藍(lán)莓益生菌通過(guò)影響IL-22/JAK1/STAT3信號(hào)通路改善非酒精性脂肪肝的研究*

祝娟娟，程明亮，任婷婷，周明玉

(貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院感染科，貴陽(yáng) 550001)

藍(lán)莓益生菌通過(guò)影響IL-22/JAK1/STAT3信號(hào)通路改善非酒精性脂肪肝的研究*

祝娟娟，程明亮△，任婷婷，周明玉

(貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院感染科，貴陽(yáng) 550001)

目的 研究藍(lán)莓益生菌通過(guò)對(duì)白細(xì)胞介素-22(IL-22)調(diào)控的酪氨酸蛋白激酶-1(JAK1)/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)激活轉(zhuǎn)錄因子-3(STAT3)信號(hào)通路的影響，進(jìn)一步探明其改善非酒精性脂肪肝病(NAFLD)的作用機(jī)制。方法 清潔級(jí)SD大鼠40只分為正常對(duì)照組(NG)、觀察組(MG)、藍(lán)莓組(BG)、益生菌組(PG)和藍(lán)莓+益生菌組(BPG)。除NG(100%普通飲食)外，其余大鼠均采用復(fù)合高脂飼料制備脂肪肝模型共12周。確認(rèn)造模成功后再將剩余MG大鼠分為BG、PG及BPG，共觀察8周。結(jié)果BPG與MG、BG及PG比較：肝臟指數(shù)、血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL)顯著下降(P<0.01)，高密度脂蛋白(HDL)顯著升高(P<0.01)；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)IL-22：BPG的蛋白水平較MG、BG、PG增高(P<0.01)；定量反轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈鎖反應(yīng)(qRT-PCR)：BPG的JAK1、STAT3的表達(dá)較MG、BG、PG顯著升高(P<0.01)，膽固醇調(diào)節(jié)元件蛋白-1c(SREBP-1c)表達(dá)顯著降低(P<0.01)；Westernblot：BPG的IL-22、JAK1、STAT3的表達(dá)較MG、BG、PG顯著升高(P<0.01)，SREBP-1c表達(dá)明顯減少(P<0.01)。結(jié)論 藍(lán)莓益生菌能有效改善NAFLD的病理組織結(jié)構(gòu)，減輕肝細(xì)胞脂肪變性，其機(jī)制可能是藍(lán)莓益生菌可增加肝臟IL-22的表達(dá)，激活下游的JAK1/STAT3信號(hào)通路，下調(diào)SREBP-1c的基因表達(dá)，抑制SREBP-1c的作用，增強(qiáng)膽固醇代謝，減少脂質(zhì)沉積，是NAFLD的一個(gè)輔助治療方案。

藍(lán)莓；益生菌；白細(xì)胞介素-22；酪氨酸蛋白激酶-1；信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)激活轉(zhuǎn)錄因子-3；非酒精性脂肪肝

