，搖勻，分別精確量取此溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL至10 mL容量瓶中，并用無水乙醇定容至刻度，搖勻。分別精密吸取上述所配制的對(duì)照品溶液各10 μL注入液相色譜儀，按照上述色譜條件測(cè)定。以測(cè)得的峰面積y為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)品的進(jìn)樣濃度x（μg/mL）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。蛇床子素質(zhì)量濃度在5～50 μg/mL 范圍時(shí)，線性方程為y=18 467.46x-3 362.07，相關(guān)系數(shù)r=0.999 7，線性良好。

1.2.1.3蛇床子藥材中蛇床子素的含量測(cè)定本研究所用的蛇床子藥材按照《中國藥典》2010版一部蛇床子項(xiàng)下方法進(jìn)行含量測(cè)定，表明本試驗(yàn)中所用蛇床子藥材中蛇床子素的含量為1. 65%。

1.2.2蛇床子素的提取及提取率的計(jì)算取干燥的蛇床子藥材用中藥材粉碎機(jī)粉碎，過40目篩，取10 g 蛇床子粉末加入一定量的生物酶后，再按照一定的料液比加入蒸餾水，在一定溫度、pH值條件下酶解一定時(shí)間后，過濾，收集提取液，并將所得提取液濃縮后，用無水乙醇定容至100 mL，備用。用移液管精密吸取上述定容后的蛇床子提取液0.7 mL轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，加無水乙醇定容至刻度，搖勻，所得溶液經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜過濾后，取續(xù)濾液10 μL按照上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，并根據(jù)峰面積計(jì)算蛇床子素的提取率。蛇床子素提取率的計(jì)算公式：蛇床子素提取率=提取出的蛇床子素質(zhì)量/蛇床子藥材中蛇床子素質(zhì)量×100%。

2結(jié)果與分析

2.1單因素試驗(yàn)

2.1.1酶種類對(duì)蛇床子素提取率的影響準(zhǔn)確稱取10 g蛇床子粉末，加300 mL 蒸餾水，分別加入酶用量為10 mg/g的纖維素酶、果膠酶、復(fù)合酶（纖維素酶 ∶[KG-*3]果膠酶=2 ∶[KG-*3]1、1 ∶[KG-*3]1、1 ∶[KG-*3]2），在酶解pH值為5.0、酶解溫度為50 ℃的條件下酶解時(shí)間120 min后，過濾，收集濾液，并計(jì)算蛇床子素提取率，結(jié)果見圖2。

由圖2可知，與單一酶相比，由不同比例的纖維素酶和果膠酶組合成的復(fù)合酶對(duì)蛇床子中蛇床子素均有較好的提取效果。當(dāng)纖維素酶和果膠酶按1 ∶[KG-*3]1組合用于酶解提取時(shí)，蛇床子素的提取率最高，因此選用復(fù)合酶（纖維素酶 ∶[KG-*3]果膠酶=1 ∶[KG-*3]1）提取蛇床子素。

2.1.2料液比對(duì)蛇床子素提取率的影響準(zhǔn)確稱取10 g蛇床子粉末，按照不同料液比（1 ∶[KG-*3]10、1 ∶[KG-*3]20、1 ∶[KG-*3]30、1 ∶[KG-*3]40、1 ∶[KG-*3]50，g ∶[KG-*3]mL）加入蒸餾水，在復(fù)合酶（纖維素酶 ∶[KG-*3]果膠酶=1 ∶[KG-*3]1）用量為10 mg/g、酶解pH值為5.0、酶解溫度為50 ℃的條件下酶解時(shí)間120 min后，過濾，收集濾液，并計(jì)算蛇床子素提取率，結(jié)果見圖3。

由圖3可知，料液比小于1 g ∶[KG-*3]30 mL時(shí)，蛇床子素提取率隨著溶劑用量的增加而增大。當(dāng)料液比為1 g ∶[KG-*3]30 mL時(shí)蛇床子素提取率達(dá)到最大，此后隨著溶劑用量的進(jìn)一步增加，蛇床子素提取率呈下降趨勢(shì)。這是由于過多的溶劑會(huì)使提取溶液中生物酶的有效濃度降低，同時(shí)，提取溶劑用量過大也會(huì)增加后續(xù)濃縮過程的工作量。因此提取溶劑的料液比選定為1 g ∶[KG-*3]30 mL。

2.1.3酶用量對(duì)蛇床子素提取率的影響準(zhǔn)確稱取10 g蛇床子粉末，加300 mL 蒸餾水，加入一定量的由纖維素與果膠酶按1 ∶[KG-*3]1組合成的復(fù)合酶（6、8、10、12、14 mg/g），在酶解pH值為5.0、酶解溫度為50 ℃的條件下酶解時(shí)間120 min后，過濾，收集濾液，并計(jì)算蛇床子素提取率，結(jié)果見圖4。

由圖4可知，酶用量在6～10 mg/g時(shí)，蛇床子素提取率隨酶用量的增加而明顯升高，當(dāng)酶用量超過10 mg/g時(shí)，蛇床子素提取率增加的趨勢(shì)有所平緩。因此酶用量宜選擇在 10 mg/g 左右。

2.1.4酶解溫度對(duì)蛇床子素提取率的影響準(zhǔn)確稱取10 g蛇床子粉末，加300 mL 蒸餾水，復(fù)合酶（纖維素酶 ∶[KG-*3]果膠酶=1 ∶[KG-*3]1）用量為10 mg/g、酶解pH值為5.0，在一定酶解溫度（30、40、50、60、70 ℃）下酶解120 min后，過濾，收集濾液，并計(jì)算蛇床子素提取率，結(jié)果見圖5。

