紫杉醇生物合成途徑及合成生物學(xué)研究進(jìn)展

匡雪君王彩霞鄒麗秋　李瀅　孫超

[摘要] 紫杉醇是一種從紅豆杉植物中提取的具有顯著抗癌效果的萜類次生代謝產(chǎn)物。作為有效的抗癌藥物，目前生產(chǎn)主要依賴于紅豆杉，供求矛盾十分突出。近年來，利用合成生物學(xué)技術(shù)建立新的紫杉醇來源途徑已成為研究熱點(diǎn)。目前，紫杉醇合成途徑基本框架已經(jīng)確定；參與紫杉醇合成相關(guān)酶基因大部分已被克隆和鑒定；已經(jīng)在大腸桿菌和釀酒酵母中異源合成了紫杉醇的前體物質(zhì)紫杉烯和5α羥基紫杉烯。該研究對紫杉醇生物合成途徑及紫杉醇藥物中間體在大腸桿菌和釀酒酵母工程細(xì)胞中的合成進(jìn)展進(jìn)行了綜述，以期為生物合成紫杉醇進(jìn)一步研究提供參考。

[關(guān)鍵詞] 紫杉醇； 合成途徑； 合成生物學(xué)

Recent advances in biosynthetic pathway and synthetic biology of taxol

KUANG Xuejun1， WANG Caixia2， ZOU Liqiu1， LI Ying1， SUN Chao1*

（1. Institute of Medicinal Plant Development， China Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College，

Beijing 100193， China；

2. Institute of Chinese Materia Medica， China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100700， China）

[Abstract] Taxol， a kind of terpenoid secondary metabolite produced by Taxus brevifolia， is an effective anticancer drug that manufacture relies mainly on the extraction form plants. In order to solve the resource shortage， a lot of work has been done to develop the alternative method. Recently， using synthetic biology to realize heterologous biosynthesis of the precursors of taxol has become a hotspot. Now， the basic framework of taxol biosynthetic pathways has been confirmed， and most enzyme genes involved in taxol biosynthesis have been cloned and identified. The two taxol precursors， taxa4（5），11（12）diene and taxa4（20），11（12）dien5αol， have been synthesized in Escherichia coli and Saccharomyces cerevisiae. Here this paper reviewed the recent advances in the biosynthetic pathway of taxol and the latest developments of synthetic biology， which aims to provide a guidance for the heterologous biosynthesis of taxol.

[Key words] taxol； biosynthetic pathway； synthetic biology

doi：10.4268/cjcmm20162210

紫杉醇是一種復(fù)雜的四環(huán)二萜類化合物，1971年首次由Wani等從短葉紅豆杉Taxus brevifolia Nutt.樹皮中提取出來并確定其結(jié)構(gòu)[1]。該植物天然產(chǎn)物具有低毒、高效的抗癌效果，自1992年上市以來，廣泛用于卵巢癌、乳腺癌和非小細(xì)胞癌的治療，市場需求巨大[2]。

作為抗癌藥物，紫杉醇的分子結(jié)構(gòu)非常復(fù)雜，有11個立體中心和1個17碳的四環(huán)骨架結(jié)構(gòu)[3]。紫杉醇屬于次生代謝產(chǎn)物，合成量少，從短葉紅豆杉樹皮僅能獲得500 mg·kg-1的產(chǎn)量，遠(yuǎn)遠(yuǎn)滿足不了臨床的需要[34]。也有學(xué)者對其進(jìn)行化學(xué)合成的研究，但合成路線復(fù)雜，而且反應(yīng)條件難以控制，合成率低。因此，在后續(xù)的研究多集中于紫杉醇的半合成法，即首先從紫杉枝葉里提取出紫杉烷類中間產(chǎn)物，如10去乙酰巴卡亭Ⅲ （10deacetylbaccatin Ⅲ，10DAB）和巴卡亭Ⅲ（baccatin Ⅲ）， 然后再經(jīng)過化學(xué)合成得到紫杉醇[56]。該方法獲得的紫杉醇純度高、成本低，是工業(yè)化生產(chǎn)紫杉醇的主要方法，合成技術(shù)已比較純熟，但紫杉醇的生產(chǎn)仍受限于其來源植物[6]。紅豆杉是國家重點(diǎn)保護(hù)野生植物，從其來源植物中大量提取會對紅豆杉的生長造成嚴(yán)重威脅，且產(chǎn)量低，不適合大規(guī)模生產(chǎn)。利用合成生物學(xué)技術(shù)，通過微生物來合成紫杉醇的前體巴卡亭Ⅲ，再半合成紫杉醇是目前應(yīng)用前景最廣闊的一種方法，有望解決市場上紫杉醇價格昂貴、供不應(yīng)求的現(xiàn)狀，并且對于瀕危藥用植物的保護(hù)具有十分重要的意義[46]。

