Thr187磷酸化p27kip1與人乳腺癌MCF-7細(xì)胞化療敏感性的關(guān)系

郭志琴 呂青山 袁琳娜 王振 陸寧 柯萍 鄔萬(wàn)新

Thr187磷酸化p27kip1與人乳腺癌MCF-7細(xì)胞化療敏感性的關(guān)系

郭志琴 呂青山 袁琳娜 王振 陸寧 柯萍 鄔萬(wàn)新

目的探討人乳腺癌MCF-7細(xì)胞中第187位蘇氨酸（Thr187）磷酸化的細(xì)胞周期素依賴性激酶抑制蛋白p27kip1（P-p27Thr187）與化療藥物敏感性的關(guān)系。方法人乳腺癌MCF-7細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)，采用MTT法測(cè)定其對(duì)5種常用化療藥物[表柔比星（EPI）、多西他賽（DOC）、5-氟尿嘧啶（5-Fu）、環(huán)磷酰胺（CTX）、順鉑（CDDP）]的敏感性；采用Western blot檢測(cè)經(jīng)化療藥物作用后P-p27Thr187、p27kip1表達(dá)水平；采用免疫共沉淀方法檢測(cè)P-p27Thr187與S期激酶相關(guān)蛋白2（Skp2）相互結(jié)合情況。結(jié)果5種常用化療藥物對(duì)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞均有抑制作用，5-Fu的抑制率隨濃度增加而增高，而其他4種化療藥物的抑制率開始隨濃度增加而增高，但達(dá)到理論最高藥物濃度（PPC）后降低（均P＜0．01）；在PPC下作用48h，抑制率從大到小的化療藥物依次為EPI、DOC、5-Fu、CTX、CDDP。Western blot結(jié)果顯示化療藥物作用48h后，P-p27Thr187表達(dá)水平明顯增加，以EPI、DOC增加最為明顯（均P＜0．01）；p27kip1表達(dá)水平明顯降低（均P＜0．01）。免疫共沉淀結(jié)果顯示，經(jīng)EPI 0．25μg/ml、DOC 6．80μg/ml作用48h后，P-p27Thr187與Skp2結(jié)合明顯增加。結(jié)論P(yáng)-p27 Thr187與人乳腺癌MCF-7細(xì)胞化療敏感性有關(guān)，可作為預(yù)測(cè)化療敏感性及選擇藥物的一項(xiàng)新指標(biāo)。

乳腺癌p27kip1磷酸化化療敏感性

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一。近年來(lái)其發(fā)病率不斷上升，居女性惡性腫瘤病死率首位[1]?；熓悄壳爸委熑橄侔┑闹匾侄危[瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐藥性是影響療效與預(yù)后的重要因素。細(xì)胞周期素依賴性激酶抑制蛋白（p27kip1）是重要的細(xì)胞周期負(fù)性調(diào)控因子，具有抑制細(xì)胞周期進(jìn)程的作用，因此可作為一個(gè)潛在的化療敏感性的預(yù)測(cè)指標(biāo)[2-3]。腫瘤細(xì)胞存在多種轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制來(lái)調(diào)節(jié)p27kip1表達(dá)，磷酸化是重要途徑之一[4]。人乳腺癌MCF-7細(xì)胞中第187位蘇氨酸（Thr187）的磷酸化可啟動(dòng)細(xì)胞S期激酶相關(guān)蛋白2（Skp2）介導(dǎo)的p27kip1多聚泛素化以及隨后的蛋白酶體降解，影響細(xì)胞內(nèi)p27kip1表達(dá)水平。為探討Thr187磷酸化p27kip1（P-p27Thr187）與人乳腺癌MCF-7細(xì)胞化療敏感性的關(guān)系，本文檢測(cè)并比較經(jīng)不同化療藥物作用后人乳腺癌MCF-7細(xì)胞中p27kip1、P-p27Thr187表達(dá)水平，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7（嘉興市第一醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室保存）。兔抗人p27kip1多克隆抗體（C-19，美國(guó)Santa Cruz公司）；兔抗人P-p27Thr187多克隆抗體（71-7700，美國(guó)Zymed公司）；兔抗人Skp2多克隆抗體（H-435，美國(guó)Santa Cruz公司）；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔IgG、山羊抗小鼠IgG和β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）單克隆抗體（美國(guó)Sigma公司）；增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光（ECL）試劑盒（美國(guó)Pierce公司）。含青霉素100U/ml、鏈霉素100μg/ml、10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco公司），MTT試劑盒（美國(guó)Sigma公司）。

