人PETA-3/CD151基因RNAi慢病毒載體的構(gòu)建及沉默效應(yīng)鑒定

王紹清 王俊平 徐鳳琳 艾中偉 劉 婷

(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院病理學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

人PETA-3/CD151基因RNAi慢病毒載體的構(gòu)建及沉默效應(yīng)鑒定

王紹清 王俊平 徐鳳琳 艾中偉 劉 婷

(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院病理學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

目的 構(gòu)建PETA-3/CD151shRNA慢病毒表達(dá)載體,并在人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7細(xì)胞鑒定其轉(zhuǎn)染及基因沉默效果。方法 應(yīng)用基因工程技術(shù)，構(gòu)建4條針對PETA-3基因的RNAi靶序列，分別與慢病毒載體PgLV3連接，構(gòu)建重組慢病毒表達(dá)載體PETA-3-shRNA-1～4；將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到Top10感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)篩選陽性克隆、測序鑒定。應(yīng)用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞，進(jìn)行病毒包裝及滴度測定。將包裝產(chǎn)生的4種重組慢病毒分別感染MCF-7細(xì)胞，實時定量PCR和Western印跡檢測MCF-7細(xì)胞PETA-3 mRNA和蛋白的表達(dá)。根據(jù)篩選的結(jié)果，選取最有效的載體進(jìn)行病毒的大量包裝。結(jié)果 4個慢病毒載體PCR和測序結(jié)果與預(yù)期結(jié)果一致，感染MCF-7細(xì)胞96 h后，PETA-3-shRNA-2 mRNA和蛋白的表達(dá)量與未感染慢病毒的細(xì)胞組及空載體感染組相比均明顯下降，其中mRNA表達(dá)下降85%，蛋白表達(dá)下降84%(均P<0.05)。shRNA-2病毒載體大量包裝后其滴度為1×109TU/ml。結(jié)論 成功構(gòu)建針對PETA-3基因的慢病毒載體PETA-3-RNAi-LV3，體外感染MCF-7細(xì)胞后可有效抑制PETA-3基因和蛋白的表達(dá)。

PETA-3/CD151；RNA干擾；慢病毒；乳腺癌

四次跨膜結(jié)構(gòu)家族(TM4SF)是抑癌基因家族。它參與其他細(xì)胞表面分子之間的連接信號傳導(dǎo)，在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和激活，調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附活力中起重要作用。該家族已檢測有20多個成員，包括MRP-1/CD9、TAPA-1/CD81、ME91/CD63及KAI1/CD82等。KAI1/CD82等已被認(rèn)為是抑癌基因產(chǎn)物，與腫瘤進(jìn)展、預(yù)后呈負(fù)相關(guān)〔1～3〕。而PETA-3/CD151作為TM4SF中新近發(fā)現(xiàn)的成員，被認(rèn)為是TM4SF中的癌基因，能與其他跨膜四蛋白超家族成員和(或)整合素等結(jié)合形成復(fù)合體,通過蛋白激酶C、磷脂酰肌醇4激酶等信號通路將胞外信號轉(zhuǎn)導(dǎo)入胞內(nèi),從而介導(dǎo)細(xì)胞的黏附、遷移及血管形成,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移，與腫瘤進(jìn)展及預(yù)后呈正相關(guān)〔4,5〕。慢病毒載體(LV)是以人類免疫缺陷型病毒(HIV)為基礎(chǔ)發(fā)展起來的基因治療載體，可感染非分裂細(xì)胞和分裂細(xì)胞，轉(zhuǎn)移較大基因片段，抑制目的基因時間較長，不易引發(fā)宿主免疫反應(yīng)〔6,7〕，因具有以上諸多優(yōu)點(diǎn)，已成為研究RNA干擾(RNAi)的首選技術(shù)，本實驗通過構(gòu)建PETA-3/CD151基因的小發(fā)夾RNA(shRNA)LV并進(jìn)行鑒定,為進(jìn)一步研究PETA-3/CD151在乳腺癌的作用提供可行的工具，為后期體內(nèi)作用機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料和儀器 制備編碼慢病毒顆粒的重組病毒質(zhì)粒，三種輔助包裝載體質(zhì)粒(上海吉瑪制藥有限公司)、大腸桿菌感受態(tài)Top10、Lentivirus-NC病毒液和凝聚胺(polybrene)，DNA 限制性內(nèi)切酶(BamHⅠ、EcoRⅠ)、 DNA 連接酶(MBI Fermentas)，Plasmid抽提試劑盒(Promega公司)，293FT 和MCF-7細(xì)胞(為本實驗室保存的細(xì)胞株)。RNA抽提試劑RNAiso和SYBR ExScriptTMRT-PCR試劑盒(Perfect Real Time，Takara公司)；RMPI1640培養(yǎng)液、胰蛋白酶、胎牛血清(Gibco公司);鼠抗人CD151單克隆抗體(美國Santa cruz公司)。寡核苷酸及引物均由上海吉瑪制藥有限公司合成。主要設(shè)備有2700型PCR System擴(kuò)增儀，ABI 7300熒光定量PCR儀(美國ABI公司)。倒置熒光顯微鏡(日本Nikon公司)，蛋白電泳轉(zhuǎn)膜裝置，ECL成像系統(tǒng)(BIO-RAD公司)。

