唑來膦酸對血管內皮細胞CRL-1730的放射增敏效應

李文梅 游顏杰 苑 藝 劉佳佳 高鳳蘭

(漯河醫(yī)學高等?？茖W校藥學系，河南 漯河 462000)

唑來膦酸對血管內皮細胞CRL-1730的放射增敏效應

李文梅 游顏杰 苑 藝 劉佳佳 高鳳蘭

(漯河醫(yī)學高等?？茖W校藥學系，河南 漯河 462000)

目的 觀察唑來膦酸(ZOL)對血管內皮細胞CRL-1730放射敏感性的影響。方法 血管內皮細胞CRL-1730經(jīng)ZOL處理后，噻唑藍比色法檢測細胞活性，克隆形成實驗檢測細胞放射敏感性，小管形成實驗檢測內皮細胞血管形成能力，侵襲實驗檢測細胞轉移能力。結果 ZOL處理呈劑量依賴性抑制CRL-1730細胞增殖能力；ZOL與電離輻射聯(lián)用對CRL-1730細胞有明顯的增敏效應，可抑制CRL-1730細胞克隆形成、小管形成及侵襲能力，同單純ZOL用藥組及單純放射組比較差異顯著(P<0.05)。結論 ZOL處理可有效提高血管內皮細胞CRL-1730的放療敏感性。

唑來膦酸；血管內皮細胞；細胞增殖；放射敏感性

放射治療是惡性腫瘤重要治療手段之一。腫瘤血管形成是腫瘤獲得生長需要的養(yǎng)分及發(fā)生轉移的必要條件，增強血管內皮細胞對放射治療的敏感性可以提高放療效果〔1〕。唑來膦酸(ZOL)不僅直接抑制腫瘤細胞的增殖分化、誘導細胞凋亡，降低腫瘤細胞的遷移、侵襲能力，還可以抑制腫瘤新生血管形成〔2～6〕。ZOL對于電離輻射(IR)對惡性腫瘤的殺傷效應具有增敏作用，然而其對血管內皮細胞的作用尚不明確〔7～9〕。本實驗觀察ZOL對血管內皮細胞放射敏感性的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及細胞 ZOL注射液購自購自瑞士諾華公司；達爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)液(DMEM)和胎牛血清(FBS)均購自美國Gibco公司；Matrigel購自美國BD公司；Transwell小室購自美國Millipore公司；其他常規(guī)化學試劑均為進口或國產(chǎn)分析純。細胞培養(yǎng) 人臍靜脈血管內皮細胞CRL-1730置于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，于37℃、5%CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)。

1.2 噻唑藍(MTT)比色法 細胞以5×103/孔接種于96孔板中，設4個復孔，培養(yǎng)24 h；更換含有不同濃度(0～64 μmol/L)ZOL的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)72 h，加入20 μl MTT(5 mg/ml)作用4 h；棄去培養(yǎng)液加入150 μl DMSO，振蕩10 min，測定各孔490nm吸光度值(A490)。實驗重復3次取平均值。

1.3 克隆形成實驗 細胞以含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基配成單細胞懸液，調整細胞密度至5×104/ml，分別以不同細胞數(shù)(100、200、500、1 000、4 000)接種至6孔板中，培養(yǎng)24 h后，更換含8 μmol/L ZOL的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)6 h，室溫下以直線加速器6 MV X線照射(機架角180°，照射距離100 cm，劑量1 Gy/min)，分別照射0、1、2、4、6 Gy 后更換不含藥物的培養(yǎng)液，與單純放射組一起繼續(xù)培養(yǎng)10～14 d，甲醇固定，姬姆薩染色，計數(shù)>50細胞克隆數(shù)，計算克隆形成率〔(克隆數(shù)/接種細胞數(shù))×100%〕。以對照組為100%計算存活分數(shù)(SF)。實驗重復3次，結果經(jīng)單純ZOL處理組實驗結果校正細胞毒性。

1.4 細胞侵襲實驗 細胞經(jīng)4 μmol/L ZOL處理6 h后接受4 Gy劑量放射，以無血清DMEM培養(yǎng)液調整細胞密度為2×106ml，于每個的Transwell上室內加入100 μl；將整個Transwell小室放入含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液的24孔板內培養(yǎng)24 h；上室甲醇固定，結晶紫染色，擦掉位于上室面未穿膜細胞后封片，光鏡下計數(shù)5個200倍視野的遷移細胞數(shù)。實驗設未處理對照組、單純ZOL用藥組(ZOL組)、單純放射組(IR組)與ZOL聯(lián)合放射處理組(ZOL+IR組)。