非酒精性脂肪性肝病(non-alcholic fatty liver disease，NAFLD)已成為全世界最常見(jiàn)的肝臟疾病之一[1]，且其發(fā)展呈上升趨勢(shì)。白細(xì)胞介素(IL)-22是抗炎因子IL-10家族成員中的一員，與IL-10在結(jié)構(gòu)上存在明確的相關(guān)性，是重要的護(hù)肝因子，在多種肝臟疾病中呈現(xiàn)保護(hù)作用[2]。酪氨酸蛋白激酶-1(JAK1)/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)激活轉(zhuǎn)錄因子-3(STAT3)信號(hào)通路是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一條由細(xì)胞因子刺激的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，參與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡及免疫調(diào)節(jié)等許多重要的生物學(xué)過(guò)程。Bin等[3]發(fā)現(xiàn)JAK1/STAT3信號(hào)通路受IL-22調(diào)控，對(duì)酒精性脂肪肝病有潛在的保護(hù)作用。目前，臨床尚缺乏治療NAFLD的特效藥物[4]，益生菌作為腸道微生態(tài)調(diào)節(jié)劑能有效減輕內(nèi)毒素血癥，改善腸道屏障功能，在NAFLD的治療中能起到一定的作用[5]。中醫(yī)認(rèn)為“上工治未病”，因此通過(guò)飲食調(diào)節(jié)是治療NAFLD的重要手段。藍(lán)莓營(yíng)養(yǎng)成分豐富，富含花青素及多種多酚類物質(zhì)，具有很好的抗氧化及抗炎作用，可增強(qiáng)機(jī)體免疫力。研究顯示，藍(lán)莓具有良好的護(hù)肝作用，可逆轉(zhuǎn)肝纖維化[6]，并且聯(lián)合益生菌后能有效減輕肝臟炎癥，改善肝細(xì)胞脂肪變性[7]?；谏鲜鲅芯炕A(chǔ)，本實(shí)驗(yàn)擬將藍(lán)莓與益生菌聯(lián)合運(yùn)用，通過(guò)對(duì)IL-22調(diào)控的JAK1/STAT3信號(hào)通路的影響達(dá)到改善NAFLD的目的，從而探討二者輔助治療NAFLD的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑 SD大鼠40只，雄性，清潔級(jí)，體質(zhì)量(220±30)g，購(gòu)自貴州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，合格證號(hào)：SCXK-(黔)2012-0001，用于建立NAFLD動(dòng)物模型[8]。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物NAFLD造模誘導(dǎo)飼料(江蘇美迪森生物有限公司，批號(hào)：MD12051)；選用貴州麻江兔眼園蘭藍(lán)莓，-20 ℃凍存，臨用時(shí)解凍提取原漿，其成分包括花青素、微量元素、類黃酮、維生素等[9]；益生菌干片(嬰兒雙歧桿菌、動(dòng)物雙歧桿菌、乳桿菌：中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心)；IL-22酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒(catalog number：M2200，Quantikine)；Maxima SYBR Green/ROX qPCR預(yù)混液(美國(guó)Thermo Scientific,批號(hào)：00330632)；β-actin、JAK1引物、STAT3引物、固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1c(SREBP-1c)引物(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司，批號(hào)：10441535)；anti-IL22(英國(guó)Abcam,批號(hào)：ab98917)；anti-JAK1(英國(guó)Abcam,批號(hào)：ab125051,Abcam)；anti-STAT3(英國(guó)Abcam,批號(hào)：ab119352)；anti-SREBP-1c (英國(guó)Abcam,批號(hào)：ab3259)。

1.1.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器 ViiA7實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time PCR,Applied Biosystems，美國(guó))；NANO-drop 2000超微量分光光度計(jì)(Thermal scientific，美國(guó))；EPS-601電泳儀(Amersham，美國(guó))；SynergyH4多功能酶標(biāo)儀(biotek，美國(guó))；顯微鏡圖像采集系統(tǒng)Olympus BX41(Olympus，美國(guó))。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型制備及分組 將40只SD大鼠分成5組：正常對(duì)照組(NG) 8只，觀察組(MG)8只，藍(lán)莓組(BG)8只，益生菌組(PG)8只和藍(lán)莓+益生菌組(BPG) 8只。NG正常飲食，自由飲水；其余大鼠均用復(fù)合型高脂飼料(88.3%普通飼料+10.0%豬油+1.5%膽固醇+0.2%膽酸鈉)喂養(yǎng)12周。造模結(jié)束后取部分MG大鼠，股動(dòng)脈放血處死(處死前稱體質(zhì)量)，留取血液及全部肝臟：每只大鼠取相同部位肝臟用10%中性甲醛固定，病理切片，蘇木素-伊紅(HE)染色及油紅染色，剩余肝臟組織-80 ℃低溫冰箱保存。確認(rèn)造模成功后，將MG剩余大鼠分為BG(藍(lán)莓原漿：每日1.5 mL/100 g灌胃，前期實(shí)驗(yàn)摸索出的最佳濃度及劑量)、PG(將益生菌干片磨至粉末狀，加適量蒸餾水溶解，益生菌水平：1×108CFU/mL；益生菌溶液1.5 mL/d灌胃，前期實(shí)驗(yàn)摸索出的最佳劑量)、BPG(將益生菌干片磨至粉末狀后加入藍(lán)莓原漿中混勻，參照文獻(xiàn)[10]混合液1.5 mL/100 g體質(zhì)量灌胃，每日1次，益生菌水平：1×108CFU/mL)，同時(shí)上述分組后給予正常飲食，觀察8周，實(shí)驗(yàn)結(jié)束，禁食12 h后稱大鼠體質(zhì)量，股動(dòng)脈放血，留取全部肝臟組織：稱肝臟濕質(zhì)量，每只大鼠取肝右葉置于10%中性甲醛固定后，石蠟包埋，用于制作組織切片。

