磁性多壁碳納米管固相萃取/高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定蜂蜜中多組分獸藥殘留

徐瀟穎，羅金文，陳萬勤，趙超群，劉 柱

(浙江省食品藥品檢驗研究院，浙江 杭州 310052)

磁性多壁碳納米管固相萃取/高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定蜂蜜中多組分獸藥殘留

徐瀟穎，羅金文，陳萬勤，趙超群，劉 柱*

(浙江省食品藥品檢驗研究院，浙江 杭州 310052)

建立了以磁性多壁碳納米管為吸附劑的分散固相萃取/高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法，對蜂蜜中3大類44種獸藥殘留進行測定。樣品經(jīng)pH 4.0的Na2EDTA-Mcllvaine緩沖液提取，加入自制磁性多壁碳納米管吸附目標物。目標物經(jīng)10%氨水-甲醇洗脫后，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜MRM模式進行定性定量分析。44種藥物在1～40 ng/mL濃度范圍內(nèi)線性關系良好，相關系數(shù)均大于0.99；在3個不同濃度添加水平下，回收率為78.0%～105.1%，相對標準偏差(RSD)為1.2%～8.9%，檢出限為0.2～2.0 μg/kg。結果表明，該方法簡單方便，易于操作，為蜂蜜中磺胺類、喹諾酮類以及硝基咪唑類獸藥殘留的測定提供了新途徑。

磁性多壁碳納米管；磺胺；硝基咪唑；喹諾酮；蜂蜜

磺胺類、喹諾酮類、硝基咪唑類藥物均為抗菌藥，在養(yǎng)殖業(yè)中應用廣泛[1]。在目前蜂養(yǎng)殖業(yè)中，蜜蜂易得細菌性疾病，蜂農(nóng)為預防蜂病的發(fā)生，往往會給蜜蜂喂食抗菌類藥物，致使蜂蜜中獸藥殘留問題屢禁不止。2002年，歐盟以抗生素殘留超標為由，禁止中國蜂蜜出口，雖然隨后解除了該項禁止，但對蜂蜜中獸藥殘留的檢測工作仍持續(xù)開展。由于蜂蜜中糖含量較高，直接測定痕量的獸藥殘留存在一定困難，檢測通常以固相萃取小柱凈化來減少雜質(zhì)干擾。目前市場上商品化的固相萃取小柱(MWCNTs)是一種具有高穩(wěn)定性和強吸附性能的納米材料，比表面積大，一般由2～50層石墨片組成，直徑在幾到幾十納米之間，長度可達幾十甚至上百微米[2-6]，對有機物、金屬離子和有機金屬化合物等具有較強的富集能力[7]。近年來，MWCNTs因具有類似C18的吸附性能，被作為一種新型的固相萃取劑，廣泛用于農(nóng)藥殘留[8-16]和獸藥殘留[17-18]的檢測。對磁性顆粒進行表面修飾，不僅能高效地捕集樣品基質(zhì)中的痕量目標分析物，而且很好地克服了傳統(tǒng)固相萃取小柱在樣品處理過程中易堵塞和操作繁瑣等問題，使分離和富集過程變得簡捷、快速和高效。Kumar等[19]將其用于氧氟沙星的富集分析研究，Zhao等[20]在食用油中多環(huán)芳烴的分析檢測也使用了磁性MWCNTs。本文利用實驗室研制的磁性MWCNTs凈化蜂蜜樣品，并對凈化過程中的主要影響因素進行優(yōu)化，采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術同時測定了蜂蜜中3大類44種獸藥殘留。該方法簡單方便，易于操作，從而為蜂蜜中磺胺類、喹諾酮類以及硝基咪唑類獸藥殘留的測定提供了支持。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 6460液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀；Milli-Q超純水器(美國Millipore公司);氮氣吹干儀(Biotage公司);渦旋混合器(上海琪特公司);酸度計(Mettler Toledo公司)。

甲醇、乙腈(色譜純，德國Merck公司);甲酸(色譜純，美國Fluka公司);乙二胺四乙酸二鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、氨水、氯化鐵、氯化亞鐵、濃硝酸(分析純，國藥集團化學試劑有限公司);MWCNTs純度>97%，直徑20～40 nm，長度>5 μm(深圳市納米港有限公司)。