由圖5可知，當(dāng)酶解溫度低于50 ℃時(shí)，蛇床子素提取率隨著酶解溫度的升高而增加，當(dāng)酶解溫度達(dá)到50 ℃時(shí)，蛇床子素提取率達(dá)到最大。隨著酶解溫度的進(jìn)一步升高，蛇床子素提取率有所下降。這是因?yàn)榈陀谏锩傅淖钸m溫度時(shí)，溫度升高可促進(jìn)生物酶活性的增強(qiáng)，而高于生物酶的最適溫度時(shí)可引起酶蛋白的變性，從而降低生物酶的催化活力。因此酶解溫度宜選擇在50 ℃左右。

2.1.5酶解時(shí)間對(duì)蛇床子素提取率的影響準(zhǔn)確稱取10 g蛇床子粉末，加300 mL 蒸餾水，在復(fù)合酶（纖維素酶 ∶[KG-*3]果膠酶=1 ∶[KG-*3]1）用量為10 mg/g、酶解pH值為5.0、酶解溫度為 50 ℃ 的條件下酶解一定時(shí)間（60、120、180、240、300 min）后，過濾，收集濾液，并計(jì)算蛇床子素提取率，結(jié)果見圖6。

由圖6可知，酶解時(shí)間在60～120 min時(shí)，蛇床子素提取率隨著酶解時(shí)間延長而明顯升高。當(dāng)酶解時(shí)間超過120 min時(shí)，蛇床子素提取率增加的趨勢(shì)有所平緩。因此酶解時(shí)間宜選在120 min左右。

2.1.6酶解pH值對(duì)蛇床子素提取率的影響準(zhǔn)確稱取 10 g 蛇床子粉末，加300 mL蒸餾水，復(fù)合酶（纖維素酶 ∶[KG-*3]果膠酶=1 ∶[KG-*3]1）用量為10 mg/g、酶解pH值為5.0、酶解溫度為50 ℃，在一定pH值（3.0、4.0、5.0、6.0、7.0）的條件下酶解120 min后，過濾，收集濾液，并計(jì)算蛇床子素提取率，結(jié)果見圖7。

2響應(yīng)面分析響應(yīng)曲面陡峭程度可反映各個(gè)因素及因素交互作用對(duì)蛇床子素提取率影響的強(qiáng)弱。由圖8可知，在各個(gè)因素中，酶用量對(duì)蛇床子素提取率的影響最大，酶解pH值的影響次之，酶解溫度和酶解時(shí)間的影響均較?。唤换プ饔弥?，酶用量與酶解溫度、酶解溫度和酶解pH值的交互作用對(duì)蛇床子素提取率影響較強(qiáng)，而酶用量與酶解時(shí)間、酶用量與酶解pH值、酶解溫度與酶解時(shí)間、酶解時(shí)間與酶解pH值交互作用的影響較弱，與上述方差分析結(jié)果一致。

2.2.3最佳工藝條件及模型驗(yàn)證經(jīng)過Design-Expert 8.0.6 軟件分析，結(jié)合單因素試驗(yàn)結(jié)果，得到酶法提取蛇床子中蛇床子素的最佳工藝條件為料液比 1 g ∶[KG-*3]30 mL、酶用量（纖維素酶 ∶[KG-*3]果膠酶=1 ∶[KG-*3]1）10.44 mg/g、酶解溫度45.99 ℃、酶解時(shí)間124.64 min、酶解pH值4.58，蛇床子中蛇床子素的理論提取率為95.43%。為驗(yàn)證方法的可行性，采用上述條件對(duì)蛇床子中蛇床子素進(jìn)行提取，考慮到試驗(yàn)操作的可控性，將得到的優(yōu)化條件修正為料液比1 g ∶[KG-*3]30 mL、酶用量（纖維素酶 ∶[KG-*3]果膠酶=1 ∶[KG-*3]1）10.4 mg/g、酶解溫度46 ℃、酶解時(shí)間 125 min、酶解pH值4.6，進(jìn)行3組平行試驗(yàn)，測(cè)定蛇床子素的實(shí)際平均提取率為95.13 %，試驗(yàn)結(jié)果與模型預(yù)測(cè)相對(duì)誤差僅為 0.3%，較為接近，驗(yàn)證了響應(yīng)曲面法回歸模型的合理性。通過本試驗(yàn)結(jié)果與已經(jīng)報(bào)道的文獻(xiàn)結(jié)果[8-11]對(duì)比，可知生物酶解技術(shù)可有效提高蛇床子中蛇床子素的提取率，不僅可減少有機(jī)溶劑的使用，同時(shí)極大地縮短了提取時(shí)間，可為工業(yè)生產(chǎn)提供參考。

3結(jié)論

通過單因素試驗(yàn)、Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)面分析，得到優(yōu)化的酶法提取蛇床子中蛇床子素的工藝提取條件為料液比1 g ∶[KG-*3]30 mL、酶用量（纖維素酶 ∶[KG-*3]果膠酶=1 ∶[KG-*3]1）10.4 mg/g、酶解溫度46 ℃、酶解時(shí)間125 min、酶解pH值 4.6，在此條件下蛇床子素的提取率可達(dá)95.13 %，

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