1.2.2 肝臟指數(shù) 計(jì)算方法為：肝臟指數(shù)=(肝臟質(zhì)量/體質(zhì)量)×100%。

1.2.3 血清學(xué)檢測(cè) 血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL)及高密度脂蛋白(HDL)。

1.2.4 肝組織病理檢測(cè) 動(dòng)物處死后，立即解剖，取相同部位1.0 cm×1.0 cm×0.5 cm大小的肝右葉置于10%中性甲醛緩沖液中固定1 周，常規(guī)石蠟包埋切片行HE 染色及油紅染色。HE切片光鏡下評(píng)估肝臟脂肪變性和炎癥活動(dòng)情況。病理診斷和療效評(píng)估參照美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院NASH臨床研究網(wǎng)病理委員會(huì)所訂指南[11]，常規(guī)進(jìn)行NAFLD活動(dòng)度積分(NAFLD activity score，NAS)。

1.2.5 ELISA檢測(cè)肝組織中IL-22水平 肝臟組織勻漿后，4 000 r/min 15 min、4 ℃離心取上清液備用。標(biāo)準(zhǔn)品按照說(shuō)明書(shū)分別稀釋成500.0、250.0、125.0、62.5、31.5、15.6 pg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液；在酶標(biāo)包被板上設(shè)置空白孔、標(biāo)準(zhǔn)品孔及待測(cè)樣品孔后上樣；封板膜封板后37 ℃溫育30 min；用洗滌液反復(fù)洗板5次后加入酶標(biāo)試劑，37 ℃溫育30 min，洗滌液再次洗板5次；分別加入顯色劑和終止液后上機(jī)檢測(cè)吸光度(A,450 nm波長(zhǎng))；根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品濃度和A值，采用CurveExpert 1.3軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(R=0.999 83)，并根據(jù)曲線方程式計(jì)算出各組肝組織中IL-22水平。

1.2.6 定量反轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR)測(cè)定JAK1、STAT3及SREBP-1c mRNA表達(dá) 稱取50～100 mg肝組織用TRIzol 提取總RNA。瓊脂糖凝膠電泳判斷RNA完整性。超微量分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA純度和濃度，測(cè)定值A(chǔ)260/A280>1.8，證明所提取的RNA純度好。RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。所用引物按參考文獻(xiàn)設(shè)計(jì)并在GenBank 進(jìn)行核對(duì)。β-actin引物：正義鏈5′-CTG AAC CCT AAG GCC AAC CG-3′；反義鏈5′-GAC CAG AGG CAT ACA GGG ACA A-3′。JAK1引物：正義鏈5′-GGA GGA GCA GAA TCC AGA CAT-3′；反義鏈5′-TCA ACC TTC CCA AAG TGA CC-3′。STAT3引物：正義鏈5′-CTG AGT GAG CGT GGG TGA T-3′；反義鏈5′-ACA GGC GGA CAG AAC ATA GG-3′。SREBP-1c引物：正義鏈5′-CGC TAC CGT TCC TCT ATC AAT G-3′；反義鏈5′-CGT TTC TAC CAC TTC AGG TTT CA-3′。qRT-PCR 反應(yīng)體系(20 μL)：SYBR Green 10 μL，雙蒸水(ddH2O)6 μL，Primer mix 2 μL，模板cDNA 2 μL。反應(yīng)條件：第1階段，50 ℃ 2 min；第2階段，95 ℃ 10 min；第3 階段，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)。結(jié)果判定：通過(guò)β-actin作為內(nèi)參照，比較目的基因與內(nèi)參基因的Ct值差異，從而對(duì)上述基因在各組中的表達(dá)進(jìn)行相對(duì)定量。

