油菜秸稈60Co–γ輻照降解產(chǎn)物分析

張春艷，譚興和*，熊興耀，蘇小軍,2，李清明，王克勤

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙 410128；2.湖南省作物種質(zhì)創(chuàng)新與資源利用重點實驗室，湖南 長沙 410128；3.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜與花卉研究所，北京 100081；4.湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院核農(nóng)學(xué)與航天育種研究院，湖南 長沙 410125)

油菜秸稈60Co–γ輻照降解產(chǎn)物分析

張春艷1，譚興和1*，熊興耀2,3，蘇小軍1,2，李清明1，王克勤4

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙 410128；2.湖南省作物種質(zhì)創(chuàng)新與資源利用重點實驗室，湖南 長沙 410128；3.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜與花卉研究所，北京 100081；4.湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院核農(nóng)學(xué)與航天育種研究院，湖南 長沙 410125)

以油菜秸稈為材料，采用60Co–γ輻照，設(shè)6個輻照劑量處理，分別為 0(CK)、400、600、800、1 000、1 200 kGy，考察不同劑量輻照處理后油菜秸稈3大主要組分降解率的變化，并采用氣質(zhì)聯(lián)用法對輻照后全產(chǎn)物進(jìn)行分析。結(jié)果表明：隨著劑量的增大，纖維素、半纖維素和木質(zhì)素降解率都有不同程度的提高；當(dāng)輻照劑量為1 200 kGy時，纖維素、半纖維素和木質(zhì)素降解率分別達(dá)到69.06%、42.57%和4.99%；未輻照油菜秸稈水提液乙酸乙酯萃取物中分別檢測到脂肪酸類物質(zhì)22種、芳香類物質(zhì)5種，未檢測到呋喃類物質(zhì)，而從不同劑量輻照后樣品中分別檢測到脂肪酸類物質(zhì)25種、芳香類物質(zhì)17種，呋喃類物質(zhì)5種，且各類產(chǎn)物的種類與含量變化呈現(xiàn)出不同規(guī)律。

油菜秸稈；60Co–γ輻照；降解產(chǎn)物

在眾多的可再生能源中，木質(zhì)纖維素原料等生物質(zhì)能源因其具有來源豐富、價格低廉等獨特優(yōu)勢而成為新能源領(lǐng)域的研究熱點之一[1–2]。由于秸稈等木質(zhì)纖維素原料的結(jié)構(gòu)致密復(fù)雜，因此如何采取有效的預(yù)處理方法，改變其結(jié)構(gòu)，以增加其反應(yīng)性能[3]是當(dāng)前亟待解決的問題。目前，已有很多方法被應(yīng)用于木質(zhì)纖維素原料的預(yù)處理，如酸堿法，蒸氣爆破法、高壓液態(tài)水法、離子液體法等，這些方法都或多或少有一定的局限性，例如成本居高不下或者會產(chǎn)生對后續(xù)酶解發(fā)酵有抑制作用的副產(chǎn)物等[4]。而輻照預(yù)處理，可使木質(zhì)纖維素原料分子內(nèi)部產(chǎn)生自由基，這些自由基又可以通過一定的鏈剪切或交聯(lián)反應(yīng)誘發(fā)木質(zhì)纖維素的降解[5]。

中國每年有大量的油菜秸稈被廢棄，造成極大的資源浪費，還會對環(huán)境造成污染。筆者研究經(jīng)不同劑量輻照后油菜秸稈中的纖維素、半纖維素和木質(zhì)素的降解情況，并采用氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)檢測輻照后降解產(chǎn)物的種類與含量，以期為木質(zhì)纖維素原料的輻照降解機理提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料

油菜秸稈采自湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)油料作物研究所試驗基地。

儀器：Agilent 7200 QTOF氣相色譜–質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國安捷倫公司生產(chǎn)；FIWE3/6纖維素測定儀，北京盈盛恒泰科技有限責(zé)任公司生產(chǎn)；XS型中草藥粉碎機，廣州華凱機電設(shè)備有限公司生產(chǎn)。

