蚯蚓在土壤污染風險評價中的應(yīng)用研究進展

羅潔文+黃玫英+殷丹陽+周垂帆+吳鵬飛

摘要：蚯蚓是陸地生態(tài)系統(tǒng)中生物量最大的無脊椎土壤動物，是土壤中的重要生物，蚯蚓既能夠反映土壤的污染狀況，又能鑒定指示各種有害物質(zhì)的毒性，因此被視為土壤區(qū)系的代表類群而被應(yīng)用于指示、監(jiān)測土壤污染和質(zhì)量評價。隨著生態(tài)環(huán)境污染和土壤質(zhì)量的下降，蚯蚓生態(tài)毒理學(xué)研究得到國內(nèi)外眾多學(xué)者的重視，以蚯蚓作為土壤污染指示生物開展了大量的研究工作。蚯蚓在外源污染物脅迫下，其種群以及個體生理生化水平都會發(fā)生明顯的變化。系統(tǒng)闡述蚯蚓在群落以及個體水平上的生態(tài)毒理學(xué)研究現(xiàn)狀，指出目前蚯蚓毒理學(xué)研究存在的薄弱環(huán)節(jié)，并對今后的研究趨勢進行了展望。

關(guān)鍵詞：蚯蚓；土壤污染；生態(tài)毒理學(xué)；生物監(jiān)測

中圖分類號： S151.9+3；X174文獻標志碼：

近年來，隨著人口劇增以及經(jīng)濟的高速發(fā)展，人類活動導(dǎo)致的環(huán)境污染問題正不斷加劇，并已成為嚴重影響人類可持續(xù)發(fā)展的突出問題。我國環(huán)境保護部與國土資源部于2014年共同發(fā)布的《全國土壤污染狀況調(diào)查公報》顯示，全國土壤總點位超標率為16.1%，其中無機污染物超標點位占總超標點位的82%，從污染情況來看，重金屬污染尤為嚴重[1]。土壤是污染物的“集散地”之一，土壤污染不僅導(dǎo)致土地質(zhì)量退化，影響農(nóng)產(chǎn)品安全，而且還可以通過淋溶作用污染地表水、地下水。土壤污染具有隱蔽性、累積性、滯后性等特點，一旦發(fā)生嚴重污染，往往造成不可逆轉(zhuǎn)的嚴重后果[2]。土壤已成為影響生態(tài)環(huán)境、耕地質(zhì)量、食品安全和人類健康的重要因素，是人類賴以生存的基礎(chǔ)，土壤環(huán)境質(zhì)量狀況與人類息息相關(guān)。因此，研究土壤污染物對生物體的毒性作用，由此對環(huán)境生態(tài)風險早期診斷作出可靠的評估，以期為污染物的早期診斷、早期預(yù)防和控制提供基礎(chǔ)理論及技術(shù)支持。

土壤的污染程度可以通過環(huán)境調(diào)查和監(jiān)測進行評價，評估和表征污染物生物效應(yīng)的一種常見方法是生態(tài)風險評價，此方法主要以動物、植物和微生物作試驗生物，蚯蚓便是其中的標準化測試物種之一。蚯蚓作為土壤污染的指示生物愈來愈受到重視，目前已被廣泛應(yīng)用于土壤污染的監(jiān)測。有研究表明，蚯蚓組織中的農(nóng)藥和重金屬含量可作為監(jiān)測土壤污染的重要指標[3]。蚯蚓是土壤中普遍存在的無脊椎生物，是土壤系統(tǒng)中重要的組成部分，占土壤動物總量的60%～80%，長期暴露在土壤中，是陸生生物與土壤生物之間的紐帶，是農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中土壤物質(zhì)生物小循環(huán)中重要的一環(huán)[4]，被認為是適合對土壤中化學(xué)物質(zhì)進行毒性測試的物種之一。蚯蚓既能夠反映土壤的污染狀況，又能鑒定指示各種有害物質(zhì)的毒性。目前，應(yīng)用于土壤生態(tài)毒理試驗的蚯蚓有十多種，其中最常用的是生活于腐殖質(zhì)或富含有機質(zhì)環(huán)境中的赤子愛勝蚓（Eisenia foetida），該蚯蚓由于容易在實驗室養(yǎng)殖等優(yōu)點被廣泛應(yīng)用于新化學(xué)品潛在毒性測試及污染土壤的風險評估。經(jīng)濟合作與發(fā)展組織（Organization for Economic Co-operation and Development，OECD）和國際標準化聯(lián)合會（International Organization for Standardization，ISO）分別制定了相關(guān)的蚯蚓生態(tài)毒性測試的標準方法，并積累了大量毒性測試數(shù)據(jù)[5]。美國測試與材料學(xué)會已公布了關(guān)于實驗室開展蚯蚓生物富集研究的標準草案。有關(guān)蚯蚓生態(tài)毒性研究的2次國際學(xué)術(shù)會議均在丹麥舉行，討論與交流蚯蚓生態(tài)毒理學(xué)的研究進展與發(fā)展，并在相關(guān)雜志出版了專輯[6]。許多研究發(fā)現(xiàn)，蚯蚓受到污染脅迫時，蚯蚓種群和群落會發(fā)生明顯的變化，并且在蚯蚓微觀水平上，如細胞、分子和生理生化水平上都會發(fā)生明顯的變化。本研究在總結(jié)國內(nèi)外相關(guān)研究的基礎(chǔ)上，從外來污染物對蚯蚓種群、生化特性和個體的影響3個方面進行綜述，分析蚯蚓生態(tài)毒理試驗在土壤污染風險評價中的作用，以期為土壤污染監(jiān)測和土壤環(huán)境質(zhì)量評價的研究提供參考。