1.2.7 Western blot測(cè)定IL-22、JAK1、STAT3和SREBP-1c蛋白表達(dá) 抗原蛋白提取后進(jìn)行蛋白水平測(cè)定，取蛋白質(zhì)樣品30 μg，計(jì)算蛋白上樣量，8%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，轉(zhuǎn)膜(55 V，100 mA，90 min)，封閉(5 g脫脂奶粉+TBST 100 mL)，用IL-22抗體(1∶1 000)、JAK1抗體(1∶1 000)、STAT3抗體(1∶5 000)、SREBP-1c抗體(1∶1 000)4 ℃孵育過(guò)夜，二抗(1∶20 000)避光孵育2 h，電化學(xué)發(fā)光(ECL)曝光顯影，Gel Doc EQ凝膠成像儀掃描，ImageJ軟件分析結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 肝指數(shù)檢測(cè)結(jié)果MG的肝指數(shù)較NG明顯增加(P<0.01)，經(jīng)干預(yù)后BG、PG、BPG的肝指數(shù)較MG降低，且BPG的各指標(biāo)變化更為顯著(P<0.01)，見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠肝臟指數(shù)比較

a:P<0.01，與NG比較；b:P<0.01，與MG比較；c:P<0.01，與BPG組比較。

2.2 血清酶學(xué)指標(biāo)MG的ALT、AST較NG明顯增加(P<0.01)；BG、PG、BPG的轉(zhuǎn)氨酶較MG降低，且BPG的各指標(biāo)變化更為顯著(P<0.01)，見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠血清酶學(xué)ALT、AST比較

a:P<0.01，與NG比較；b:P<0.01，與MG比較；c:P<0.01，與BPG組比較。

2.3 血清血脂指標(biāo)MG的TG、TC及LDL較NG明顯增加，HDL明顯降低(P<0.01)；而B(niǎo)G、PG、BPG的TG、TC及LDL較MG降低，HDL升高，且BPG的各指標(biāo)變化更為顯著(P<0.01),見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠TG、TC、LDL、HDL比較

a:P<0.01，與NG比較；b:P<0.01，與MG比較；c:P<0.01，與BPG組比較。

2.4 大鼠肝臟組織形態(tài)學(xué)改變 光鏡下肝組織病理變化：HE染色提示NG大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)完整、清晰；中央靜脈大而壁薄，肝細(xì)胞索布于其周，呈放射狀，排列整齊，肝竇清晰可見(jiàn)，大小較一致，核結(jié)構(gòu)清晰可見(jiàn)，無(wú)脂肪變性；MG可見(jiàn)肝細(xì)胞腫脹程度明顯加重，呈中大泡性，微泡性脂肪變，肝細(xì)胞內(nèi)有粉紅色脂滴，伴氣球樣變，可見(jiàn)中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)；PG和BG肝細(xì)胞脂肪變性較MG明顯改善，但兩組間無(wú)明顯差別；BPG與BG、PG相比，肝細(xì)胞脂肪變明顯減少，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少，肝索結(jié)構(gòu)基本恢復(fù)。油紅染色：MG可見(jiàn)細(xì)胞質(zhì)廣泛染色，細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)明顯的紅色脂滴大量累積，部分脂滴融合變大，細(xì)胞邊緣模糊；PG和BG細(xì)胞質(zhì)紅染程度較MG減輕，但兩組間無(wú)明顯差別；BPG與BG、PG相比，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)紅色脂滴明顯減少，見(jiàn)圖1、2。

2.5NASH評(píng)價(jià)體系 根據(jù)美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院NASH臨床研究網(wǎng)病理委員會(huì)所訂指南對(duì)各組進(jìn)行NAS積分：MG的積分較NG明顯升高(P<0.01)；BG、PG和BPG的積分較MG明顯下降，且BPG積分下降更為顯著(P<0.01)，見(jiàn)表4。

2.6 在光學(xué)顯微鏡下選取10個(gè)視野檢測(cè)統(tǒng)計(jì)脂肪細(xì)胞數(shù)量及面積MG的細(xì)胞脂肪變性面積較NG增大(P<0.01)，通過(guò)干預(yù)后，BG、PG、BPG的脂肪變性面積較MG明顯縮小，且BPG更為明顯(P<0.01)，見(jiàn)表4。