試劑：吡啶、N,O–雙三甲基硅三氟乙酰胺等試劑均為分析純，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1 油菜秸稈輻照預(yù)處理

油菜秸稈采回后清洗，烘干至恒重(60 ℃，5 d)，粉碎過孔徑為0.425 mm的篩。取一定量的油菜秸稈粉末裝入1 000 mL廣口瓶中，在自然室溫條件下照射。共設(shè)6個輻照劑量處理，分別為 0(CK)、400、600、800、1 000、1 200 kGy，劑量率為2.0 kGy/h。輻照處理在湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院核農(nóng)學(xué)與航天育種研究所進(jìn)行。輻射鈷源強度為9.99×1015Bq。處理后的樣品在自然室溫條件下貯藏，備用。

1.2.2 油菜秸稈基本成分分析

水分測定參照GB 5009.3—2010；灰分測定參照GB 5009.4—2010；纖維素含量測定采用硝酸乙醇法[6]；綜纖維素含量測定參照GB/T 2677.10—1995，木質(zhì)素含量的測定參照GB/T 2677.8—94。半纖維素含量為綜纖維素含量減去纖維素含量。纖維素、半纖維素和木質(zhì)素降解率分別為經(jīng)過輻照處理后被降解掉的纖維素、半纖維素和木質(zhì)素含量與未經(jīng)處理的原料中纖維素、半纖維素和木質(zhì)素含量的百分比。

1.2.3 氣質(zhì)聯(lián)用樣品前處理及條件

樣品前處理參照文獻(xiàn)[7]的方法進(jìn)行：分別稱取一定量經(jīng)不同劑量輻照處理后的油菜秸稈樣品，放入150 mL 三角瓶中，按固(質(zhì)量，g)液(體積，mL)比1∶10加入蒸餾水，沸水浴處理30 min，收集濾液并用乙酸乙酯萃取3次；將收集的有機相混合后用飽和氯化鈉溶液洗滌，加入無水硫酸鎂脫水，后置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮至干物質(zhì)；取500 μL濃縮后產(chǎn)物用少許乙酸乙酯溶解，加入100 μL吡啶和400 μL N,O–雙三甲基硅三氟乙酰胺(BSTFA)，充分混勻，放置于70 ℃恒溫干燥箱中反應(yīng)30 min，衍生化后的產(chǎn)物即可用于氣質(zhì)聯(lián)用分析。

氣質(zhì)聯(lián)用條件：DB–5彈性石英毛細(xì)管色譜柱，進(jìn)樣量1 μL，進(jìn)樣口溫度為250 ℃，載氣為1 mL/min氦氣；升溫程序為初始溫度50 ℃，保持2 min，以5℃/ min 升至150 ℃，保持2 min，然后以5 ℃/ min升至250 ℃，保持20 min。質(zhì)譜采用250 ℃ EI離子源，掃描范圍(m/z)50～500。

1.3 數(shù)據(jù)處理

產(chǎn)物的定性分析以標(biāo)準(zhǔn)化合物譜庫檢索為依據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同劑量輻照處理對油菜秸稈主要組分的影響

測得油菜秸稈中纖維素、半纖維素和木質(zhì)素含量分別為41.37%、23.63%和13.03%，灰分為8.75%，水分為8%，表明油菜秸稈是典型的木質(zhì)纖維素原料。

經(jīng)不同劑量輻照后油菜秸稈纖維素、半纖維素和木質(zhì)素降解率變化如圖1所示。輻照后油菜秸稈中的纖維素、半纖維素和木質(zhì)素發(fā)生不同程度的降解，并且隨著輻照劑量的增加，降解率增大。半纖維素對輻照較為敏感，當(dāng)劑量從400 kGy增大到1 200 kGy時，降解率相應(yīng)的從9.73%增大到69.06%；纖維素敏感性稍低，降解率從15.47%(400 kGy)增大到42.57%(1 200 kGy)；木質(zhì)素對輻照最不敏感，僅由3.91%(400 kGy)增大到4.99%(1 200 kGy)。