1 紫杉醇的生物合成途徑

紫杉醇的生物合成可分為3個階段：①紫杉烷環(huán)母核結(jié)構(gòu)的合成，以巴卡亭Ⅲ為產(chǎn)物；②苯基異絲氨酸側(cè)鏈的合成；③側(cè)鏈與紫杉烷母核的C13位酰化連接，然后在側(cè)鏈C2′位和C3′位分別被羥化和苯甲?；?，形成紫杉醇[78]。紫杉醇的生物合成途徑見圖1。

1.1 紫杉烷環(huán)母核結(jié)構(gòu)的合成

1.1.1 三環(huán)二萜骨架的形成 作為二萜類化合物，紫杉醇類化合物是通過異戊二烯前體合成的[7]。萜類的異戊二烯結(jié)構(gòu)單元可以通過位于細(xì)胞質(zhì)中的甲羥戊酸途徑（mevalonic acid pathway，MVA）或位于質(zhì)體中的磷酸甲基赤蘚糖醇途徑（methylerythritol phosphate，MEP）合成[9]。MVA途徑起始于乙酰輔酶A，經(jīng)過6步酶促反應(yīng)生成異戊烯焦磷酸（IPP）；MEP途徑起始于丙酮酸和甘油醛3磷酸，經(jīng)過7步酶促反應(yīng)生成IPP[10]。IPP是MVA和MEP途徑的共同中間體，在異戊烯基焦磷酸異構(gòu)酶（IDI）的作用下，部分IPP可以轉(zhuǎn)化為雙鍵異構(gòu)體甲基丙烯基焦磷酸（dimethylallyl diphosphate，DMAPP） [11]。對于紫杉醇合成前體的來源還沒有定論，用上述 2條途徑抑制劑分別處理紅豆杉細(xì)胞后紫杉醇合成均受到抑制[1213]。IPP和DMAPP縮合，生成二萜化合物的共同前體——牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸 （geranyl geranyl diphosphate，GGPP），然后，GGPP在紫杉烯合成酶（taxadiene synthase，TS）的催化下，環(huán)化生成紫杉烯[taxa4（5），11（12）diene]，形成了紫杉醇的三環(huán)二萜骨架結(jié)構(gòu)[1415]。

1.1.2 骨架上的官能團(tuán)反應(yīng) 紫杉烷環(huán)骨架形成后，在 C1，C2，C4，C5，C7，C9，C10和 C13位發(fā)生進(jìn)一步的修飾，最終形成紫杉醇的前體巴卡亭Ⅲ（baccatin Ⅲ）[28]。這些修飾包括羥基化，羥基組上的?；?、酮基化和環(huán)氧丙烷的形成[15] 。通過對天然紫杉烷類化合物含量分析和化學(xué)結(jié)構(gòu)推測表明， 羥基化反應(yīng)與?；磻?yīng)是交互進(jìn)行的， 即羥基組上的一些?；磻?yīng)可先于新的羥基化反應(yīng)發(fā)生，所以給紫杉醇途徑研究增加了難度[29]。Eisenreich 等證實(shí)紫杉烷環(huán)上的所有羥基化反應(yīng)均由依賴細(xì)胞色素P450的單加氧酶類催化完成[30]。紫杉醇合成過程中，其母核紫杉烯需經(jīng) 8個碳位的有效羥化，分別是C1位、C2位、C4位、C5位、C7 位、C9位、C10位、C13位[3132]。目前，紫杉醇生物合成過程中的羥化酶研究已取得了一些進(jìn)展，已經(jīng)完成了C2 位、C5位、C7 位、C10位、C13位和C14位羥化酶基因的克隆與鑒定，見表1，其中催化C14位羥化的紫杉烷14β羥基化酶（taxol 14βhydroxylase，T14βH）考慮到在紫杉烷的結(jié)構(gòu)中， C14位并沒有被氧化， 因此， 推斷該酶沒參與紫杉醇的生物合成，可能參與紫杉烷類的支路合成途徑[18]。在前體巴卡亭Ⅲ合成過程中，關(guān)于依賴乙酰輔酶A的?；磻?yīng)，目前已經(jīng)完成3個基因的克隆與鑒定，分別為：紫杉烯醇5α乙酰氧化基轉(zhuǎn)移酶（taxadienol 5αOacetyl transferase，TAT）、紫杉烷2α苯甲?；D(zhuǎn)移酶（taxane2αObenzoyltransferase，TBT）和10β去乙酰巴卡亭Ⅲ乙酰氧基轉(zhuǎn)移酶（10deacetylbaccatin Ⅲ10Oacetyltransferase，DBAT）[2224]。