2.7ELISA檢測(cè)肝組織中IL-22水平MG的IL-22蛋白水平較NG明顯降低(P<0.01)；經(jīng)藍(lán)莓、益生菌干預(yù)后BG、PG、BPG的IL-22水平較MG升高，且BPG變化更為顯著(P<0.01)，見(jiàn)表4。

表4 各組大鼠NAS評(píng)分、脂肪細(xì)胞大小及IL-22水平比較

a:P<0.01，與NG比較；b:P<0.01，與MG比較；c:P<0.01，與BPG組比較。

2.8JAK1、STAT3及SREBP-1cmRNA表達(dá) 與NG相比，MG的JAK1、STAT3的mRNA表達(dá)明顯降低，SREBP-1cmRNA明顯升高；經(jīng)干預(yù)后，與MG比較，BG、PG、BPG的JAK1、STAT3的mRNA升高，SREBP-1cmRNA降低，且BPG的各指標(biāo)變化更為顯著，見(jiàn)圖3。

2.9Westernblot檢測(cè)蛋白表達(dá)MG的IL-22、JAK1、STAT3蛋白表達(dá)較NG明顯降低，SREBP-1c的表達(dá)水平較NG升高(P<0.01)；BG、PG和BPG的IL-22、JAK1、STAT3表達(dá)較MG明顯升高，SREBP-1c的表達(dá)水平較MG降低，且BPG的改變更為明顯(P<0.01),見(jiàn)表5。

表5 各組大鼠肝組織中IL-22、JAK1、STAT3和SREBP-1c蛋白質(zhì)相對(duì)表達(dá)量

a:P<0.01，與NG比較；b:P<0.01，與MG比較；c:P<0.01，與BPG組比較。

A：NG;B:MG;C:BG;D:PG;E:BPG。

圖1 各組大鼠肝臟組織HE染色(×200)

A：NG;B:MG;C:BG;D:PG;E:BPG。

圖2 各組大鼠肝臟組織油紅染色(×200)

*:P<0.01，與NG比較；#:P<0.01，與MG比較；△:P<0.01，與BPG組比較。

圖3 各組大鼠mRNA表達(dá)結(jié)果

3 討 論

NAFLD被視為全球最常見(jiàn)的慢性肝病之一，并已成為危害公共健康的問(wèn)題。隨著疾病進(jìn)展可發(fā)展至肝硬化、肝癌。近年來(lái)免疫炎癥對(duì)NAFLD的影響逐漸受到重視，肝內(nèi)多種具有免疫功能的細(xì)胞受到細(xì)菌、病毒、藥物或其他一些代謝產(chǎn)物[如脂多糖(LPS)]刺激后，可通過(guò)LPS/Toll樣受體4(TLR4)信號(hào)通路下游的銜接分子MyD88誘導(dǎo)促炎因子[如IL-21、趨化因子-10(CXCL-10)]和抗炎因子(如IL-10)的產(chǎn)生。促炎因子激活相關(guān)信號(hào)通路上調(diào)SREBP-1c等具有脂肪合成功能的基因表達(dá)，導(dǎo)致肝細(xì)胞內(nèi)的TG和膽固醇聚集，而發(fā)生NAFLD。IL-22可由多種細(xì)胞分泌[如自然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)、輔助性T細(xì)胞淋巴細(xì)胞(Th)17、Th22等]，在控制細(xì)菌感染、穩(wěn)定內(nèi)環(huán)境和組織修復(fù)中起到重要作用[12]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，IL-22在多種肝臟疾病中起到保護(hù)作用，是重要的護(hù)肝因子，主要通過(guò)其受體IL-22發(fā)揮生物作用[13]。JAK1/STAT3信號(hào)通路參與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡及免疫調(diào)節(jié)的功能已有較多發(fā)現(xiàn)，主要由3個(gè)成分組成，即酪氨酸激酶相關(guān)受體、酪氨酸激酶JAK和轉(zhuǎn)錄因子STAT。JAK即JanusKinase，是一種非受體的酪氨酸蛋白激酶，成員有7個(gè)同源區(qū)，其中JAK1區(qū)為激酶區(qū)，其下游的效應(yīng)分子STAT3在整個(gè)信號(hào)通路中起到承上啟下的作用。當(dāng)JAK1激酶活化，可催化結(jié)合在受體上的STAT蛋白發(fā)生磷酸化修飾，并以二聚體形式進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)與靶基因結(jié)合，調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄。同時(shí)，細(xì)胞因子對(duì)激活STAT具有一定的選擇性，Yang等[14]的研究顯示，IL-22可通過(guò)激活STAT3通路下調(diào)TG合成的相關(guān)基因改善因肥胖所致的脂肪肝；Xiao等[15]通過(guò)IL-22治療乙醇誘導(dǎo)的肝損傷的研究發(fā)現(xiàn)，IL-22可通過(guò)其受體IL-22激活JAK1/STAT3信號(hào)通路，下調(diào)脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(FATP)的表達(dá)而達(dá)到治療目的，從而改善肝細(xì)胞脂肪變性[15]。綜上，IL-22對(duì)多種肝臟疾病有保護(hù)作用，本研究推測(cè)，由IL-22調(diào)控的JAK1/STAT3信號(hào)通路也參與了拮抗NAFLD。

