支架蛋白RACK1小干擾RNA抑制卵巢癌細胞CAOV3的增殖、遷移和侵襲

孫 靜 任麗莉 張曉玉 劉 超

(錦州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院發(fā)育生物學(xué)教研室，遼寧 錦州 121001)

支架蛋白RACK1小干擾RNA抑制卵巢癌細胞CAOV3的增殖、遷移和侵襲

孫 靜 任麗莉1張曉玉 劉 超

(錦州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院發(fā)育生物學(xué)教研室，遼寧 錦州 121001)

目的 觀察支架蛋白RACK1小干擾RNA(siRNA)對卵巢癌CAOV3細胞增殖、遷移和侵襲的影響和基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2和MMP-9的表達變化。方法 體外培養(yǎng)CAOV3細胞，實驗分scramble siRNA組和RACK1 siRNA組；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染CAOV3細胞，Western印跡檢測RACK1的干涉效能；MTT法測定CAOV3細胞的增殖率；劃痕實驗和transwell遷移和侵襲實驗研究RACK1對細胞體外增殖、遷移和侵襲運動能力的影響；Western印跡檢測CAOV3細胞中MMP-2和MMP-9蛋白表達。結(jié)果 與scramble siRNA組比較，RACK1 siRNA組RACK1的蛋白表達水平降低，明顯抑制CAOV3細胞的增殖、遷移和侵襲，降低MMP-2和MMP-9蛋白表達。結(jié)論 下調(diào)RACK1表達可抑制卵巢癌細胞CAOV3的增殖、遷移和侵襲，其機制可能與改變MMP-2和MMP-9蛋白表達相關(guān)。

RACK1；siRNA；卵巢癌；CAOV3

RACK1定位于人的第5號染色體，編碼35 kD的蛋白質(zhì)，其結(jié)構(gòu)包含七個WD40重復(fù)序列。它與G蛋白亞單位具有同源性，作為蛋白激酶C的胞內(nèi)受體而被首次發(fā)現(xiàn)〔1〕。很多報道提示RACK1的WD40重復(fù)序列正是RACK1與眾多蛋白相互作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，正是因為這些與RACK1相互作用蛋白在細胞各項生理功能的重要作用，才使人們關(guān)注RACK1，它可能參與調(diào)控許多重要的細胞功能，包括細胞生長、黏附、運動及分化〔2～5〕。有報道RACK1促進人黑色素瘤、口腔鱗癌、乳腺癌等腫瘤轉(zhuǎn)移〔6～8〕，但RACK1與卵巢癌生物學(xué)行為的相關(guān)性如何目前尚不清楚。本研究擬通過對RACK1與卵巢癌細胞生物學(xué)行為相關(guān)性及其機制研究，闡明卵巢癌增殖、遷移運動和侵襲轉(zhuǎn)移的分子生物學(xué)機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 DMEM/F12培養(yǎng)液，Transwell小室(Corning公司)；RACK1 siRNA和scrambled siRNA(上海吉瑪公司合成)；Lipofectamine 2000 (Invitrogen公司)；RACK1(鼠單克隆抗體，BD公司)、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2和MMP-9(兔多克隆抗體，Cell Signaling Technology公司)；HRP標(biāo)記的山羊抗兔，抗鼠IgG(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；BCA蛋白濃度測定試劑盒(北京碧云天生物技術(shù)公司)。BB16UV CO2培養(yǎng)箱(Heraeus)；凝膠自動成像儀GDS8000、水浴式電轉(zhuǎn)印槽、電泳儀(Bio-Rad，美國)。

1.2 細胞培養(yǎng) 人卵巢癌細胞CAOV3購自上海生命科學(xué)院細胞和生物化學(xué)研究所，生長于含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基中(含100 U/ml青霉素和50 U/ml鏈霉素)，37℃、5%CO2飽和濕度的溫箱中培養(yǎng)，每2天換液一次，0.25%胰蛋白酶消化傳代。

1.3 RACK1小干擾RNA(siRNA)的合成和轉(zhuǎn)染 針對人RACK1(GenBank No.NM_006098)的RNAi靶點序列：正義鏈5'-CAGATTGTCTCTGGATCTCGA-3'，反義鏈5'-UCGAGAUCCAGAGACAAUCUG-3'〔6〕，由上海吉瑪公司純化合成。CAOV3細胞接種于6孔細胞培養(yǎng)板中，細胞轉(zhuǎn)染按照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說明書進行。20 μmol/L scramble siRNA或RACK1 siRNA 轉(zhuǎn)染細胞48 h后收集細胞進行后續(xù)實驗。

1.4 MTT法檢測CAOV3細胞生長抑制率 取對數(shù)生長期CAOV3細胞，調(diào)整細胞數(shù)接種于96孔板培養(yǎng)板上，每組6個平行復(fù)孔；37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，在細胞融合率達80%～90%后，進行轉(zhuǎn)染；24 h或48 h后，取出96孔板，在每孔中加入新鮮配制的20 μl MTT溶液(5 mg/ml)，再次將96孔板放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h；棄去培養(yǎng)液，每孔加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)，振蕩15 min，充分溶解紫色結(jié)晶。通過酶標(biāo)儀測定490 nm測吸光度值(A值)，測定細胞生長抑制率。