圖1 不同劑量輻照后油菜秸稈主要組分的降解率Fig.1 The main component degradation rate of rape straw after irradiation with different doses

2.2 油菜秸稈經(jīng)輻照后的降解副產(chǎn)物分析

2.2.1 輻照后油菜秸稈乙酸乙酯萃取液中脂肪酸類化合物分析

經(jīng)不同劑量輻照處理后油菜秸稈乙酸乙酯萃取液中含有大量的脂肪酸類化合物，結(jié)果見表1。從各輻照處理樣品中共鑒定出32種脂肪酸化合物。這些物質(zhì)主要來源于提取物、木質(zhì)纖維素的降解及某些降解產(chǎn)物如糖類化合物的進(jìn)一步降解。一些長鏈脂肪酸如十四酸、壬酸等可能來源于纖維素的降解或者未改性的提取物。短鏈脂肪酸如2–丙烯酸、3–丙烯酸等可能來源于提取物或者碳水化合物的降解。

表1 不同劑量輻照處理的油菜秸稈乙酸乙酯萃取液中的脂肪酸類化合物及其含量Table 1 Aliphatic acids in ethyl acetate extractives of untreated and irradiation–pretreated rapeseed straw

在不同劑量輻照處理下，發(fā)生的反應(yīng)不盡相同，因此脂肪酸類物質(zhì)的種類和含量差別也較大。在所列出的脂肪酸類化合物中，有辛二酸、2–戊烯酸、3–丙烯酸、軟脂酸、乙二酸、辛酸、肉桂酸等7種僅在未輻照的樣品中檢測到，而輻照處理的樣品中均未檢測到，表明經(jīng)輻照后，這些物質(zhì)全部發(fā)生了反應(yīng)，轉(zhuǎn)變成為其他物質(zhì)。這7種物質(zhì)中除辛二酸、3–丙烯酸含量稍高，其他幾種物質(zhì)含量都很低。從未輻照樣品中一共檢測到脂肪酸類物質(zhì) 22種，總相對含量為19.99%，當(dāng)輻照劑量在400～1 000 kGy時，脂肪酸種類與含量變化不大，數(shù)量保持在18～22種，含量為14.99%～19.52%，而當(dāng)輻照劑量達(dá)到1 200 kGy時，脂肪酸種類減少至14種，含量則明顯降低，僅為6.23%。表明在這一輻照條件下，大部分的脂肪酸類物質(zhì)都發(fā)生了進(jìn)一步的反應(yīng)，降解明顯。

在輻照前后樣品中都可以檢測到的有丙二酸、正己酸、乙酸、戊二酸、己二酸、(Z,Z)–9,12–十八烷二烯酸、壬二酸、DL–蘋果酸等8種脂肪酸類，其中DL–蘋果酸在未輻照樣品中含量為14%，隨著輻照劑量的增加，含量減少至 1.92%，降解率達(dá)86%。丙二酸也呈同樣的變化趨勢，降解率達(dá)95%。正己酸含量無明顯變化。乙酸和戊二酸變化趨勢相似，分別在600 kGy和800 kGy時含量達(dá)到最高值，隨后又減少，可能在劑量增大的過程中，發(fā)生了某種反應(yīng)生成乙酸和戊二酸，而當(dāng)劑量進(jìn)一步增大時，這2種物質(zhì)又發(fā)生反應(yīng)，轉(zhuǎn)變成為其他物質(zhì)，使其含量相應(yīng)減少。而3–羥基丁酸、反–2–戊烯酸、(R*,S*)–3,4–二羥丁酸和反式–3–己烯二酸等性質(zhì)不穩(wěn)定，只是反應(yīng)過程中的中間產(chǎn)物，即輻照達(dá)到一定劑量時產(chǎn)生，隨著輻照劑量增加又發(fā)生反應(yīng)而消失。而2–羥基異己酸只有當(dāng)輻照劑量達(dá)到600 kGy時才產(chǎn)生，并且隨著劑量增大，含量也逐漸增大。總之，降解過程中所發(fā)生的反應(yīng)復(fù)雜，脂肪酸類物質(zhì)的種類、含量和變化趨勢也相當(dāng)復(fù)雜。