實驗所用44種獸藥的標準物質(zhì)均購自Dr.Ehrenstorfer GmbH。

1.2 標準溶液配制

分別準確稱取10 mg上述標準品置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容，配成濃度為1 mg/mL的儲備液，密封儲存于-18 ℃冰箱中，分別移取20 μL 1 mg/mL的儲備液于10 mL容量瓶中，用甲醇定容后配制成2 μg/mL的混合標準溶液。使用前稀釋成一系列濃度的標準溶液。

1.3 磁性多壁碳納米管的制備

1.3.1 MWCNTs羧化稱取1.5 g多壁碳納米管粉末置于250 mL單口燒瓶中，加入150 mL濃硝酸，超聲振蕩1 h，移入恒溫水浴槽中，于60 ℃回流12 h，冷卻后，除去上層酸液，反復水洗至中性，于100 ℃下烘干4 h。

1.3.2 磁 化稱取0.36 g羧化MWCNTs粉末置于250 mL雙口燒瓶中，加入225 mL水，超聲20 min后加入0.18 g無水氯化鐵，移入恒溫水浴槽中于60 ℃在氮氣保護下振搖30 min，加入0.45 g氯化亞鐵后繼續(xù)振搖30 min，加入150 mL 25%氨水振搖2 h后，取出，冷卻，除去上層液體，水洗至中性，放入電熱鼓風干燥箱在50 ℃下烘干24 h。MWCNTs磁化后可被磁鐵吸附，未磁化和磁化后多壁碳納米管的電鏡照片見圖1。

1.4 樣品前處理方法

稱取蜂蜜樣品2 g于250 mL燒杯中，加入100 mg磁性MWCNTs，加200 mL pH 4.0的Na2EDTA-Mcllvaine溶液，超聲5 min，使磁性MWCNTs均勻分布于提取液中，提取60 min后，用磁鐵對磁性MWCNTs進行吸附，用吸管吸取清水對磁性MWCNTs進行淋洗后去除洗液，加入10 mL 10%氨水-甲醇后超聲5 min，收集洗脫液，重復洗脫1次，合并兩次洗脫液，于40 ℃下氮吹近干，用初始比例流動相定容至1.0 mL，過0.22 μm有機濾膜，待測。

1.5 色譜和質(zhì)譜條件

1.5.1 色譜條件色譜柱：Thermo C18(150 mm×2.1 mm，2.6 μm)或相同效能色譜柱；流速：0.2 mL/min；柱溫：35 ℃；進樣量：5 μL；流動相為乙腈(A)-0.1%甲酸水溶液(B)，梯度洗脫程序：0～4 min，90% B；4～8 min，90%～65% B；8～12 min，65%～55% B；12～14 min，55%～70% B；14～16 min,70%～90% B；16～18 min，90% B。

1.5.2 質(zhì)譜條件電噴霧離子源(ESI);正離子掃描模式；多反應監(jiān)測(MRM)模式；源電壓4 kV；毛細管溫度400 ℃；鞘氣流速12 L/min；獸藥化合物的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 MRM監(jiān)測模式下44種藥物的質(zhì)譜條件

*quantitation ion

2 結果與討論

2.1 提取溶液的優(yōu)化

蜂蜜樣品中含有大量糖分，通常用水稀釋后進行提取，在對蜂蜜樣品進行加水稀釋后的磁性吸附實驗中，易出現(xiàn)喹諾酮類藥物回收率低。主要是由于不同類抗生素藥物的pKa值范圍較寬的緣故。實驗分別采用pH 4.0的Na2EDTA-Mcllvaine溶液、pH 6.0和pH 8.0的磷酸鹽緩沖液以及0.1 mol/L氫氧化鈉溶液(pH 12.0)作為提取溶液進行試驗。結果表明，使用酸性提取液的提取效果優(yōu)于堿性提取液，其中經(jīng)pH 4.0的Na2EDTA-Mcllvaine溶液稀釋后進行磁性碳納米管吸附實驗得到的回收率較高，且基質(zhì)干擾較小，故選擇其作為提取溶液。