1.2 寡核苷酸的設(shè)計及表達(dá)及shRNA的LV構(gòu)建 檢索Genebank，獲取PETA-3 基因核苷酸序列，根據(jù)以人PETA-3的mRNA序列(GenBank:NM-139029)為模板選擇4段靶序列并設(shè)計1段陰性對照序列，經(jīng)BLAST表明其所設(shè)計的序列不與任何其他人類cDNA 序列同源。根據(jù)以上5段序列設(shè)計5對寡核苷酸序列，每對包含1條正義鏈和1條反義鏈，見表1。PgLV3-shRNA 模板中的loop 結(jié)構(gòu)選用了TTCAAGAGA以避免形成終止信號。正義鏈模板的5′端添加了GATCC，與BamHⅠ酶切后形成的黏端互補(bǔ);反義鏈模板的5′端添加了AATTC，與EcoRⅠ酶切后形成的黏端互補(bǔ)。根據(jù)確定的PETA-3基因RNAi有效序列sh-PETA-3及對照序列sh-Control，化學(xué)合成對應(yīng)的寡核苷酸DNA單鏈，退火形成黏性末端的DNA雙鏈，運(yùn)用基因克隆技術(shù)，與經(jīng)雙酶切后的穿梭質(zhì)粒連接。將鏈接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入制備好的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)含氨芐青霉素培養(yǎng)基篩選后，挑取單菌落擴(kuò)大培養(yǎng)，手工抽提質(zhì)粒，由于LV3-shRNA載體中含有EcoRⅠ、BamHⅠ酶切位點(diǎn)，故重組載體可經(jīng)EcoRⅠ及BamHⅠ雙酶切來初步鑒定，通過DNA測序進(jìn)一步鑒定。

1.3 PETA-3-siRNA慢病毒包裝與滴度檢測 取細(xì)胞狀態(tài)良好，處于對數(shù)生長期的293FT細(xì)胞，細(xì)胞計數(shù)后，將5×106個細(xì)胞接種于10 cm培養(yǎng)皿中，制備DNA-Lipofectamine 2000復(fù)合物，共轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24 h后更換新鮮培養(yǎng)液，放置37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)；于轉(zhuǎn)染后48、72 h，分別收集培養(yǎng)上清進(jìn)行濃縮；3 000 r/min 低速離心15 min，用0.45 μm濾器過濾上清液，徹底去除細(xì)胞碎片；高速離心90 min，沉淀病毒顆粒，棄去上清，保存病毒原液。采用倍比稀釋法感染293FT細(xì)胞，培養(yǎng)72 h后通過倒置熒光顯微鏡計數(shù)熒光細(xì)胞數(shù)，計算病毒滴度。