1.2 化療藥物多西他賽（DOC，20mg/瓶或0.5ml/瓶，批號(hào)：131201，浙江萬(wàn)晟藥業(yè)有限公司）；表柔比星（EPI，10mg/支或5ml/支，批號(hào)：131014，浙江海正藥業(yè)股份有限公司）；環(huán)磷酰胺（CTX，0.2g/瓶或20ml/瓶，批號(hào)：13120325，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司）；5-氟尿嘧啶（5-Fu，0.25g/支或10ml/支，批號(hào)：FA131107，上海旭東海普藥業(yè)有限公司）和順鉑（CDDP，30mg/支或6ml/支，批號(hào)：130903，江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司）。根據(jù)Limburg和Heckman公式[Cmax=D（mg）/5 000×2×103μg/ ml（血漿）]，確定藥物1次快速靜脈注射后理論最高藥物濃度（PPC）[5]；EPI、DOC、5-Fu、CTX、CDDP的PPC分別為0.25、6.80、10.00、5.00、2.50μg/ml。以上藥物用0.9%氯化鈉溶液稀釋成工作液。

1.3 方法

1.3.1 人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7培養(yǎng)加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)。2～3d后用2.5mg/ml胰酶消化，傳代1次。實(shí)驗(yàn)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞。

1.3.2 藥敏試驗(yàn)96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，分為空白組（無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)基90μl加0.9%氯化鈉溶液10μl）、對(duì)照組（細(xì)胞懸液90μl加0.9%氯化鈉溶液10μl）和實(shí)驗(yàn)組（細(xì)胞懸液90μl加化療藥物10μl，每組復(fù)種5孔）。置37℃、5%CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，加入5mg/ml MTT0.9%氯化鈉溶液稀釋液，20μl/孔；繼續(xù)培養(yǎng)4h；培養(yǎng)結(jié)束后加入10%十二烷基硫酸鈉（酸化，含10%異丙醇）100μl/孔，振蕩，使結(jié)晶物充分溶解，終止反應(yīng)。用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定各孔的吸光度（OD）值（測(cè)量波長(zhǎng)570nm，參考波長(zhǎng)630nm），取每組5孔OD平均值為最終結(jié)果。計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率（IR）=（OD對(duì)照-OD實(shí)驗(yàn)）/（OD對(duì)照-OD空白）。并根據(jù)藥敏結(jié)果，篩選以下實(shí)驗(yàn)的藥物作用濃度。

1.3.3 Western blot檢測(cè)用細(xì)胞裂解液提取總蛋白，用bradford法檢測(cè)所提取的蛋白濃度，取等量蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，濕轉(zhuǎn)法將凝膠上蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜，室溫封閉（含10%脫脂奶粉的Tris-HCl緩沖鹽溶液）2h。一抗（p27kip1，1∶800；P-p27Thr187，1∶1 000；β-actin，1∶2 000）室溫孵育1h，4℃孵育過夜。HRP耦聯(lián)的二抗（1∶1 000）室溫孵育2h，ECL顯色。應(yīng)用Bio-Rad Quantity軟件分析測(cè)定其區(qū)帶的OD值，以β-actin為內(nèi)參對(duì)照，用目的片段與βactin的比值表示蛋白表達(dá)水平。