通過(guò)飲食調(diào)節(jié)，從NAFLD的早期階段介入預(yù)防，早期控制，避免其進(jìn)展為終末期肝病具有重大意義。益生菌作為腸道微生態(tài)調(diào)節(jié)劑可用于NALFD的治療，以改善腸道微生態(tài)環(huán)境，減輕內(nèi)毒素血癥，從而減輕肝細(xì)胞炎癥，達(dá)到治療NAFLD的目的[16]。藍(lán)莓素有“漿果之王”的美稱，不僅是一種果品，更是一種具有保健功能的食品。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，藍(lán)莓富含花青素、類黃酮及多酚類等物質(zhì)，具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫、降血脂等功效[17]，且藍(lán)莓中的花青素能激活免疫系統(tǒng)，使免疫球蛋白不受自由基的侵害，激活巨噬細(xì)胞，增強(qiáng)人體的免疫力。本團(tuán)隊(duì)在前期研究中發(fā)現(xiàn)：藍(lán)莓對(duì)急性酒精性脂肪肝有保護(hù)作用[18]，其機(jī)制可能是藍(lán)莓能有效抑制腫瘤壞死因子α(TNF-α)，下調(diào)SREBP-1c的表達(dá)，合理改善脂代謝，減少脂質(zhì)沉積于肝臟。相關(guān)的報(bào)道也顯示：藍(lán)莓對(duì)益生菌的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用[19]；同時(shí)，益生菌能增強(qiáng)藍(lán)莓的生物活性，二者有協(xié)調(diào)作用[20]。

基于上述研究，本實(shí)驗(yàn)將藍(lán)莓與益生菌聯(lián)合運(yùn)用，觀察二者的協(xié)同效應(yīng)對(duì)IL-22調(diào)控的JAK1/STAT3信號(hào)通路的影響，從而探明藍(lán)莓益生菌改善NAFLD的作用機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)：HE染色可見(jiàn)BPG的肝細(xì)胞脂肪變性程度較MG明顯降低，油紅染色可見(jiàn)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)紅色脂滴較MG明顯減少，脂肪細(xì)胞面積測(cè)定值下降明顯(P<0.01)；肝臟指數(shù)、ALT、AST、TG、TC、LDL均較MG、BG、PG明顯降低，HDL明顯升高(P<0.01)，但BG與PG差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；通過(guò)參照美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院制訂的NAFLD活動(dòng)度積分表得出BPG的NAS評(píng)分較其余各組明顯下降，說(shuō)明藍(lán)莓益生菌具有顯著的拮抗肝細(xì)胞脂肪變性、改善脂質(zhì)代謝、減輕肝細(xì)胞炎癥的作用。通過(guò)對(duì)IL-22、JAK1、STAT3及SREBP-1c進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：BPG的IL-22、JAK1、STAT3的表達(dá)均明顯高于MG、BG和PG(P<0.01)，但單獨(dú)使用藍(lán)莓或益生菌的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。不難看出，JAK1、STAT3的變化與IL-22一致，呈正相關(guān)。SREBP-1c是影響肝臟脂質(zhì)合成的重要轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，其活性調(diào)節(jié)與脂肪肝的發(fā)病相關(guān)，Radaeva等[21]發(fā)現(xiàn)，IL-22激活STAT3信號(hào)通路可上調(diào)抗凋亡基因、抗氧化應(yīng)激基因的表達(dá)，下調(diào)脂肪生成基因表達(dá)(如SREBP-1c)，以達(dá)到改善脂肪肝的目的。而本研究也發(fā)現(xiàn)，MG的SREBP-1c較NG明顯升高，經(jīng)藍(lán)莓和益生菌干預(yù)以后，SREBP-1c的表達(dá)逐漸降低，BPG降低更為明顯(P<0.01)，說(shuō)明藍(lán)莓與益生菌聯(lián)合改善脂代謝的作用較單獨(dú)運(yùn)用藍(lán)莓或益生菌強(qiáng)，并且SREBP-1c表達(dá)隨著IL-22、JAK1、STAT3的增加而減少，呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。

