β-淀粉樣蛋白對(duì)幼鼠骨髓干細(xì)胞增殖、遷移和凋亡的影響

熱娜·阿布力孜 威力江·賽買提

(新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院小兒外二科，新疆 烏魯木齊 830054)

β-淀粉樣蛋白對(duì)幼鼠骨髓干細(xì)胞增殖、遷移和凋亡的影響

熱娜·阿布力孜 威力江·賽買提

(新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院小兒外二科，新疆 烏魯木齊 830054)

目的 探討β-淀粉樣蛋白(Aβ)對(duì)幼鼠骨髓干細(xì)胞增殖、遷移和凋亡的影響。方法 培養(yǎng)新生小鼠骨髓干細(xì)胞，將其分為對(duì)照組和Aβ處理組。利用BrdU方法檢測(cè)兩組陽性細(xì)胞數(shù)；檢測(cè)Aβ蛋白對(duì)幼鼠骨髓干細(xì)胞遷移的影響；流式細(xì)胞儀檢測(cè)對(duì)照組和Aβ處理組細(xì)胞凋亡情況；Western印跡檢測(cè)Cleaved-caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白的表達(dá)。結(jié)果 Aβ處理組的細(xì)胞生長速度明顯低于對(duì)照組，對(duì)照組BrdU陽性率顯著高于Aβ處理組(P<0.05)；Aβ處理組的細(xì)胞遷移距離及凋亡率顯著高于對(duì)照組(P<0.05，P<0.01)；經(jīng)Aβ蛋白處理的骨髓干細(xì)胞中Cleaved-caspase-3、Bax蛋白表達(dá)量明顯升高，而Bcl-2蛋白表達(dá)量與對(duì)照組相比明顯減少(P<0.01)。結(jié)論 Aβ能抑制骨髓干細(xì)胞的增殖，加速骨髓干細(xì)胞的遷移和凋亡。

骨髓干細(xì)胞；β-淀粉樣蛋白；增殖；凋亡；遷移

骨髓干細(xì)胞能分化成造血細(xì)胞，還能跨胚層分化成神經(jīng)元細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞等，還能用于缺血性心臟病、心肌梗死的治療〔1〕。β-淀粉樣蛋白(Aβ)在體內(nèi)以聚合體、單體和不溶性的纖維形式存在〔2〕，可溶性的Aβ寡聚體、三聚體和二聚體致病性更強(qiáng)〔3〕。有研究證實(shí)了Aβ與神經(jīng)干細(xì)胞的關(guān)系〔3,4〕，但目前關(guān)于Aβ對(duì)骨髓干細(xì)胞之間的關(guān)系還很少。本研究旨在探討Aβ對(duì)骨髓干細(xì)胞增殖、遷移、凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:取新生的小鼠，由新疆醫(yī)科大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室提供。主要試劑：DMEM/F12培養(yǎng)液、磷酸鹽緩沖液(PBS)、胰蛋白酶、胎牛血清(FBS)、山羊血清購自美國Gibco，Aβ、Annexin V-FITC/PI購自美國Sigma，小鼠抗BruU購自美國abcam，兔抗Bcl-2多克隆抗體、兔抗半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)多克隆抗體、兔抗Max多克隆抗體、鼠抗β-actin單克隆抗體購自美國Bioworld。主要儀器：倒置顯微鏡購自日本Olympus，細(xì)胞儀購自美國MG公司，流式細(xì)胞儀購自美國B-D公司，CO2培養(yǎng)箱購自日本SANYO公司。

1.2 骨髓干細(xì)胞培養(yǎng) 取新出生的小鼠，1 g/kg的烏拉坦腹腔注射麻醉，75%的乙醇消毒皮毛，無菌條件下取股骨和脛骨，剪開股骨和脛骨的兩端，用Hank液反復(fù)沖洗骨髓腔。以1.073/ml的Percoll分離液分離單個(gè)核細(xì)胞，以每瓶1×106接種于75 ml的培養(yǎng)瓶內(nèi)、37℃、5% CO2、飽和溫度的條件下培養(yǎng)細(xì)胞，4 d后換液，倒掉未貼壁細(xì)胞。培養(yǎng)7 d，當(dāng)細(xì)胞匯集達(dá)到80%～90%時(shí)，用1 ml 0.25%的胰蛋白酶(含0.02%EDTA)消化細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞之間的縫隙增大時(shí)，加入2 ml含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液終止消化，1 500 r/min離心3 min，取上清，加入4 ml DMEM培養(yǎng)液，1 500 r/min離心3 min，取上清，再次加入4 ml DMEM培養(yǎng)液，離心取上清。然后加入4 ml DMEM培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到85%時(shí)進(jìn)行傳代。

1.3 Aβ蛋白對(duì)骨髓干細(xì)胞增殖的影響 將細(xì)胞分為對(duì)照組、Aβ處理組。Aβ處理組加入10 μmol/L BrdU，對(duì)照組加入稀釋液，37℃ 5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)96 h后，加入0.012 5%胰蛋白酶并機(jī)械吹打使之成為單細(xì)胞，轉(zhuǎn)移到24孔板中培養(yǎng)2 h，細(xì)胞貼壁后，用抗BrdU染色鑒定。熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)單位面積呈BrdU陽性細(xì)胞數(shù)以及Hoechst33258標(biāo)記的總細(xì)胞數(shù)。