1.3.4 免疫共沉淀法根據(jù)收集的細(xì)胞量，加入適量的細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞；在蛋白提取物中加入protein G瓊脂糖珠預(yù)澄清，取上清液，加入2μg抗P-p27Thr187抗體，4℃輪轉(zhuǎn)過夜；加入預(yù)冷的protein G瓊脂糖珠，4℃輪轉(zhuǎn)2h，沉淀重懸于20μl上樣緩沖液。采用Western blot檢測(cè)共沉淀蛋白質(zhì)Skp2表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)設(shè)正常兔IgG作陰性對(duì)照。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料用表示，兩樣本均數(shù)的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組均數(shù)比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.15 種化療藥物對(duì)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖的抑制率藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，5種化療藥物不同濃度分別作用48h后，對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖均有明顯抑制作用。5-Fu的抑制率隨濃度增加而增高，而其他4種化療藥物的抑制率開始隨濃度增加而增高，但達(dá)到PPC后降低（均P＜0.01），見表1。在PPC下作用48h，對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖的抑制率從大到小的化療藥物依次為EPI、DOC、5-Fu、CTX、CDDP。

2.2 化療藥物作用后P-p27Thr187、p27kip1表達(dá)水平5種化療藥物分別作用48h后，P-p27Thr187表達(dá)水平明顯增加，以EPI、DOC增加最為明顯（均P＜ 0.01）；p27kip1表達(dá)水平明顯降低（均P＜0.01），見表2和圖1。

2.3 P-p27Thr187與Skp2相互結(jié)合情況免疫共沉淀結(jié)果顯示，經(jīng)EPI 0.25μg/ml、DOC 6.80μg/ml作用48h后，P-p27Thr187與Skp2結(jié)合明顯增加，見圖2。

表15 種化療藥物不同濃度作用48h后對(duì)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖的抑制率

表2 人乳腺癌MCF-7細(xì)胞中P-p27Thr187、p27kip1表達(dá)水平

圖1 Western blot檢測(cè)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞中P-p27Thr187、p27kip1表達(dá)的電泳圖（對(duì)照組：細(xì)胞懸液90μl加0.9%氯化鈉溶液10μl；EPI：0.25μg/ml；DOC：6.80μg/ml；5-Fu：10.0μg/ml；CTX：5.0μg/ml；CDDP：2.5μg/ml，β-actin：內(nèi)參對(duì)照）

圖2 免疫共沉淀法檢測(cè)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞中P-p27Thr187與Skp2相互結(jié)合情況（a：用抗P-p27Thr187的抗體免疫沉淀P-p27Thr187；b：用抗Skp2的抗體免疫沉淀Skp2；IP：免疫沉淀；WB：Western blot；IgG：陰性對(duì)照）

3 討論

目前，化療是乳腺癌綜合治療的重要手段之一，可明顯提高患者生存率，但乳腺癌細(xì)胞普遍存在多藥耐藥現(xiàn)象。因此，研究乳腺癌細(xì)胞耐藥的產(chǎn)生機(jī)制是臨床治療乳腺癌急需解決的難題。已有研究證實(shí)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期處于失調(diào)控狀態(tài)，這種異常調(diào)控狀態(tài)與腫瘤細(xì)胞化療耐藥的產(chǎn)生有關(guān)。p27kip1是重要的細(xì)胞周期負(fù)性調(diào)控因子，其蛋白表達(dá)及活性改變與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)。Porter等[6]研究發(fā)現(xiàn)，在接受CTX、阿霉素輔助治療的激素受體陽(yáng)性的乳腺癌患者中，p27kip1低表達(dá)與不良預(yù)后密切相關(guān)。亦有研究結(jié)果表明乳腺癌細(xì)胞中p27kip1高表達(dá)可導(dǎo)致癌細(xì)胞增殖率降低，對(duì)CTX不敏感；若下調(diào)p27kip1，敏感性逐漸恢復(fù)[7]。相關(guān)研究表明p27kip1具有抗凋亡的作用，它能阻滯靶向DNA的化療藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，從而使腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥性[8]。上述研究中p27kip1對(duì)化療藥物敏感性的預(yù)測(cè)并不一致，可能與它們只檢測(cè)了蛋白表達(dá)水平而未考慮到磷酸化水平對(duì)其功能的影響所致。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)P-p27Thr187在乳腺癌組織中高表達(dá)，陽(yáng)性表達(dá)率達(dá)90%以上，且與乳腺癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期相關(guān)；生存分析結(jié)果顯示P-p27Thr187高表達(dá)患者的總生存率、無(wú)瘤生存率均明顯低于低表達(dá)患者[9]。因此，本研究進(jìn)一步從細(xì)胞水平研究P-p27Thr187與化療敏感性的關(guān)系。