1蚯蚓生態(tài)毒理學(xué)研究方法

蚯蚓生態(tài)毒理學(xué)是指利用蚯蚓作為目標載體，對環(huán)境中造成土壤污染的化學(xué)物質(zhì)進行測試，根據(jù)這些化學(xué)物質(zhì)對蚯蚓的毒害程度來評價其可能對生態(tài)系統(tǒng)及其組分的危害程度[7]。蚯蚓生態(tài)毒理學(xué)研究常用的方法有實驗室毒理試驗法和田間試驗法，根據(jù)試驗研究過程的長短或化學(xué)物質(zhì)劑量的大小，蚯蚓的毒性試驗可分為急性毒性試驗、慢性毒性試驗。急性毒理試驗是通過簡單、快速的方法測試有毒物對蚯蚓的毒性，從而對該毒物的生態(tài)毒性作出初步的判斷。慢性毒理試驗主要是研究有害化學(xué)殘留物質(zhì)對蚯蚓生殖、生理、代謝、染色體及基因等深層次的影響。該領(lǐng)域從分子、基因水平探討污染物對土壤生態(tài)系統(tǒng)的污染狀況，對土壤生態(tài)系統(tǒng)的早期快速診斷具有重要的意義。目前在低劑量污染物對蚯蚓長期效應(yīng)的研究中，選用幼蚓作為指示生物來檢測污染物對土壤生態(tài)系統(tǒng)的影響效果最顯著。

1.1室內(nèi)模擬試驗

在試驗方法的選用中，實驗室毒理試驗法被廣泛采用，常用的實驗室試驗方法主要有以下幾種。

1.1.1濾紙接觸法這種方法一般應(yīng)用于急性毒性試驗，是通過將蚯蚓暴露在填充標準化濾紙的玻璃器皿中，與不同濃度的化學(xué)藥品接觸48 h后測定蚯蚓的死亡率，并可通過統(tǒng)計學(xué)方法得出半致死濃度（LC50）。濾紙接觸法快速、簡單易行，但是此方法僅能提供蚯蚓通過皮膚接觸有害物質(zhì)所產(chǎn)生的毒性信息，因此難以評估化學(xué)物質(zhì)對環(huán)境的真實影響[8]。劉偉等采用濾紙接觸法和土壤培養(yǎng)法研究毒死蜱（chlorpyrifos）、馬拉硫磷（malathion）和氰戊菊酯（fenvalerate）對赤子愛勝蚓的急性毒性效應(yīng)，從試驗結(jié)果看，通過濾紙接觸法測得這3種農(nóng)藥對蚯蚓的致死劑量小于土壤培養(yǎng)法，土壤培養(yǎng)法較接近自然狀況下蚯蚓接觸藥品的方式，故以土壤培養(yǎng)法測定的LC50作為劃分藥物毒性等級的依據(jù)比濾紙接觸法更為客觀準確[9]。

1.1.2溶液法該方法一般用于急性毒性試驗，主要是模擬土壤溶液中主要養(yǎng)分，即向溶液添加定量的鉀（K）、鈉（Na）、鈣（Ca）、鎂（Mg）等成分以及需要測定的污染物并把蚯蚓暴露于溶液中[10]。國內(nèi)外已有較多報道，該方法具有快速、簡便、暴露直接等優(yōu)點，可用于毒物的初篩和毒性的快速鑒別。溶液法在重金屬如鎘（Cd）、銅（Cu）、鋅（Zn）以及納米TiO2、ZnO等毒物對蚯蚓的毒性效應(yīng)中都有相關(guān)的應(yīng)用[11-13]。