綜上所述，實(shí)驗(yàn)證實(shí)了本研究推測(cè)是合理的，其改善NAFLD的作用機(jī)制可能是藍(lán)莓與益生菌聯(lián)合，增強(qiáng)了彼此的生物學(xué)活性，抑制炎性因子對(duì)肝細(xì)胞的損傷，同時(shí)增加肝臟IL-22的表達(dá)，IL-22選擇性的激活JAK1/STAT3信號(hào)通路，下調(diào)SREBP-1c表達(dá)，減少TG及膽固醇沉積于肝臟，改善肝細(xì)胞炎癥及脂肪變性。但二者對(duì)NAFLD更深層次的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

[1]LoombaR,SanyalAJ.TheglobalNAFLDepidemic[J].NatRevGastroenterolHepatol,2013,10(11):686-690.

[2]ChestovichPJ,UchidaY,ChangW,etal.Interleukin-22:implicationsforliverischemia-reperfusioninjury[J].Transplantation,2012,93(5):485-492.

[3]BinG,SungHK,OygiP,etal.Interleukin-22treatmentamelioratesalcoholicliverinjuryinamurinemodelofchronic-bingeethanolfeeding:roleofSTAT3[J].Hepatology,2010,52(4):1291-1300.

[4]ChalasaniN,YounossiZ,LavineJE,etal.Diagnosisandmanagementofnon-alcoholicfattyliverdisease:practiceGuidelinebytheAmericanAssociationfortheStudyofLiverDiseases,AmericanCollegeofGastroenterology,andtheAmericanGastroenterologicalAssociation[J].Hepatology,2012,55(6):2005-2023.

[5]EslamparastT,PoustchiH,ZamaniF,etal.Synbioticsupplementationinnonalcoholicfattyliverdisease:arandomized,double-blind,placebo-controlledpilotstudy[J].AmJClinNutr,2014,99(3):535-542.

[6]WangY,ChengM,ZhangB,etal.Dietarysupplementationofblueberryjuiceenhanceshepaticexpressionofmetallothioneinandattenuatesliverfibrosisinrats[J].PLoSOne,2013,8(3)e58659.

[7]RenT,HuangC,ChengM.DietaryblueberryandbifidobacteriaattenuatenonalcoholicfattyliverdiseaseinratsbyaffectingSIRT1-mediatedsignalingpathway[J].OxidMedCellLongev,2014:465059.

[8]CanoA,CiaffoniF,SafwatGM,etal.HepaticVLDLassemblyisdisturbedinaratmodelofnonalcoholicfattyliverdisease:istherearolefordietarycoenzymeQ[J].JApplPhysiol,2009,107(3):707-717.

[9]文光琴,聶飛,方品武.藍(lán)莓果實(shí)理化成分含量比較分析與功能評(píng)價(jià)[J].北方園藝,2012，36(13):27-30.

[10]OsmanN,AdawiD,AhrnéS,etal.Endotoxin-andD-galactosamine-inducedliverinjuryimprovedbytheadministrationoflactobacillus,bifidobacteriumandblueberry[J].DigLiverDis,2007,39(9):849-856.

[11]ZengMD,FanJG,LuLG,etal.Guidelinesforthediagnosisandtreatmentofnonalcoholicfattyliverdiseases[J].JDigDis,2008,9(3):108-112.