乳腺癌體外藥敏試驗(yàn)是個(gè)體化治療方案篩選的有效手段之一，對(duì)化療藥物的耐藥性、敏感性均有較高的準(zhǔn)確率。MTT法因其簡(jiǎn)便快捷、可評(píng)率高、觀察終點(diǎn)客觀等優(yōu)點(diǎn)，而被廣泛應(yīng)用于多種腫瘤的體外藥敏試驗(yàn)中。本文采用MTT法對(duì)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞進(jìn)行腫瘤藥敏實(shí)驗(yàn)，觀察經(jīng)5種常用化療藥物作用后，P-p27Thr187表達(dá)水平對(duì)其化療敏感性的影響。藥敏試驗(yàn)

結(jié)果顯示5種常用化療藥物對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖均有抑制作用，除5-Fu的抑制率隨濃度增加而增高，其他4種化療藥物的抑制率隨濃度增加而增高，達(dá)到峰值后逐漸降低。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)MCF-7細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性不一，在同一PPC濃度下作用48h后的抑制率從大到小為EPI、DOC、5-Fu、CTX、CDDP，與姚清深等[10]研究結(jié)果類似，提示以蒽環(huán)類、紫杉醇類為主的化療仍是目前臨床首選的化療方案。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示經(jīng)化療藥物處理后，P-p27Thr187表達(dá)水平明顯增高，以EPI、DOC增加最為明顯；p27kip1表達(dá)水平明顯降低。免疫共沉淀法檢測(cè)結(jié)果顯示經(jīng)化療藥物作用后，P-p27Thr187與Skp2結(jié)合明顯增加。P-p27 Thr187可促進(jìn)Skp2介導(dǎo)的p27kip1多聚泛素化以及蛋白酶體降解過程，從而降低p27kip1在細(xì)胞核中的表達(dá)水平，該過程可能在乳腺癌化療敏感性中發(fā)揮重要作用。綜上所述，P-p27 Thr187與人乳腺癌MCF-7細(xì)胞化療敏感性有關(guān)，可作為預(yù)測(cè)化療敏感性及選擇藥物的一項(xiàng)新指標(biāo)，以指導(dǎo)腫瘤個(gè)體化化療方案的實(shí)施，提高乳腺癌的治療效果。

[1]Jemal A,Bray F,Center M M,et al．Global cancer statistics[J]．CA Cancer J Clin,2011,61(2):69-90．

[2]Ma Y,Yan M,Huang H,et al．Associations and prognostic significance of p27kip1,Jab1 and Skp2 in non-Hodgkin lymphoma[J]． Mol Clin Oncol,2016,5(4):357-364．

[3]Wang Y,Yu Y N,Song S,et al．JAB1 and phospho-Ser10 p27 expression profile determine human hepatocellular carcinoma prognosis[J]．J Cancer Res Clin Oncol,2014,140(6):969-978．