1.1.3回避試驗回避試驗是利用動物趨利避害本能的一種實驗室毒理試驗法，通過測定一定濃度某化學(xué)物質(zhì)對蚯蚓個體行為的影響程度來判定其毒性[14]。國際標準化組織早于2005年公布了利用蚯蚓回避行為反應(yīng)評價土壤環(huán)境質(zhì)量的標準化試驗方法，赤子愛勝蚓和安得愛勝蚓（E. andrei）是國際標準化組織指定的回避試驗標準蚯蚓品種[15]。蚯蚓的回避試驗具有操作簡便、反應(yīng)快速、靈敏度高和重現(xiàn)性好等優(yōu)點。目前，蚯蚓回避試驗已發(fā)現(xiàn)可適用于檢測土壤中的原油、礦物油、多環(huán)芳烴等石油類污染物，功夫菊酯、代森錳鋅、本菌靈、多菌靈等農(nóng)藥，錳、鋅、銅或其他重金屬的混合物等多種污染物，其敏感性高于急性毒性試驗，也高于或至少等同于亞急性毒性試驗中的生殖毒性試驗[16]，因此，回避試驗在污染土壤生態(tài)風險評價方面具有廣闊的應(yīng)用前景。

1.1.4人工土壤試驗通過將成熟的赤子愛勝蚓或安得愛勝蚓（E. andrei）置于含有不同濃度供試化學(xué)品的人工土壤中培養(yǎng)14 d，觀察其行為和存活狀況。通常情況下，人工土壤由10%苔蘚泥炭細土（pH值=6）、20%高嶺黏土（高嶺土比例大于50%）、69%工業(yè)石英砂（含50%以上0.05～0.20 mm的細小顆粒）和1% CaCO3（化學(xué)純）組成[17]。利用這種復(fù)雜的人工土壤進行試驗的主要目的是盡可能模擬蚯蚓生活的真實環(huán)境，從而使試驗結(jié)果盡可能真實地反映污染物在自然界中的實際影響，這也是此方案最明顯的優(yōu)點。Zhou等利用人工土壤法進行鎘與草甘膦復(fù)合對蚯蚓的亞性毒性試驗，探討草甘膦存在的條件下鎘對蚯蚓的存活、生長、繁殖、生化指標等影響規(guī)律[18]。

1.1.5人造土壤試驗這是用一種無定形水和改性的二氧化硅粉，并在其中加入直徑為1.5～2.0 cm的玻璃球以代替人工土壤的試驗方法，是根據(jù)上述人工土壤試驗方法改進而得。此方法的優(yōu)點是使用確切定義的物質(zhì)作為基質(zhì)，操作簡便，其結(jié)果也更具有可比性，并且由于這種物質(zhì)的化學(xué)惰性，基本上可以確定不會與試驗容器及被測物質(zhì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。所加入玻璃球一方面能創(chuàng)造一個類似土壤結(jié)構(gòu)的環(huán)境，另一方面能增加被測物質(zhì)的接觸面積。從試驗的結(jié)果來看，與人工土壤試驗一樣也能較好反映污染物的真正影響。有研究者認為，相較于人工土壤試驗，人造土壤試驗方法更簡便易行，更易于標準化[19]。如肖能文等就把人造土壤法應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因棉中Bt毒蛋白Cry1Ac對蚯蚓生理水平的影響[20]。

1.2田間毒理試驗

嚴格意義上說，實驗室試驗方法并不是真正意義上的生態(tài)毒理學(xué)試驗，但因其實用價值而得到重視和發(fā)展。實驗室試驗方法主要應(yīng)用在蚯蚓個體水平及模擬環(huán)境中，而田間試驗法在種群、群落調(diào)查及土壤系統(tǒng)的實地考察等方面都有所應(yīng)用。目前，越來越多的蚯蚓毒理試驗將微觀的試驗方法和宏觀的調(diào)查分析結(jié)合在一起，在研究生化指標的同時，探討污染物對蚯蚓種群或群落及整個土壤系統(tǒng)的生態(tài)效應(yīng)，使試驗結(jié)果對土壤的生態(tài)評價更具有指導(dǎo)性。