表2 不同劑量輻照處理的油菜秸稈乙酸乙酯萃取物中的芳香類化合物及其含量Table 2 Aromatic compounds in ethyl acetate extractives of untreated and irradiation–pretreated rapeseed straw

2.2.2 輻照對油菜秸稈水提液中芳香類化合物的影響

經(jīng)不同劑量輻照處理后的油菜秸稈乙酸乙酯萃取液中，共檢測到17種芳香類化合物，詳見表2。其中酸類化合物6種，酮類化合物2種，烷基類化合物1種，醇類化合物2種，醛類化合物6種。未輻照樣品中僅檢測出5種芳香類物質(zhì)，并且總含量僅為0.75%。輻照后樣品中的芳香類物質(zhì)種類與含量明顯增加，種類保持在 10～15種，總含量保持在1.65%～8.97%，其中1 000 kGy輻照樣品中的種類最多，達(dá)到15種；400 kGy輻照樣品中總含量最少，僅為1.65%；800 kGy輻照樣品中總含量最高，為8.97%。這些物質(zhì)主要來源于木質(zhì)纖維素的降解或者其他芳香類提取物的降解和分解。

2.2.3 輻照對油菜秸稈水提液中呋喃類化合物的影響

從輻照處理后的油菜秸稈乙酸乙酯萃取液中共檢測到5種呋喃類化合物，詳見表3。在CK、400 kGy和 600 kGy輻照樣品中均未檢出呋喃類化合物，只有當(dāng)劑量達(dá)到800 kGy以上時才有呋喃類物質(zhì)產(chǎn)生，且不同劑量輻照時所產(chǎn)生的呋喃類物質(zhì)的種類差異較大。在輻照條件下，纖維素可以直接降解為葡萄糖后發(fā)生分子內(nèi)脫水，閉環(huán)生成5–羥甲基糠醛，羥甲基進(jìn)一步斷裂后可生成糠醛和甲醛。但在GC–MS分析中并未檢測到糠醛和甲醛，可能是由于糠醛上醛基被氧化生成了呋喃酮或呋喃酸類物質(zhì)，而甲醛則發(fā)生其他反應(yīng)生成了苯甲醛類物質(zhì)；其次，半纖維素的組分木聚糖也可以發(fā)生分子內(nèi)脫水環(huán)化生成糠醛，糠醛進(jìn)一步生成呋喃類和呋喃酮類物質(zhì)。

表3 不同劑量輻照處理的油菜秸稈乙酸乙酯萃取物中的呋喃類化合物及其含量Table 3 Furan compounds in ethyl acetate extractives of untreated and irradiation–pretreated rapeseed straw

3 結(jié)論與討論

在輻照條件下，纖維素會發(fā)生鏈剪切和交聯(lián)反應(yīng)，當(dāng)輻照劑量較高時，降解作用占主導(dǎo)，使得糖苷鍵更易于斷裂，木質(zhì)纖維素之間的交聯(lián)結(jié)構(gòu)被破壞，部分纖維素、半纖維素被直接降解[8–10]。經(jīng)一定劑量輻照后，木質(zhì)纖維素分子內(nèi)形成自由基，而自由基又通過一定的反應(yīng)誘發(fā)木質(zhì)纖維素的降解?？赡苡捎诮M成結(jié)構(gòu)的差異，三大組分對輻照敏感性有差異，木質(zhì)素較纖維素受輻照的敏感性要小得多，但隨著劑量的增加，木質(zhì)素仍會受到一定程度的降解和分解[9,11]。