表1 CD151基因短發(fā)卡干擾寡核苷酸片段

1.4 慢病毒浸染靶細(xì)胞 細(xì)胞分為空載體組(為未攜帶目的基因的慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的MCF-7細(xì)胞),對照組(未經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)的MCF-7細(xì)胞正常組)及PETA-3慢病毒組。將MCF-7細(xì)胞按1×105/孔的濃度接種于6孔板，放置37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后；開始病毒浸染，按MOI 5，10，20，50 感染細(xì)胞，加入終濃度為5 μg/ml的凝聚胺，并設(shè)立空白對照組。24 h后更換完全培養(yǎng)基，72 h 后用熒光倒置顯微鏡觀察熒光表達(dá)情況。

1.5 實時熒光定量PCR檢測靶細(xì)胞中PETA-3 mRNA的表達(dá) 在病毒感染后的96 h，分別取各組細(xì)胞，用Trizol抽提細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，使用SYBR Green熒光定量PCR試劑完成實時熒光定量PCR檢測。每次實驗每個樣本做3個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次。引物序列：β-actin:正義鏈5′-CCCTGGCACCCAGCAC-3′,反義鏈5′-GCCGATCCACACGGAGTAC-3′,PETA-3:正義鏈5′-GACCATGCCTCCAACATCTACAAG-3′,反義鏈5′-GGTGCTCCTGGATGAAGGTCTC-3′。

1.6 Western 印跡檢測靶細(xì)胞中PETA-3蛋白的表達(dá) 病毒感染后72、96 h，分別提取各組細(xì)胞的總蛋白并測定蛋白質(zhì)濃度。取相同質(zhì)量的蛋白樣品上樣，10%SDS-PAGE凝膠電泳分離，并轉(zhuǎn)移至甲醇浸泡過的PVDF膜上，用封閉液封閉轉(zhuǎn)印膜2 h，TBST洗滌3次，孵育一抗二抗，采用SuperSignal West Pico Chemiluminent Substrates進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測，并對X線光片曝光。經(jīng)顯影定影處理后，膠片用凝膠成像分析系統(tǒng)拍照，使用Gel-Pro Analyzer軟件分析處理。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計學(xué)分析軟件進(jìn)行t檢驗或方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 慢病毒shRNA 表達(dá)載體的鑒定 PETA-3基因shRNA 的寡核苷酸序列與慢病毒骨架質(zhì)粒連接，將產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌Top10，挑取重組陽性克隆進(jìn)行BamHⅠ和EcoRⅠ酶切鑒定及DNA測序。測序結(jié)果顯示重組克隆中插入片段的序列正確。見圖1。

2.2 慢病毒的包裝、滴度測定及最適MOI的確定 293FT細(xì)胞經(jīng)慢病毒轉(zhuǎn)染72 h后，用倒置熒光顯微鏡觀測細(xì)胞中綠色熒光的表達(dá)，細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率達(dá)到90%。病毒經(jīng)濃縮后，滴度測定為1.0×109TU/ml。篩選最適MOI 為10，轉(zhuǎn)染效率90%，當(dāng)MOI>10 時，其轉(zhuǎn)染效率無明顯提高。見圖2。

2.3 實時熒光定量PCR檢測MCF-7細(xì)胞中PETA-3基因mRNA表達(dá)情況 用針對各靶點(diǎn)的慢病毒(shRNA-1～4)載體感染MCF-7細(xì)胞，見圖3。感染72 h后用熒光顯微鏡觀察GFP的表達(dá)，結(jié)果顯示感染效率均>90%，感染后96 h收集細(xì)胞進(jìn)行熒光定量PCR檢測。與對照組比較，shRNA-1組，shRNA-2組和shRNA-4組人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7中PETA-3 mRNA 的表達(dá)均明顯下降(均P=0.000),空載體組和對照組比較，PETA-3 mRNA 的表達(dá)無明顯差異(P=0.342)，見表2。