1.5 劃痕試驗 將生長至融合度達90%的CAOV3細胞接種于24孔板，用黃色槍頭劃痕，PBS清洗細胞3次去除劃下的細胞，細胞轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)24～48 h，利用倒置顯微鏡標(biāo)尺，不同時間點(0、6、12、24和48 h)監(jiān)測劃痕寬度變化，測量劃痕寬度，攝像記錄。

1.6 侵襲實驗 在Transwell小室(24孔板)濾膜的上表面鋪100 μl Matrigel(100 mg/ml)，于37℃孵育4～5 h使之固化；溫?zé)岬臒o血清培液輕輕沖洗凝固的Matrigel；細胞以5×104/孔的密度接種于帶8 μm微孔膜的Transwell小室的上室，用含0.5%胎牛血清的培養(yǎng)液培養(yǎng)，下室加入500 μl含20%胎牛血清的培養(yǎng)液于37℃培養(yǎng)箱孵育，每組設(shè)8個復(fù)孔。培養(yǎng)48 h后，棄培養(yǎng)液，用無水乙醇室溫固定細胞5 min，PBS室溫清洗細胞3次，蘇木素伊紅染色后，用棉簽拭去小室上室面無侵襲性細胞。倒置顯微鏡下隨機選擇5個視野，計數(shù)穿過8 μm微孔膜的侵襲細胞數(shù)目。

1.7 遷移實驗 不鋪Matrigel膠，其余步驟同1.6。

1.8 Western印跡方法檢測RACK1、MMP-2和MMP-9的蛋白表達 RIPA蛋白裂解液提取收集轉(zhuǎn)染48 h后的細胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，5×SDS樣品緩沖液煮沸5 min，離心后上樣，10%SDS-PAGE電泳分離，將蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，含5%脫脂奶粉的TBST(pH7.4)封閉濾膜，再分別與RACK1、MMP-2和MMP-9抗體(稀釋比為1∶1 000) 及β-actin抗體(稀釋比為1∶1 000) 4℃溫育過夜。TTBS洗膜3次，HRP耦聯(lián)的IgG作為二抗(稀釋比為1∶5 000)室溫溫育2 h，重復(fù)洗膜3次，ECL發(fā)光法顯色。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用Graphpad prism5軟件進行方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 CAOV3細胞轉(zhuǎn)染RACK1 siRNA顯著下調(diào)RACK1的表達 與mock組和scramble siRNA組比較，CAOV3細胞轉(zhuǎn)染RACK1 siRNA明顯抑制內(nèi)源性RACK1的蛋白表達，見圖1。

1～3：mock組、scramble siRNA組、RACK1 siRNA組圖1 CAOV3細胞轉(zhuǎn)染RACK1 siRNA后RACK1蛋白表達水平

2.2 下調(diào)RACK1的表達抑制CAOV3細胞的體外增殖 CAOV3細胞生長24 h后，與mock組(92.80±3.09)%和scramble siRNA組(89.80±3.96)%相比，轉(zhuǎn)染RACK1 siRNA(74.80±2.76)%能夠顯著抑制CAOV3細胞的生長增殖(P<0.01)；細胞生長48 h后，與mock組(88.28±4.91)%和scramble siRNA組(84.75±3.35)%相比，RACK1 siRNA轉(zhuǎn)染組(54.80±2.91)%細胞生長明顯受到抑制(P<0.01)。

2.3 下調(diào)RACK1表達抑制CAOV3細胞遷移 CAOV3細胞轉(zhuǎn)染48 h后，RACK1 siRNA轉(zhuǎn)染組細胞遷移的數(shù)量較scramble siRNA組少，相對距離較遠。兩組細胞48 h愈合率分別為(34.80±1.96)%和(92.43±4.8)%，差異顯著(P<0.01)，見圖2。Transwell遷移實驗結(jié)果表明，RACK1 siRNA轉(zhuǎn)染組穿過微孔膜的細胞數(shù)(45.53±5.36)較scramble siRNA轉(zhuǎn)染組細胞(242.67±18.82)少，差異有顯著性(P<0.01)，見圖3。

2.4 下調(diào)RACK1表達抑制CAOV3細胞侵襲 Transwell侵襲實驗也顯示與對照組(193.28±21.53)相比，轉(zhuǎn)染RACK1 siRNA組CAOV3細胞穿過麥氏膠的細胞(57.64±6.89)明顯減少，見圖4。

2.5 下調(diào)RACK1的表達抑制CAOV3細胞中MMP-2和MMP-9蛋白的表達 與mock組和scramble siRNA組相比，RACK1 siRNA轉(zhuǎn)染組CAOV3細胞后MMP-2和MMP-9蛋白的表達明顯降低，見圖5。