[4]Kazi A,Carie A,Blaskovich M A,et al．Blockade of protein geranylgeranylation inhibits Cdk2-dependent p27Kip1phosphorylation on Thr187 and accumulates p27kip1in the nucleus:implications for breast cancer therapy[J]．Mol Cell Biol,2009,29(8): 2254-2263．

[5]朱慕云,姜正華,呂元文,等．苦參堿聯(lián)合化療藥物對(duì)人肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用[J]．中西醫(yī)結(jié)合學(xué)報(bào),2008,6(2):163-165．

[6]Porter P L,Barlow W E,Yeh I T,et al．p27kip1and cyclin E expression and breast cancer survival after treatment with adjuvant chemotherapy[J]．J Natl Cancer Inst,2006,98(23):1723-1731．

[7]Davidovich S,Ben-Izhak O,Shapira M,et al．Over-expression of Skp2 is associated with resistance to preoperative doxorubicin-based chemotherapy in primary breast cancer[J]．Breast Cancer Res,2008,10(4):R63．

[8]Cornelissen B,Kersemans V,McLarty K,et al．In vivo monitoring of intranuclear p27kip1protein expression in breast cancer cells during trastuzumab(Herceptin)therapy[J]．Nucl Med Biol,2009, 36(7):811-819．

[9]郭志琴,呂青山,張燕萍,等．乳腺癌SKP2及Thr187磷酸化p27kipl的表達(dá)及其預(yù)后意義[J]．中華病理學(xué)雜志,2013,42(3):197-198．

[10]姚清深,周林榮,秦軍,等．乳腺癌的腫瘤藥敏結(jié)果分析及臨床意義[J]．現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué),2009,17(7):1275-1276．

Relationship of p27kip1Thr187 phosphorylation with chemosensitivity of breast cancer MCF-7 cells

ObjectiveTo investigate the relationship of p27kip1Thr187 phosphorylation(P-p27Thr187)with chemosensitivity of human breast cancer MCF-7 cells．MethodsCultured MCF-7 cells were treated with epirubicin(EPI),docetaxel(DOC), 5-fluorouracil(5-Fu),cyclophosphamide(CTX)and cisplatin(CDDP),the inhibitory rates were measured by MTT method．The expression of P-p27Thr187 and p27kip1was detected by Western blot．The conjugation of P-p27Thr187 and S-phase kinase-associated protein 2(Skp2)was detected by co-immunoprecipitation method．ResultsThe MTT assay showed that inhibitory effect of 5 chemotherapeutical agents on MCF-7 cells in a dose-dependent manner,and with an order of inhibitory effect as:EPI,DOC,5-Fu,CTX and CDDP．Western blot assay showed that after drugs treatment,the expression of P-p27Thr187 protein was significantly increased,while the expression of p27kip1was decreased．Co-immunoprecipitation revealed that the conjugation of P-p27Thr187 and Skp2 protein was increased significantly after the chemotherapy drugs treatment．ConclusionP-p27Thr187 protein might be related to the chemosensitivity in human breast cancer MCF-7 cells,and it could be used as a marker for clinical assessment of sensitivity to chemotherapy．

Breast cancerp27kip1PhosphorylationChemosensitivity

2016-07-29）

（本文編輯：陳丹）

浙江省醫(yī)學(xué)重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)計(jì)劃項(xiàng)目（GJJX-010-001）；嘉興市科技計(jì)劃項(xiàng)目（2013AY21042-3）；嘉興市醫(yī)學(xué)重點(diǎn)支撐學(xué)科建設(shè)計(jì)劃項(xiàng)目（04-Z-01）；嘉興市第一醫(yī)院“啟明星”計(jì)劃項(xiàng)目（2013QMX003）

314000嘉興市第一醫(yī)院病理科（郭志琴、袁琳娜、王振、陸寧、柯萍、鄔萬(wàn)新），檢驗(yàn)科（呂青山）

郭志琴，E-mail：guozhq@foxmail.com.