1.5 小管形成實驗 細胞經(jīng)4 μmol/L ZOL處理6 h后接受4 Gy劑量放射，以5×103/孔接種于預先鋪有Matrigel的96孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后光鏡下觀察小管形成情況并計數(shù)。

1.6 統(tǒng)計學方法 采用SPSS11.0軟件行單因素方差分析。

2 結 果

2.1 ZOL抑制CRL-1730細胞增殖能力 經(jīng)不同濃度(2、4、8、16、32、64 μmol/L)ZOL處理72 h后，其增殖能力A490值分別為1.156±0.077、1.076±0.057、0.901±0.039、0.787±0.041、0.724±0.051、0.684±0.037，相對于對照組(1.386±0.055)顯著降低，抑制效應呈劑量依賴性(P<0.05)。

2.2 ZOL增強CRL-1730細胞放射敏感性 克隆形成實驗結果發(fā)現(xiàn)，CRL-1730細胞經(jīng)4 μmol/L ZOL處理后，在不同的4 Gy與6 Gy照射劑量下，均可顯著降低細胞的SF，提示ZOL預處理可增強電離輻射對CRL-1730細胞的殺傷效應。見表1。

2.3 ZOL聯(lián)合放射處理對細胞侵襲能力的影響 與對照組(215.7±17.1)相比，ZOL組侵襲細胞數(shù)目明顯減少(155.0±12.5，P<0.05)，IR組未見明顯改變(197.4±21.7，P>0.05)。ZOL+IR組(74.6±23.5)與對照組、ZOL組或IR組相比，細胞侵襲能力均顯著降低(P<0.05)。

2.4 ZOL聯(lián)合放射處理對血管內皮細胞小管形成能力的影響 ZOL組(16.8±2.3)或IR組(19.1±1.5)小管形成能力較對照組明顯減弱(23.6±2.5，P<0.05)。ZOL+IR組(9.6±3.1)與對照組、ZOL組或IR相比，小管形成數(shù)目均顯著減少,且管腔更不完整(P<0.05)。見圖1。

表1 ZOL處理對CRL-1730細胞SF的影響

與0 Gy組比較：1)P<0.05

圖1 ZOL聯(lián)合放射抑制CRL-1730細胞小管形成(×200)

3 討 論

ZOL是目前抗骨吸收最強的雙磷鹽類藥物，臨床上主要應用于治療骨質疏松、骨更新代謝異常加快以及惡性腫瘤骨轉移引起的骨痛癥和高鈣血癥等疾病。研究顯示ZOL具有直接的抗腫瘤作用，一方面可以通過干擾諸如Ras、Rho和Rac等小分子結合蛋白的翻譯后修飾從而抑制腫瘤細胞生長并促進其凋亡，另一方面可以活化γ/δT細胞增強其對腫瘤細胞的殺傷效應〔4～9〕。本研究中發(fā)現(xiàn)ZOL可以呈劑量依賴性抑制血管內皮細胞CRL-1730的增殖能力。在此基礎上，為了避免高濃度藥物的細胞毒作用對后續(xù)實驗的影響，本研究選擇較低藥物濃度(4 μmol/L)。低濃度ZOL作用于腫瘤細胞系導致細胞周期停滯在S期并伴隨細胞周期蛋白的表達降低，尤其是cyclinE和cyclinD1的明顯改變，從而阻滯DNA合成和細胞周期進展〔7～9〕。腫瘤血管形成是腫瘤獲得生長需要的養(yǎng)分及發(fā)生轉移的必要條件，而ZOL是否對血管內皮細胞的具有放射增敏效應目前尚不明確。已知干擾血管內皮生長因子表達可增強腫瘤細胞對電離輻射的敏感性〔10，11〕。本研究提示ZOL可作為血管內皮細胞的放療增敏劑。低濃度ZOL處理可減弱CRL-1730細胞侵襲和小管形成能力，這種抑制效應在ZOL聯(lián)合電離輻射處理時更為顯著。

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〔2015-06-15修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

河南省科技攻關計劃項目(142102310464)；漯河醫(yī)學高等?？茖W校自然科學項目(2016-S-LMC10)

高鳳蘭(1966-)，女，教授，主要從事腫瘤病理學研究。

李文梅(1985-)，女，助教，主要從事醫(yī)學檢驗研究。

R73

A

1005-9202(2017)02-0278-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.02.008