利用氣質(zhì)聯(lián)用(GC–MS)技術(shù)從未經(jīng)輻照的油菜秸稈乙酸乙酯萃取物中分別檢測到脂肪酸類物質(zhì)22種、芳香類物質(zhì)5種，未檢測到呋喃類物質(zhì)，而從輻照處理后的樣品中分別檢測到脂肪酸類物質(zhì)25種、芳香類物質(zhì)17種，呋喃類物質(zhì)5種，并且經(jīng)不同劑量輻照后，產(chǎn)物的種類與含量變化呈現(xiàn)出不同規(guī)律。Chen等[12]采用HPLC法分析稀酸水解玉米秸稈產(chǎn)物，除了檢測到甲酸、乙酸和乙酰丙酸外，還得到 10種脂肪酸類化合物。Luo等[13]利用乙酸乙酯萃取楊樹稀酸水解液，得到 17種脂肪酸類化合物，其變化趨勢也各有差異。

經(jīng)不同劑量輻照處理后，油菜秸稈中的纖維素、半纖維素和木質(zhì)素與提取物發(fā)生降解，降解產(chǎn)物又可以進(jìn)一步發(fā)生分解、縮聚等反應(yīng)而降解為一系列結(jié)構(gòu)復(fù)雜的其他物質(zhì)，包括一些含羥基、甲氧基、甲基、乙基等官能團(tuán)的酮類、酸類、酚類、芳香類、醛類化合物等，如乙酸主要由半纖維素乙酰基的降解而來，木質(zhì)素主要通過降解作用，或者降解產(chǎn)物進(jìn)一步的縮聚作用生成酚類化合物等[14]，這些降解產(chǎn)物的存在不利于后續(xù)酶解和乙醇發(fā)酵過程。Zaldivar等[15–16]研究了纖維素、半纖維素降解產(chǎn)物，如醛類、有機酸類等物質(zhì)對發(fā)酵產(chǎn)乙醇的基因工程菌Escherichia coli LY01的生長情況和發(fā)酵效果，發(fā)現(xiàn)由于不同的醛類和有機酸類疏水性有差異，對酵母的生長情況和發(fā)酵效果的抑制作用也不同，因此，開展對木質(zhì)纖維素原料輻照降解產(chǎn)物的定性定量分析，可為后續(xù)的水解液脫毒工藝提供一定的參考依據(jù)。

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責(zé)任編輯：尹小紅

英文編輯：梁 和

Analysis of degradation products of rapeseed straw irradiated with60Co–γ

ZHANG Chunyan1, TAN Xinghe1*, XIONG Xingyao2,3, SU Xiaojun1,2, LI Qingming1, WANG Keqin4
(1.College of Food Science and Technology, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China; 2.Key Laboratory of Corp Germplasm Innovation and Resource Utilization of Hunan Province, Changsha 410128, China; 3.The Institute of Vegetables and Flowers Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China; 4.Hunan Academy of Agricultural Sciences, Institute of nuclear and space breeding, Changsha 410125, China)

In this experiment, rapeseed straw was used as material, six irradiation doses of60Co–γ(0, 400, 600, 800, 1 000, 1 200 kGy) were designed to analyse the degradation products of cellulose, hemicellulose and lignin by GC–MS.The results showed that the degradation rates of cellulose, hemicellulose and lignin were all improved in different degrees with the increasing of dose.With the dose of 1 200 kGy, the degradation of cellulose, hemicellulose and lignin was 69.06%, 42.57% and 4.99%, respectively.22 fatty acids, 5 aromatics and no furans were detected from the water extracts of untreated straws, while 25 fatty acids,17 aromatics and 5 furans were detected from the water extracts of treated straws.The variety and content of the products showed different with different dose treatment.

rapeseed straw; irradiation with60Co–γ ; degradation products

S565.4

：A

：1007-1032(2017)01-0092-06

2016–05–04

2016–12–12

國家“863計劃”項目(2012AA101804 )；湖南省科學(xué)技術(shù)廳項目(2015NK3009)

張春艷(1981—)，女，湖南瀏陽人，博士，高級實驗師，主要從事生物質(zhì)能源研究，zhangchy95@163.com；*通信作者，譚興和，教授，主要從事生物質(zhì)能源研究，xinghetan@163.com