蚯蚓的田間生態(tài)毒理試驗是指在實際的生態(tài)系統(tǒng)中直接測試某種化學(xué)物質(zhì)對蚯蚓種群生態(tài)毒性的試驗。由于試驗直接在現(xiàn)實的土壤環(huán)境中進行，因而其結(jié)果也更直接地反映被測物質(zhì)對環(huán)境的實際影響。與實驗室試驗方法相比，田間生態(tài)毒理試驗有諸多的優(yōu)點[19]，但是由于試驗條件的復(fù)雜性，其試驗結(jié)果常常不具有可比性；同時，試驗方法和評價標準多樣化，可用的數(shù)據(jù)是有限的。因此，盡管蚯蚓田間生態(tài)毒理試驗在評價化學(xué)藥品的生態(tài)毒性上很有價值，但仍需要更多研究者在試驗方法的標準化和制定相關(guān)評價標準方面進行更深入的探討。

2蚯蚓種群對土壤污染物的響應(yīng)

蚯蚓種群的生物多樣性是伴隨著蚯蚓對各種生態(tài)環(huán)境的適應(yīng)而產(chǎn)生的[3]。許多有毒有害的物質(zhì)通過各種途徑進入土壤生態(tài)系統(tǒng)后，可導(dǎo)致蚯蚓及其他土壤動物種群的顯著變化。在外源污染物脅迫下，耐污染強的優(yōu)勢種可能會表現(xiàn)出更高的優(yōu)勢度，一些對污染敏感的蚯蚓種群不能繼續(xù)生存和繁衍，能夠耐受污染物的種群保留下來，從而導(dǎo)致蚯蚓在密度和群落結(jié)構(gòu)上發(fā)生明顯的變化[21]。因此，在大多數(shù)情況下，蚯蚓種群密度、種類豐度和數(shù)量等參數(shù)，都是評價污染物對環(huán)境危害程度的重要工具。目前，關(guān)于土壤動物——蚯蚓的研究并未引起國內(nèi)研究者的關(guān)注，國內(nèi)外相關(guān)研究并不多。王振中等對湖南株洲清水塘金屬冶煉工業(yè)區(qū)附近土壤中的蚯蚓種群種類和密度進行了研究，發(fā)現(xiàn)隨著鎘、砷、鋅、鉛、汞等重金屬污染程度的增加，蚯蚓的種類明顯減少，優(yōu)勢種以3種巨蚓科種為主[22]。換而言之，重金屬元素能在土壤動物體內(nèi)積累，重金屬在蚯蚓體內(nèi)積累到一定的濃度后，對污染敏感的種類便不能繼續(xù)繁殖和生存。Lukkari等在芬蘭選取不同重金屬污染以及不同土壤特性的冶金工業(yè)區(qū)土壤中的蚯蚓進行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，距離污染源越近，蚯蚓的密度、數(shù)量和生物量都明顯地下降[23]。Klok等對荷蘭和比利時洪水頻發(fā)的河漫灘平原地區(qū)的工業(yè)污染區(qū)進行研究，結(jié)果表明，蚯蚓的密度和生物量都與Cd、Cu、Zn呈對數(shù)變換關(guān)系，隨著重金屬濃度的增加而降低，在高Zn、高Cd含量的污染區(qū)僅有粉正蚓（Lambricus rubellus）能夠存活[24]。另外，有研究表明，蚯蚓對農(nóng)藥十分敏感，低劑量的農(nóng)藥即可引起蚯蚓數(shù)量的減少[5]。張友梅等對農(nóng)藥和重金屬污染區(qū)的蚯蚓調(diào)查結(jié)果表明，蚯蚓的種類和數(shù)量隨著土壤污染程度的增加而減少，重污染區(qū)蚯蚓的種類單一，均勻性降低，而清潔區(qū)則種類豐富，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，均勻性增加[25]。Céline對農(nóng)藥和蚯蚓之間的關(guān)系進行研究發(fā)現(xiàn)，農(nóng)藥能破壞蚯蚓體內(nèi)的酶活性，使其死亡率上升，繁殖力下降，進而對蚯蚓種群產(chǎn)生影響[26]。Santadino等在研究除草劑草甘膦對蚯蚓種群的影響時發(fā)現(xiàn)，草甘膦劑量的增加明顯地降低了蚯蚓的繁殖能力，慢性的毒性使得蚯蚓種群數(shù)量下降，甚至造成區(qū)域性的滅絕[27]。有研究還發(fā)現(xiàn)，污染物對蚯蚓的影響不僅存在于不同蚯蚓種類之間，還存在于同一蚯蚓的種內(nèi)間[28]。以上研究所得出的結(jié)論能在一定程度上說明，蚯蚓種群密度、數(shù)量、空間分布等可以用于土壤生態(tài)系統(tǒng)污染的程度分析。然而實地調(diào)查污染土壤中的蚯蚓種群數(shù)量及種群結(jié)構(gòu)不僅需要較多的人力物力，而且耗資、費時，想要獲得更深入的、定量化的信息來描述土壤生態(tài)系統(tǒng)受污染的動態(tài)變化仍然需要更多的研究。