2.2 磁性MWCNTs加入量的優(yōu)化

在相同樣品提取液中，磁性多壁碳納米管的加入量對樣品中多組分獸藥殘留的回收率也存在直接影響，分別稱取20，60，100，150 mg的MWCNTs加入100 mL樣品提取液中，當加標量為20 μg/kg時，磺胺類、喹諾酮類、硝基咪唑類藥物的回收率隨著MWCNTs加入量的增加而增加，當加入量大于100 mg時回收率變化趨于平緩。因此，當樣品稱取量為2 g時，磁性MWCNTs的最佳加入量為100 mg。

2.3 洗脫條件的優(yōu)化

分別采用甲醇、5%甲酸-甲醇及5%氨水-甲醇作為洗脫液，對吸附目標物的磁性MWCNTs進行洗脫。結果顯示，目標物在堿性條件下的洗脫效果優(yōu)于甲醇和5%甲酸-甲醇的洗脫效果。單獨采用甲醇作為洗脫溶劑時，喹諾酮類藥物的回收率偏低，主要是因為酸性提取液使磺胺類、喹諾酮類及硝基咪唑類藥物不同程度結合了質(zhì)子，在甲醇中添加氨水能中和目標物結合的質(zhì)子，使目標物呈中性，更利于洗脫，提高其回收率。該現(xiàn)象與文獻[21-22]的研究結果相一致。在堿性洗脫條件下，進一步對不同體積分數(shù)的氨水-甲醇(5%，10%，15%)進行比較，結果表明隨著洗脫液中氨水比例增大，洗脫后的樣液顏色變深，雜質(zhì)干擾變大，當洗脫液中氨水比例由10%升至15%時，3類藥物的回收率增加不明顯。因此，選擇10 mL 10%氨水-甲醇分兩次進行洗脫。

2.4 色譜條件的優(yōu)化

獸藥多殘留檢測依賴于色譜柱的選擇，不同色譜柱對不同類別獸藥的分離效果存在一定差異，實驗分別考察了單獨測定磺胺類、喹諾酮類、硝基咪唑類獸藥殘留時常用的Thermo C18(150 mm×2.1 mm，2.6 μm)，Waters Atlantis?T3(150 mm×2.1 mm，5.0 μm)，ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)的分離效果。結果顯示，Thermo C18(150 mm×2.1 mm，2.6 μm)在MRM模式下對44種組分可實現(xiàn)較好的分離，且各色譜峰峰形較好，雜質(zhì)干擾較小。因此，本實驗選擇Thermo C18(150 mm×2.1 mm，2.6 μm)對待測物進行分離。

對比了甲醇和乙腈作為流動相的有機相時的分離效果，發(fā)現(xiàn)乙腈作為強極性洗脫溶劑，可提高待分離組分的離子化效率，而在水相中加入0.1%甲酸時，各化合物在ESI+模式下的離子化效果更好，峰形有所改善，靈敏度也相應提高，因此本實驗選取乙腈及0.1%甲酸水作為流動相。分四通道對44種化合物的MRM色譜圖進行提取，結果如圖2所示。

2.5 線性關系、檢出限與加標回收率

采用空白基質(zhì)溶液配制系列濃度的標準溶液，以各目標物的峰面積(Y)為縱坐標，質(zhì)量濃度(X，ng/mL)為橫坐標進行線性擬合。結果表明，3類藥物均在1～40 ng/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關系，相關系數(shù)(r2)大于0.99。對陰性蜂蜜樣品進行加標實驗，添加5，10，30 μg/kg 3個濃度水平的混合標準溶液，每個濃度設4個平行，按“1.4”方法進行樣品前處理，回收率、相對標準偏差及檢出限見表2。20種磺胺類、17種喹諾酮類及7種硝基咪唑類藥物的回收率分別為83.6%～105.1%,78.0%～101.1%及87.7%～99.5%；檢出限為0.2～2.0 μg/kg。磁化后的碳納米管，與曹慧等[21]采用多壁碳納米管進行蜂蜜中獸殘測定，所得的磺胺類、喹諾酮類及硝基咪唑類藥物回收率相符，說明磁化處理對碳納米管的富集作用無影響。侯建波等[23]采用HLB固相萃取柱進行前處理凈化后，測得磺胺類、喹諾酮類及硝基咪唑類藥物的回收率分別為52.5%～114.0%,62.8%～110.0%及67.5%～111.0%，說明本文采用磁性碳納米管對這3類藥物的回收率可達到HLB固相萃取柱凈化處理的回收水平。