1.4 Aβ蛋白對(duì)骨髓干細(xì)胞遷移的影響 對(duì)照組和Aβ處理組在DMEM培養(yǎng)液種培養(yǎng)12 h，用胰酶消化并計(jì)數(shù)后，使用含0.2%BSA的DMEM培養(yǎng)液制成密度為3×105/ml的單細(xì)胞懸液，然后加入500 μl細(xì)胞懸液，處理組加入15 μmol/L Aβ蛋白，對(duì)照組加稀釋液，37℃ 5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，進(jìn)行染色和細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.5 Aβ蛋白對(duì)骨髓干細(xì)胞凋亡的影響 將兩組傳代后5 d的骨髓干細(xì)胞處理24 h。收集細(xì)胞，1 500 r/min離心5 min，棄上清，PBS調(diào)整待測(cè)細(xì)胞濃度為3×106個(gè)/ml。取1 ml細(xì)胞懸液至離心管中，4℃，1 000 r/min離心10 min，棄上清，加入1 ml冰預(yù)冷的PBS 重懸細(xì)胞，再次離心棄上清，PBS重復(fù)洗滌1次，加入上樣緩沖液200 μl重懸細(xì)胞，分別加入5 μl Annexin-V和PI，充分混勻后避光環(huán)境中室溫靜置20 min，加緩沖液300 μl，用流式細(xì)胞儀觀察細(xì)胞凋亡情況。

1.6 Western印跡檢測(cè)相關(guān)蛋白的活性 Aβ蛋白作用于骨髓干細(xì)胞96 h后，轉(zhuǎn)移到1.5 ml的Ep管中，根據(jù)細(xì)胞的數(shù)量，加入適宜量的裂解緩沖液，裂解30 min，12 000 r/min，4℃離心10 min，取上清。按照細(xì)胞總蛋白提取試劑盒、蛋白濃度測(cè)定試劑盒提取蛋白和測(cè)定蛋白濃度。在蛋白樣品與上樣緩沖液充分混合后，100℃煮沸變性5 min，每孔加50 μl樣品。通過Odyssey掃描系統(tǒng)分析蛋白表達(dá)量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 Aβ對(duì)細(xì)胞增殖的影響 Aβ處理組的細(xì)胞生長速度明顯低于對(duì)照組，對(duì)照組BrdU陽性率顯著高于Aβ處理組(P<0.01)。見圖1。

2.2 Aβ蛋白對(duì)細(xì)胞遷移的影響 對(duì)照組的細(xì)胞遷移距離〔(322.46±32.64)μm〕顯著低于Aβ處理組〔(433.28±29.48)μm，P<0.05〕。

2.3 Aβ蛋白對(duì)細(xì)胞凋亡的影響 Aβ處理組細(xì)胞的凋亡率(35.49%±2.49%)顯著高于對(duì)照組(9.79%±1.23%，P<0.01)。

2.4 Western印跡檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá) 經(jīng)Aβ蛋白處理的骨髓干細(xì)胞中酶切caspase-3、Bax蛋白表達(dá)量與對(duì)照組相比明顯升高，而Bcl-2蛋白表達(dá)量與對(duì)照組相比明顯減少(P<0.01)。見圖2。

圖1 兩組細(xì)胞生長速度比較

圖2 Aβ蛋白處理骨髓干細(xì)胞后相關(guān)蛋白表達(dá)量

3 討 論

Aβ是γ-分泌酶和β-分泌酶水解樣前體蛋白的產(chǎn)物〔5〕。研究表明，衰老的大腦中沉積或是過多的生成 Aβ，能造成 Aβ發(fā)生錯(cuò)誤的折疊，引發(fā)神經(jīng)元損傷，從而引起炎性反應(yīng)，最終引起神經(jīng)元細(xì)胞死亡，導(dǎo)致阿爾茨海默癥(AD)的產(chǎn)生〔6〕。研究表明，AD產(chǎn)生的原因可能與Aβ產(chǎn)生和清除的失衡有關(guān)〔7〕。

細(xì)胞增殖是生物體生命活動(dòng)的源泉，是生物發(fā)育、生長和繁殖的基礎(chǔ)〔8〕。研究顯示，一些中藥如地黃多糖、車前子多糖

對(duì)骨髓干細(xì)胞的增殖起到抑制作用〔9〕。本研究說明Aβ同樣抑制了骨髓干細(xì)胞的增殖。細(xì)胞的凋亡是機(jī)體維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、保持機(jī)體處于正常狀態(tài)的一種機(jī)制〔10〕。

促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2是Bcl-2家族兩個(gè)重要的蛋白。正常情況下Bax和Bcl-2蛋白以二聚體的形式存在，而且表達(dá)量相對(duì)穩(wěn)定。當(dāng)Bcl-2出現(xiàn)表達(dá)量減少，而Bax表達(dá)量增加時(shí)，兩者間的比率失衡，可引起細(xì)胞凋亡〔11〕。本研究結(jié)果顯示，可能就是Aβ引起兩者之間的比率失衡從而引起細(xì)胞凋亡。Caspase-3是Caspase家族中重要的一員，在細(xì)胞凋亡過程中是重要的效應(yīng)子，Caspase-3的活化可引發(fā)細(xì)胞凋亡〔12〕。本研究結(jié)果顯示。可能Aβ誘導(dǎo)骨髓干細(xì)胞的凋亡是通過Caspase依賴的途徑發(fā)揮作用?？傊珹β能抑制骨髓干細(xì)胞的增殖，加速骨髓干細(xì)胞的遷移和凋亡。

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〔2016-11-10修回〕

(編輯 袁左鳴/滕欣航)

威力江·賽買提(1975-)，男，碩士，副主任醫(yī)師，主要從事小兒泌尿系統(tǒng)疾病的診治研究。

熱娜·阿布力孜(1985-)，女，碩士，主要從事小兒泌尿系統(tǒng)疾病研究。

R363

A

1005-9202(2017)02-0314-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.02.023