除了紫杉烯的 C5 位最先羥化外，其他位點(diǎn)的羥化順序及參與酶的底物特異性仍不明確[3334]。紫杉烯由紫杉烯 5α羥基化酶 （taxadiene 5αhydroxylase，T5αH） 在 C5 位上引入羥基，生成5α羥基紫杉烯[taxa4（20），11（12）dien5αol][19]。接著從5α羥基紫杉烯到2debenzoyltaxan的反應(yīng)有2種推測[3536]：一是此萜烯中間體在 5α 羥基上由TAT酶催化其發(fā)生乙?；磻?yīng)形成taxa4（20），11（12）diene5αyl acetate，再經(jīng)紫杉烷 10β羥基化酶（taxoid 10βhydroxylase，T10βH）在 10 位上發(fā)生羥化反應(yīng)，然后如何生成2debenzoyltaxan不清楚[35]；二是此萜烯中間體在紫杉烷 13α羥基化酶（taxoid 13αhydroxylase，T13αH）催化作用下C13 位發(fā)生羥化反應(yīng)，生成taxa4（20），11（12）diene5a，13diol，然而對于其他位點(diǎn)C1，C2，C4，C7，C9 位發(fā)生的羥基化作用，4，5環(huán)氧丙烷環(huán)的形成，C2，C5，C10 位羥基上的?；?C9 位的酮基化反應(yīng)發(fā)生的順序尚不明確[3637]，見圖1。2debenzoyltaxan形成后，由TBT催化其生成10去乙酰巴卡亭Ⅲ（10deacetyl baccatin Ⅲ，10DAB），然后發(fā)生紫杉烷環(huán)母核上的最后一步修飾反應(yīng)——DBAT催化10去乙酰巴卡亭Ⅲ生成巴卡亭Ⅲ[2324]。

1.2 苯基異絲氨酸側(cè)鏈的合成

C13位側(cè)鏈?zhǔn)潜ＷC紫杉醇抗癌活性的關(guān)鍵因素，而且代謝調(diào)控研究表明側(cè)鏈對終產(chǎn)物合成限速影響大于三環(huán)二萜骨架[38]， 因此了解側(cè)鏈生物合成途徑， 對提高紫杉醇的生物合成量具有實(shí)際意義。C13 苯基異絲氨酸側(cè)鏈起源、側(cè)鏈的連結(jié)次序和方式、組裝至巴卡亭Ⅲ形成紫杉醇的路徑都已清楚，絕大部分相關(guān)酶基因也已被克隆，見表1。側(cè)鏈的合成由兩步反應(yīng)完成：首先，α苯丙氨酸（αphenylalanine）在苯丙氨酸氨基變位酶（phenylalanine aminomutase，PAM）的作用下異構(gòu)化為β苯丙氨酸（βphenylalanine）[27]，再與乙酰輔酶A結(jié)合生成βphenylalanyl CoA，目前此連接酶基因尚未克隆獲得[39]。