3蚯蚓個體對土壤污染物的響應(yīng)

3.1蚯蚓個體對土壤污染物的富集作用

蚯蚓位于陸地生態(tài)食物鏈金字塔的底端，土壤中的污染物在蚯蚓體內(nèi)富集后，可以在食物鏈中傳遞和生物放大，從而必將導(dǎo)致食物鏈的逐級富集，最終威脅人類的健康。蚯蚓主要通過被動擴散作用和攝食作用這2種途徑富集土壤中的污染物，前者是污染物從土壤溶液透過體表進入蚯蚓體內(nèi)；而后者則是土壤中的污染物通過蚯蚓的吞食作用進入到其體內(nèi)，并在內(nèi)臟器官內(nèi)完成吸收。有研究通過測定重金屬污染土壤中不同鉛濃度梯度下蚯蚓在培養(yǎng)期內(nèi)對鉛的富集量表明，蚯蚓對鉛有較強的富集作用，且隨鉛濃度的增加，蚯蚓體內(nèi)的富集量也增加[29]。Langdon等研究發(fā)現(xiàn)，3種蚯蚓（L. rubellus、E. Andrei、A. caliginosa）對鉛都有明顯的吸收富集能力[30]。另外，蚯蚓對重金屬的富集作用是具有一定選擇性的，有學(xué)者在研究蚯蚓對重金屬的最大富集量中發(fā)現(xiàn)，蚯蚓對Zn、Cu、Pb、Hg 4種重金屬的吸收量由大到小為Zn>Cu>Pb>Hg[31]。

3.2蚯蚓的存活及行為對土壤污染物的響應(yīng)

當蚯蚓與高劑量農(nóng)藥或其他污染物接觸時，會產(chǎn)生逃逸現(xiàn)象，最終會在短時間出現(xiàn)中毒癥狀，甚至死亡；長時間的低劑量作用則可能引起夏眠、糞便排放量減少等現(xiàn)象的發(fā)生。Reinecke等研究發(fā)現(xiàn)，果園噴灑農(nóng)藥后，土壤中的蚯蚓種群密度明顯降低[32]。有研究發(fā)現(xiàn)，蚯蚓暴露在不同濃度的Cu2+溶液中，部分表現(xiàn)出行為異常。隨著時間延長，赤子愛勝蚓身體變?nèi)彳?，環(huán)節(jié)腫脹，身體后段萎縮糜爛，甚至斷裂，并失去逃逸能力，直至死亡[33]。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，暴露在吡蟲啉等殺蟲劑中的蚯蚓糞便排出量顯著減少，蚯蚓排便量因其測定簡便、快速，已成為評估生物毒性的良好指標[26]。

3.3蚯蚓生長、發(fā)育和繁殖對土壤污染物的響應(yīng)

土壤中的外源污染物會對蚯蚓的生長發(fā)育和繁殖產(chǎn)生一定的負面效應(yīng)。其中，生殖系統(tǒng)是動物體內(nèi)對外源污染物反應(yīng)最敏感、最容易受到不良環(huán)境因素影響的系統(tǒng)。重金屬、農(nóng)藥等污染物進入蚯蚓體內(nèi)會破壞蚯蚓的細胞組織結(jié)構(gòu)從而影響蚯蚓的產(chǎn)卵能力和精子的形成過程。郭永燦等研究表明，在受農(nóng)藥污染土壤生活的蚯蚓因精子發(fā)生畸變、受精能力喪失，而導(dǎo)致不育，敏感種類在農(nóng)藥污染區(qū)甚至無法繁衍[34]。另外，土壤中高濃度的鎘、銅、鉛、鋅等能夠影響蚯蚓種群密度、生存能力、體質(zhì)量變化、性發(fā)育、產(chǎn)卵率、孵化率等重要指標。相關(guān)研究表明，赤子愛勝蚓暴露在2 mg/kg呋喃丹污染的土壤中，蚯蚓個體不能發(fā)育出環(huán)帶和產(chǎn)卵[35]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，污水處理廠中的銀納米粒子和硝酸銀均會對蚯蚓的繁殖產(chǎn)生影響，抑制其繁殖和生長[36]。