2.4 Western印跡檢測MCF-7細(xì)胞中PETA-3蛋白表達(dá)情況 與空載體組比較，shRNA-2組和shRNA-4組人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7中PETA-3 蛋白的表達(dá)均明顯下降(均P=0.000),空載體組和對照組比較，PETA-3蛋白的表達(dá)無明顯差異(P=0.063)，見表2，圖4。

圖1 慢病毒shRNA表達(dá)載體的鑒定

圖2 慢病毒感染293FT細(xì)胞后熒光影像(×100)

圖3 慢病毒感染MCF-7乳腺癌細(xì)胞3 d熒光影像(×100)

組別PETA?3mRNA均值CD151/GAPDH均值空載體組100±013100±002對照組094±012094±006shRNA?1009±0011)2)092±002shRNA?2015±0021)2)016±0051)2)shRNA?3138±0021)2)225±0021)2)shRNA?4025±0031)2)029±0021)2)F/P值158982/00001285683/0000

與空載體組比較：1)P=0.000；與對照組比較：2)P=0.000

1～6：空載體組、對照組、shRNA-1、shRNA-2、shRNA-3、shRNA-4圖4 Western印跡檢測各組PETA-3蛋白的表達(dá)

2.5 病毒大量包裝后滴度測定 根據(jù)實時熒光定量PCR和Western 印跡測定的結(jié)果，選取最有效的一個RNAi慢病毒表達(dá)載體即B病毒進(jìn)行大量包裝后，測得病毒滴度為1×109TU/ml。

3 討 論

RNAi是后基因組時代功能基因組學(xué)研究的強(qiáng)有力工具，是雙鏈RNA 引發(fā)的轉(zhuǎn)錄后基因沉默,通過shRNA或21～23nts 的雙鏈RNA與特異mRNA 結(jié)合導(dǎo)致靶基因降解,從而引起目的基因產(chǎn)物表達(dá)下調(diào)。LV是在HIV-Ⅰ病毒基礎(chǔ)上改造成的病毒載體系統(tǒng),能高效地將目的基因?qū)雱游锖腿说脑?xì)胞或細(xì)胞系，整合目的基因到宿主細(xì)胞基因組中,有效感染并整合非分裂細(xì)胞，其干擾作用效率高、持續(xù)且穩(wěn)定,不易誘發(fā)宿主免疫反應(yīng)，適于體內(nèi)基因治療。LV介導(dǎo)的RNAi已經(jīng)成為多數(shù)研究者的首選〔8～10〕。

PETA-3/CD151與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移、預(yù)后及多種基因的突變、細(xì)胞信號傳導(dǎo)通路和新生血管增生異常等密切相關(guān)，對多種惡性腫瘤的診斷及治療有重要的臨床意義和價值〔11～14〕。本研究設(shè)計了4個靶序列，基因測序證明插入片

段的序列大小、方向均與設(shè)計的一致，經(jīng)慢病毒包裝系統(tǒng)包裝后，測定得到高滴度LV，從對靶細(xì)胞MCF-7 mRNA和蛋白水平上的表達(dá)檢測結(jié)果來看，PETA-3-RNAi-LV3-B的效果最好，說明基因靶點(diǎn)篩選構(gòu)建的有效性和特異性，為今后進(jìn)一步進(jìn)行PETA-3體內(nèi)外研究奠定了基礎(chǔ)。

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〔2015-04-11修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

黑龍江省教育廳基金資助(No.11511453；12521626 12531782)

劉 婷(1972-)，女，副教授，博士，主要從事乳腺癌浸潤轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究。

王紹清(1978-)，女，講師，博士，主要從事乳腺癌浸潤轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究。

R73

A

1005-9202(2017)02-0271-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.02.005