圖2 劃痕實驗檢測轉(zhuǎn)染RACK1 siRNA后CAOV3細胞的遷移情況(×200)

圖3 Transwell實驗檢測轉(zhuǎn)染RACK1 siRNA CAOV3細胞的遷移情況(×200)

圖4 Transwell實驗檢測轉(zhuǎn)染RACK1 siRNA CAOV3細胞的侵襲情況(×200)

1～3：mock組、scramble siRNA組、RACK1 siRNA組圖5 CAOV3細胞轉(zhuǎn)染RACK1 siRNA后MMP-2和MMP-9蛋白表達

3 討 論

惡性腫瘤生長的高級階段，不僅涉及腫瘤細胞的生長，更重要的是腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移，這也是阻礙卵巢癌治療的首要因素。腫瘤轉(zhuǎn)移是在多基因改變的基礎(chǔ)上，涉及諸多活性分子和多種調(diào)控機制的序貫連續(xù)的多環(huán)節(jié)過程。因此，阻斷其中一個環(huán)節(jié)或改變?nèi)我庹{(diào)控因子的分布、表達和功能狀態(tài)，都可能成為控制腫瘤轉(zhuǎn)移的有效手段〔5〕。表明干涉RACK1表達后，CAOV3細胞出現(xiàn)明顯的生長抑制狀態(tài)，劃痕實驗結(jié)果表明RACK1 siRNA組的細胞愈合劃痕的比例明顯低于對照組。Transwell遷移試驗驗證了RACK1 siRNA組細胞穿過微孔膜發(fā)生遷移的細胞數(shù)量明顯少于對照組，同劃痕愈合實驗結(jié)果相一致。Transwell侵襲試驗也表明特異性抑制RACK1表達，能夠顯著阻礙CAOV3細胞的侵襲。腫瘤轉(zhuǎn)移的重要步驟是腫瘤細胞外基質(zhì)遷移和入侵，各種癌癥中已觀察到其細胞外基質(zhì)成分的改變〔9〕。腫瘤的侵襲和遷移很大程度上依賴腫瘤細胞的重塑和對細胞外基質(zhì)的改變，如對細胞外基質(zhì)降解。MMP-2和MMP-9可降解細胞外基質(zhì)，破壞上皮組織的基底膜，腫瘤細胞穿過破損的基底膜發(fā)生轉(zhuǎn)移，參與腫瘤的侵襲〔10〕。本研究提示RACK1可能通過調(diào)節(jié)MMP-2和MMP-9蛋白的表達，促進卵巢癌CAOV3細胞的遷移和侵襲，這與Cao等〔8〕和Wang等〔5〕的觀察結(jié)果相一致。綜上，下調(diào)支架蛋白RACK1的表達顯著抑制卵巢癌細胞CAOV3的細胞增殖、遷移和侵襲，其機制可能與降低CAOV3細胞中MMP-2和MMP-9的蛋白表達相關(guān)，為深入研究RACK1作為卵巢癌的分子生物學(xué)標(biāo)記物和靶點提供理論基礎(chǔ)和實驗依據(jù)。

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〔2015-09-01修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

Small interfering RNA of RACK1 inhibiting cell proliferation,migration and invasion in ovarian cancer CAOV3 cells

SUN Jing,REN Li-Li,ZHANG Xiao-Yu,etal.

Department of Development Biology of Jinzhou Medical University,Jinzhou 121001,Liaoning,China

Objective To observe the effects of double-stranded small interfering RNA (siRNA) of scaffolding protein RACK1 on the cell proliferation,migration,invasion of ovarian cancer CAOV3 cells and the protein expression levels of matrix metalloproteinases MMP-2 and MMP-9 in CAOV3 cells.Methods CAOV3 cells were cultured in vitro and transfected with RACK1 siRNA and scramble siRNA randomly.The transfected efficiency of RACK1 siRNA was determined by Western blot,the proliferation rate of CAOV3 cells was assayed by MTT,the cell migration and invasion of CAOV3 cells were examined by wound healing,transwell migration and invasion experiment.The MMP-2 and MMP-9 protein expression levels were detected by Western blot.Results Compared with scramble siRNA group,RACK1 siRNA inhibited the proliferation,migration and invasion of CAOV3 cells and decreased the protein expression of MMP-2 and MMP-9.Conclusions RACK1 silencing decreases the proliferation,migration and invasion of ovarian cancer CAOV3 cells via down-regulation of the protein expression of MMP-2 and MMP-9 in CAOV3 cells.

RACK1；siRNA；Ovarian cancer；CAOV3

國家自然科學(xué)基金資助項目(31371173)；遼寧省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目(201310160021)

劉 超(1978-)，女，副教授，博士，主要從事腫瘤分子生物學(xué)研究。

孫 靜(1992-)，女，主要從事腫瘤分子生物學(xué)研究。

R581.3

A

1005-9202(2017)02-0263-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.02.002

1 神經(jīng)生物學(xué)教研室