1.3 紫杉醇的形成

首先，巴卡亭Ⅲ 3氨基3苯丙醇基轉(zhuǎn)移酶（baccatin Ⅲ：3amino3phenylpropanoyltransferase，BAPT）以βphenylalanyl CoA作為酰基供體，催化巴卡亭Ⅲ的C13 位?；纬搔聀henylalanyl baccatin Ⅲ[25]，再經(jīng)過側(cè)鏈的羥化作用形成3′N去苯甲酰紫杉醇（3′Ndebenzoyltaxol），這一步的細(xì)胞色素P450羥化酶尚未克隆獲得[40]。然后3′N去苯甲酰2′脫氧紫杉醇 N苯甲?；D(zhuǎn)移酶（3′Ndebenzoyl2′deoxytaxol Nbenzoyltransferase，DBTNPT）催化側(cè)鏈上 C3′位N原子發(fā)生苯甲酰化生成終產(chǎn)物紫杉醇[26]。

2 紫杉醇的合成生物學(xué)研究

隨著紫杉醇代謝途徑的逐步闡明，紫杉醇生物合成途經(jīng)的一些步驟已經(jīng)被轉(zhuǎn)化到大腸桿菌，釀酒酵母這些異源表達(dá)系統(tǒng)，制備獲得了不同的紫杉醇中間體，如紫杉烯和5α羥基紫杉烯[4149]。

2.1 大腸桿菌作為工程菌合成紫杉醇前體

紫杉烯是紫杉醇合成途徑中的一個重要中間產(chǎn)物，許多學(xué)者在大腸桿菌中對其進(jìn)行了合成生物學(xué)研究[4244]。2001年，Hang等[42]將DXP合酶基因、IPP異構(gòu)酶基因、GGPP合酶基因以及紫杉烯合酶基因在大腸桿菌中共表達(dá)，以異戊二烯焦磷酸為原料進(jìn)行發(fā)酵，首次通過工程菌株獲得了紫杉醇合成途徑中的重要中間體紫杉烯，產(chǎn)量達(dá)到1.3 mg·L-1。紫杉烯在工程菌株中的成功合成說明了在微生物中通過組合不同的紫杉醇生物合成相關(guān)基因來獲得目標(biāo)產(chǎn)物的方法是可行的。Ajikumar 等[43]在大腸桿菌中使用多元模塊代謝工程（multiple module metabolic engineering，MMME），以IPP為節(jié)點(diǎn)，將紫杉醇生物合成途徑分為2個模塊，即：產(chǎn)IPP的內(nèi)源性MEP途徑的上游模塊和合成異源萜類化合物途徑的下游模塊。上游模塊包括MEP途徑的4個關(guān)鍵酶基因，即：dxs， idi， ispD， ispF，下游模塊包括紫杉醇代謝途徑中的2個基因：GGPP 合酶基因和紫杉二烯合成酶基因。首先，將下游模塊導(dǎo)入底盤細(xì)胞中，上游代謝模塊的4個基因由操縱子（dxsidiispDF）控制過表達(dá)，然后，利用改變質(zhì)?？截悢?shù)和啟動子強(qiáng)度的方法調(diào)節(jié)下游模塊2個基因的表達(dá)強(qiáng)度。通過上下游模塊的平衡使整個代謝途徑達(dá)到最優(yōu)化，使大腸桿菌中紫杉烯達(dá)到幾乎1 g·L-1的產(chǎn)量，這在目前是紫杉烯最高的產(chǎn)量。他們也進(jìn)行了紫杉烯下一步的轉(zhuǎn)化，利用T5αH 使5α羥基紫杉烯的產(chǎn)量達(dá)到58 mg·L-1。近來，Biggs等[44]通過優(yōu)化細(xì)胞色素P450酶在大腸桿菌中的表達(dá)，使總的氧化紫杉烷類產(chǎn)量達(dá)到570 mg·L-1。