4蚯蚓重要生物標志物在污染物中期診斷中的作用

近年來，細胞或分子水平上的生物標志物作為污染物暴露和毒性效應(yīng)的早期預(yù)警指標受到廣泛關(guān)注，并成為國內(nèi)外生態(tài)毒理學(xué)研究的熱點之一[2]。而污染物對蚯蚓生化指標以及微觀指標的影響也是目前蚯蚓生態(tài)毒理學(xué)的研究熱點。隨著土壤性質(zhì)的變化，污染物的生物有效性（即產(chǎn)生毒性的能力）是不斷變化的，而生物暴露于污染物后產(chǎn)生的生理、生化方面的反應(yīng)是相對穩(wěn)定的[21]。因此，利用蚯蚓的分子、生物化學(xué)和生理反應(yīng)即生物標志物可以在指示半致死效應(yīng)變得明顯前，研究污染物對蚯蚓在個體水平上所產(chǎn)生的影響，對此進行的研究可完善土壤污染的早期預(yù)警系統(tǒng)并對土壤污染進行監(jiān)測。目前被廣受關(guān)注的蚯蚓微觀指標主要包括：溶酶體膜的穩(wěn)定性、DNA的損傷作用、抗氧化防御系統(tǒng)、金屬硫蛋白和免疫行為等。

4.1蚯蚓溶酶體膜穩(wěn)定性

溶酶體又稱溶體、溶小體，是單層膜的囊狀胞器，內(nèi)部含有數(shù)十種從高爾基體送來的水解酶，這些酶主要負責消化過程，也是有毒物質(zhì)在亞細胞水平的特殊靶標。溶酶體可通過吞噬方式消化、溶解部分由于損傷而喪失功能的細胞器和其他細胞質(zhì)顆?；蚪?jīng)細胞攝入的外源物質(zhì)[16]。中性紅染料能在蚯蚓體腔細胞內(nèi)的溶酶體中很快地積累，當蚯蚓受到環(huán)境脅迫時，其溶酶體膜受到損傷，滲透性發(fā)生變化，隨之失去穩(wěn)定性，染料就逐步泄漏到細胞質(zhì)中，因而可以利用中性紅保留時間（neutral red retention time，NRRT） 來表征溶酶體膜的穩(wěn)定性，溶酶體膜的穩(wěn)定性與污染物劑量具有良好的線性關(guān)系，并可以對土壤的污染情況起到早期預(yù)警作用。目前該方法已經(jīng)應(yīng)用到重金屬、農(nóng)藥、石油烴、多環(huán)芳烴等土壤污染源的監(jiān)測與評價中。Gupta利用NRRT指標診斷土壤Cd污染，對照土壤中蚯蚓溶酶體的NRRT為119 min，隨著土壤Cd處理濃度升高，NRRT呈直線下降[37]。在有機污染物和農(nóng)藥方面，張偉等的研究表明，將蚯蚓暴露于苯并[a]芘（B[a]P）污染的土壤，溶酶體膜的滲透性增加并失去穩(wěn)定性，NRRT呈現(xiàn)出隨著培養(yǎng)時間的延長而增加的趨勢[38]。Booth等研究有機磷殺蟲劑對Aporrectodea caliginosa的毒害作用表明，無論在實驗室或田間條件下，NRRT均具有明顯的污染指示作用[39]。目前來說，同其他指標相比，NRR指標對污染物更為敏感，因此被作為污染物的早期預(yù)警生物標志物。

4.2蚯蚓DNA的損傷作用

DNA是生物體內(nèi)重要的大分子，也是生物體內(nèi)重要的遺傳物質(zhì)，DNA若發(fā)生超過其本身修復(fù)能力的損傷，則會影響DNA的結(jié)構(gòu)和功能，導(dǎo)致細胞死亡或細胞突變。目前，毒物對蚯蚓DNA的損傷是蚯蚓分子生態(tài)毒理學(xué)研究的重要內(nèi)容之一。當前對蚯蚓DNA的損傷作用主要通過單細胞凝膠電泳（彗星實驗）和DNA加合物進行分析[39-41]，由于這2種方法均可靈敏地表征農(nóng)藥、重金屬、多環(huán)芳烴等污染物潛在的遺傳毒性和早期暴露效應(yīng)。因此，蚯蚓DNA損傷是用于檢測污染物致癌、致畸、致突變效應(yīng)的理想生物標志物[42]。曹佳等利用單細胞凝膠電泳技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，異[XCZ1.tif]草酮對土壤動物蚯蚓具有毒性作用，不同濃度異[XCZ1.tif]草酮的暴露均能引起蚯蚓體腔細胞DNA的損傷，表明DNA的損傷與異[XCZ1.tif]草酮呈現(xiàn)出很好的劑量-效應(yīng)關(guān)系[43]。Espinosa-Reyes等對墨西哥重要工業(yè)城市韋拉克魯斯州某工業(yè)區(qū)附近持久性有機污染物（POPs）污染土壤中的蚯蚓進行彗星實驗研究，發(fā)現(xiàn)蚯蚓DNA損傷顯著高于實驗室培養(yǎng)的蚯蚓，認為蚯蚓的DNA損傷能夠很好地指示有機污染物對環(huán)境的影響[35]。