表2 44種獸藥的回收率測定結果及方法檢出限(n=12)

2.6 實際蜂蜜樣品的分析

應用本方法對96批蜂蜜樣品進行測定，其中2批蜂蜜樣品中分別檢出5.6 μg/kg環(huán)丙沙星和7.0 μg/kg諾氟沙星。與各藥物的現(xiàn)行國標方法GB/T 23412-2009的測定結果(環(huán)丙沙星和諾氟沙星含量分別為6.7,6.5 μg/kg)進行比對，未發(fā)現(xiàn)假陰性情況。

3 結 論

與傳統(tǒng)的前處理過程中采用固相萃取小柱凈化相比，磁性MWCNTs在進行樣品前處理過程中可均勻分布于提取液中，對目標物的吸附更徹底，待吸附完成后，利用磁性吸引，使吸附目標物的磁性MWCNTs快速被收集，磁化后的MWCNTs將磁性分離技術和固相吸附劑結合，有效解決了吸附劑難回收問題，大大簡化了前處理過程，達到了多類獸殘同時提取，且凈化效果理想，價格低。利用自制的磁性MWCNTs固相萃取材料測定蜂蜜中20種磺胺類、17種喹諾酮類及7種硝基咪唑類獸藥殘留，回收率為78.0%～105.1%，相對標準偏差為1.2%～8.9%。其中，磺胺類、喹諾酮類及硝基咪唑類的平均回收率分別為88.1%，88.2%，91.5%，與采用固相萃取柱進行前處理后測定的3類獸殘的回收率相當。實驗結果初步顯示出磁性MWCNTs在前處理凈化過程中的省時、節(jié)約、便捷等特點，這為蜂蜜中多組分獸藥殘留的測定提供了新方法。

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Determination of Veterinary Drugs Residues in Honey by High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry with Magnetic Multi-walled Carbon Nanotubes

XU Xiao-ying,LUO Jin-wen,CHEN Wan-qin,ZHAO Chao-qun,LIU Zhu*

(Zhejiang Institute for Food and Drug Control,Hangzhou 310052,China)

A method using magnetic multi-walled carbon nanotubes(mMWCNTs) as the absorbent followed by ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry was established for the determination of 44 veterinary drugs residues in honey.Analytes were extracted with Na2EDTA-Mcllvaine buffer solution(pH 4.0) before self-made mMWCNTs were added to absorb veterinary drugs.After extraction with mMWCNTs and followed by elution with 10% ammonia-methanol,target analytes were analyzed using multiple reaction monitoring(MRM) mode.The correlation coefficients of linear calibration curves were over 0.99 in the concentration range of 1-40 ng/mL.The recoveries of 44 analytes at three spiked concentrations ranged from 78.0% to 105.1%,with relative standard deviations(RSDs) of 1.2%-8.9%.The limits of detection(LODs,S/N≥3) were 0.2-2.0 μg/kg.With the advantages of simplicity,sensitivity and good precision, this method provides a new way for the determination of multi-veterinary drug residues in honey.

magnetic multi-walled carbon nanotubes;sulfonamide;nitroimidazole;quinolone;honey

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.01.010

2016-07-26；

2016-08-29

浙江省科技計劃項目(2015C37054)；浙江省科技廳重大項目(2014C02001)

*通訊作者：劉 柱，碩士，中級工程師，研究方向：食品安全與分析技術，Tel：0571-87180322，E-mail:zliu82@126.com

O657.63;TQ460.72

A

1004-4957(2017)01-0061-06