2.2 酵母菌作為工程菌合成紫杉醇前體

由于大腸桿菌是原核生物，不含Ⅱ型P450氧化酶及還原酶的偶聯(lián)并缺少完整的內(nèi)膜系統(tǒng)，細(xì)胞色素P450酶不能定位表達(dá)，而酵母菌可以產(chǎn)生有功能的Ⅱ型P450單加氧酶，并且具有完整的細(xì)胞內(nèi)膜系統(tǒng)，能確保與紫杉醇生物合成相關(guān)的羥化酶基因的共表達(dá)，因此，釀酒酵母細(xì)胞更適合于較為復(fù)雜產(chǎn)物的合成[4546]。P450介導(dǎo)的氧化反應(yīng)是紫衫烯合成巴卡亭Ⅲ的必經(jīng)反應(yīng)，故酵母菌成為表達(dá)紫杉醇中間產(chǎn)物的另一個選擇。2006年，DeJong等[47]將紫杉醇合成途經(jīng)中從IPP到taxa4（20），11（12）diene5aacetoxy10βol的5個基因?qū)脶劸平湍福鼈兎謩e為：GGPPS基因，TS基因，T5αH基因，TAT基因和T10βH基因。然而，只有紫杉二烯的產(chǎn)量達(dá)到mg·L-1的級別，5α羥基紫杉烯的產(chǎn)量僅有25 mg·L-1，5α羥基紫杉烯接下來兩步反應(yīng)的產(chǎn)物taxa4（20），11（12）diene5ayl acetate和taxa4（20），11（12）diene5aacetoxy10βol均沒有檢測到。該研究表明細(xì)胞色素P450酶T5αH介導(dǎo)的第一步氫化反應(yīng)是限速步驟。Rontein等[48]在酵母菌中構(gòu)建了紫杉烯5α羥基化酶、細(xì)胞色素P450還原酶融合基因，獲得的工程菌能夠進(jìn)行第一步氧化反應(yīng)。2008年，Engels 等[49]將密碼子優(yōu)化的荊江紅豆杉的TS基因、HMGCoA還原酶基因、UPC21轉(zhuǎn)錄因子基因和噬酸熱硫化葉菌的GGPP合成酶基因?qū)脶劸平湍竵砩a(chǎn)紫杉醇的中間產(chǎn)物紫杉二烯。UPC21是酵母中調(diào)節(jié)甾醇生物合成的一個通用轉(zhuǎn)錄因子，通過加入UPC21，可以促進(jìn)酵母細(xì)胞在有氧生長條件下吸收利用甾醇，降低甾醇的生物合成與構(gòu)建的紫杉烯合成途徑的競爭。采用噬酸熱硫化葉菌的GGPP合成酶基因也是為了避免和甾體化合物合成競爭。最后，工程菌中紫杉二烯的產(chǎn)量達(dá)到8.7 mg·L-1，同時還有未被TS催化合成紫杉烯的前體物質(zhì)牻牛兒基牻牛兒醇（geranylgeraniol） 33.1 mg·L-1，說明了紫杉烯的產(chǎn)量能得到進(jìn)一步的提高。

3 展望

紫杉醇作為治療乳腺癌、卵巢癌和非小細(xì)胞肺癌的一線藥物，目前的生產(chǎn)主要依賴于從紅豆杉中提取前體之后再化學(xué)合成。開發(fā)成本低且產(chǎn)率高的生物合成的方法尤為重要，對紫杉醇生物合成路徑及相關(guān)酶的研究是進(jìn)行紫杉醇異源生物合成的基礎(chǔ)。目前，紫杉醇合成途徑基本框架已經(jīng)確定，參與的大部分酶也已經(jīng)克隆得到，已經(jīng)可以在大腸桿菌和釀酒酵母中異源合成紫杉醇的前體物質(zhì)紫杉烯和5α羥基紫杉烯，但是由于紫杉醇生物合成途徑仍然沒有完全清楚，導(dǎo)致對紫衫烯到紫杉醇階段的合成研究較少，因此要利用生物合成實(shí)現(xiàn)紫杉醇的持續(xù)供應(yīng)仍需付出艱苦努力。本草基因組學(xué)（herbgenomics）的快速發(fā)展為合成生物學(xué)研究提供了大量可供選擇和改造的生物學(xué)元器件，綜合運(yùn)用各種組學(xué)技術(shù)，將極大地加速天然產(chǎn)物合成途徑的解析研究[5051]。

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[責(zé)任編輯 孔晶晶]