4.3蚯蚓的抗氧化防御系統(tǒng)

抗氧化防御系統(tǒng)作為活性氧的清道夫，在活性氧的清除以及機體的保護性防御中發(fā)揮著巨大的作用，該系統(tǒng)包括酶和非酶系統(tǒng)兩大類[2]。污染物可以引起蚯蚓體內(nèi)酶活性發(fā)生變化，有許多研究者提出可將蚯蚓體內(nèi)酶活性作為生物標志物指示土壤污染，目前所研究的酶主要包括[36]：超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、乙酰膽堿酯酶（AChE）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（GST）等。而非酶系統(tǒng)是指除抗氧化酶外，在機體保護防御過程中也發(fā)揮著不可替代作用的小分子抗氧化物質(zhì)，這類物質(zhì)包括谷胱甘肽（GSH）、抗壞血酸（維生素C）、α-生育酚（維生素E）等，特別是GSH，這是有機體抵抗污染脅迫的第1道防線，在降低外源污染的生物毒性和清除活性氧中發(fā)揮著重要的作用。王輝等的研究表明，土壤中Cd、Cu、Pb復(fù)合污染對蚯蚓體內(nèi)SOD、GST和堿性磷酸酶（AP）活性產(chǎn)生顯著的誘導(dǎo)效應(yīng)，酶活性與重金屬含量及其持續(xù)時間密切相關(guān)[44]。Zhou等研究也發(fā)現(xiàn)，單一Cu脅迫使蚯蚓體內(nèi)SOD、GSH、AChE活性提高，并且明顯高于毒性較低的草甘膦和空白對照[18]。李淑梅等研究廢電池在土壤中對蚯蚓的可溶性蛋白和SOD活性的影響，結(jié)果表明蚯蚓SOD活性呈先上升后下降的趨勢，隨時間變化呈拋物線形[45]。雖然很多證據(jù)都表明蚯蚓對金屬具有耐性，但是其中的耐性機理并不清楚，對這方面的研究也不多。目前在重金屬污染方面存在著一種共識，即生物體暴露于重金屬后，可能會受到氧化脅迫的威脅，為了避免受到傷害，生物體內(nèi)某些與抗氧化相關(guān)的酶活性就會升高，緩解活性氧對生物體造成的危害[46]。由此可以看出酶與重金屬之間存在著密切關(guān)系，酶活性的研究在蚯蚓對重金屬耐性機制領(lǐng)域有重要作用。關(guān)于污染物對蚯蚓酶活性的影響方面的研究有很多，但是對酶活性的影響機制有待進一步研究。

4.4金屬硫蛋白

金屬硫蛋白是一種低分子量、富含半胱氨酸的金屬結(jié)合蛋白，廣泛存在于生物體內(nèi)，并具有參與生物體內(nèi)微量元素儲存、運輸和代謝、拮抗電離輻射、清除羥基自由基和重金屬解毒等多種生物學(xué)作用。金屬硫蛋白可在實驗室或野外條件下由各種營養(yǎng)必需和非必需的有毒金屬誘導(dǎo)合成[37]，它們被認為是可檢測金屬污染的生物標志物，具有很強的特異性。目前，蚯蚓的金屬硫蛋白已成功應(yīng)用于對鎘、銅、鋅等重金屬暴露的評價。Gruber等研究表明，在實驗室條件下，暴露在重金屬Cd中使得蚯蚓體內(nèi)金屬硫蛋白含量大幅度增加，并結(jié)合了高達65%進入體內(nèi)組織的Cd[47]。Mustonen等把不同種群的蚯蚓暴露在不同濃度的銅、鋅污染中，比較發(fā)現(xiàn)，污染物濃度越高的環(huán)境下，蚯蚓體內(nèi)金屬硫蛋白含量越高[48]。在國內(nèi)研究方面，陳春等通過土壤染毒培養(yǎng)試驗，利用重金屬Cd對蚯蚓（E. foetida）進行染毒，發(fā)現(xiàn)Cd可誘導(dǎo)蚯蚓體內(nèi)的MT mRNA表達，其表達水平與Cd污染暴露呈現(xiàn)出劑量-效應(yīng)和時間-效應(yīng)關(guān)系[49]。另外有研究表明，金屬硫蛋白對不同重金屬敏感程度不一，相較于Cu，對Cd脅迫的響應(yīng)更為敏感；此外，金屬硫蛋白對重金屬的敏感度高于對農(nóng)藥的敏感度[36]。以上分析表明，可以利用蚯蚓的金屬硫蛋白作為潛在分子標志物，診斷環(huán)境中的污染物及其暴露水平。

4.5免疫功能

為了適應(yīng)不利的生存環(huán)境，蚯蚓體內(nèi)進化產(chǎn)生了獨特的抗菌與免疫系統(tǒng)，逐漸形成了防御病原細菌侵襲的有效機制。蚯蚓的免疫系統(tǒng)主要由體腔細胞組成，外源污染物進入蚯蚓體內(nèi)可使蚯蚓體腔細胞的存活率及體腔細胞的噬菌細胞活性降低，因而體腔細胞可被用于指示土壤環(huán)境的污染狀況。Hooper等發(fā)現(xiàn)，當蚯蚓暴露在鋅污染環(huán)境時，其免疫功能會受到抑制，并下降20%[50]。李帥章等通過人工土壤法對赤子愛勝蚓進行銅與砷染毒，發(fā)現(xiàn)黏附細胞吞噬活性與細胞吞飲作用受重金屬的影響而減弱，這說明重金屬對蚯蚓中與免疫相關(guān)的體腔細胞影響較大[51]。國內(nèi)外關(guān)于蚯蚓免疫功能的研究尚不多，將蚯蚓的免疫系統(tǒng)作為污染土壤風險評價的指標還有待研究。

5展望

在土壤生態(tài)毒理研究中，合適的生物標志物可作為環(huán)境評價的標準，為土壤污染物和毒理效應(yīng)之間建立發(fā)生機制，而蚯蚓作為食物鏈底端的生物量最大的土壤動物類群，目前被認為是土壤污染的理想指示生物[52-54]。綜上所述，蚯蚓應(yīng)用于土壤污染的監(jiān)測具有一定的前景。近年來，國內(nèi)外運用蚯蚓監(jiān)測土壤污染已有長足的發(fā)展，但是研究的深度和廣度并不足。首先，通過實驗室和田間試驗可以較為準確地得出外源污染物對蚯蚓生理、生化以及個體和種群的影響程度，但是仍然需要不斷篩選出敏感的生物標志物，由此建立生物標志物的響應(yīng)情況與土壤污染下蚯蚓個體、種群變化之間的關(guān)系，從而對土壤生態(tài)污染程度進行研究、預(yù)警和治理。其次，除了有大量新型污染物進入土壤生態(tài)系統(tǒng)之外，土壤中存在著多種現(xiàn)實問題，如復(fù)合污染不斷增加、污染物累積的動態(tài)過程，污染物的遷移等。目前的研究中，關(guān)注熱點有從單一污染物轉(zhuǎn)向復(fù)合污染物，靜態(tài)轉(zhuǎn)向動態(tài)研究的趨勢，使蚯蚓生態(tài)毒理研究不斷得到完善。此外，在復(fù)雜的土壤生態(tài)系統(tǒng)中，有許多與污染無關(guān)的變量能夠?qū)Σ煌拿赶到y(tǒng)產(chǎn)生影響從而干擾生物標記物的反應(yīng)，而最有效的生態(tài)毒理學(xué)指標也難以定量土壤環(huán)境中可能存在的復(fù)雜干擾因子[55]，目前還缺乏統(tǒng)一的、可比較的試驗方法。同時，蚯蚓對污染物在生化上的響應(yīng)復(fù)雜，具體機制尚未明確。因此，對生物標記物中不確定的混淆因子之間的交互作用進行估算，并逐步轉(zhuǎn)向定量分析，完善機制的解釋等方面也是蚯蚓生態(tài)毒理學(xué)研究的重要環(huán)節(jié)。

隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，細胞生物學(xué)和分子生物學(xué)迅速發(fā)展，推動了分子水平上的蚯蚓生態(tài)毒理學(xué)的研究。如DNA損傷的檢測手段主要是通過彗星實驗和DNA-加合物分析，這些試驗方法都存在費時和成本高的缺點，因此今后應(yīng)進一步采用生理生態(tài)學(xué)、生物化學(xué)、分子生態(tài)學(xué)、生物地理學(xué)等方法，注重學(xué)科交叉，并依靠高效節(jié)約的新技術(shù)更深入地分析污染物對蚯蚓的作用，增加蚯蚓作為污染指示生物的可靠性。

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