[12]ChunXP,JieT,XiaoYW,etal.Roleofinterleukin-22inliverdiseases[J].InflammRes,2014,63(7):519-525.

[13]ChestovichPJ,UchidaY,ChangW,etal.Interleukin-22:implicationsforliverischemia-reperfusioninjury[J].Transplantation,2012,93(5):485-492.

[14]YangL,ZhangY,WangL,etal.Ameliorationofhighfatdietinducedliverlipogenesisandhepaticsteatosisbyinterleukin-22[J].JHepatol,2010,53(2):339-347.

[15]XiaoNK,DeCF,StephanieM,etal.Hepatoprotectiveandanti-fibroticfunctionsofinterleukin-22:therapeuticpotentialforthetreatmentofalcoholicliverdisease[J].JGastroenterolHepatol,2013,28(1):56-60.

[16]EslamparastT,PoustchiH,ZamaniF,etal.Synbioticsupplementationinnonalcoholicfattyliverdisease:arandomized,double-blind,placebo-controlledpilotstudy[J].AmJClinNutr,2014,99(3):535-542.

[17]FernandesI,MarquesF,FreitasVD,etal.Antioxidantandanti-proliferativepropertiesofmethylatedmetabolitesofanthocyanins[J].FoodChemistry,2013,141(3):2923-2933.

[18]趙雪珂,吳榮敏,姚玉梅,等.藍(lán)莓對(duì)小鼠急性酒精性脂肪肝TNF-α-R1和SREBP-1c影響的初步研究[J].重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2015,20(3):43-46.

[19]劉奕煒,周方,郝建新,等.藍(lán)莓汁及其提取物對(duì)嗜酸乳桿菌NCFM體外生長(zhǎng)的影響[J].中國(guó)乳品工業(yè),2013,41(2):13-16.

[20]BranningC,HakanssonA,AhrneS,etal.Blueberryhusksandmulti-strainprobioticsaffectclolnicfermentationinrats[J].BrJNutr,2009,101(6):859-870.

[21]RadaevaS,SunR,PanHN,etal.Interleukin22 (IL-22)playsaprotectiveroleinTcell-mediatedmurinehepatitis:IL-22isasurvivalfactorforhepatocytesviaSTAT3activation[J].Hepatology,2004,39(6):1332-1342.

Study on effect of blueberry probiotics for improving non-alcoholic fatty liver disease by influencing IL-22/JAK1/STAT3 signaling pathway*

ZhuJuanjuan,ChengMingliang△,RenTingting,ZhouMingyu

(DepartmentofInfection,AffiliatedHospitalofGuizhouMedicalUniversity,Guiyang,Guizhou550001,China)

Objective To study the effect of blueberry probiotics on interlukin-22(IL-22) mediated Janus kinase-1(JAK1)/ signal transducer and activator of transcription 3(STAT3) signaling pathway,and to further explore the potential mechanisms to improve non-alcoholic fatty liver disease(NAFLD).Methods Forty clean grade rats were divided into the normal control group(NG),model group(MG),blueberry group(BG),probiotics group(PG) and blueberry plus probiotics group(BPG).Except for the NG group(100% general diet),the fat liver model in the other groups was prepared by 12-week complex high fat diet.After the model establishment,the remained rats were divided into BG,PG and BPG groups for conducting 8-week observation.Results The liver index,alanine aminotransferase(ALT),aspartate aminotransferase(AST),triglyceride(TG),total cholesterol(TC) and low density lipoprotein(LDL) in the BPG group were significantly decreased compared with the MG,BG and PG groups(P<0.01)and high density lipoprotein (HDL)was significantly increased(P<0.01);in IL-22 detected by the enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA):the protein level in the BPG group was significantly higher than that in the MG,BG and PG groups(P<0.01);in the quantificational reverse transcription-polymerase chain reaction(qRT-PCR):the expressions of JAK1 and STAT3 in the BPG group were significantly increased compared with the MG,BG and PG groups(P<0.01),while cholesterol regulatory element-binding protein-1c(SREBP-1c) expression in the BPG group was significantly decreased(P<0.01);in Western blot(WB):the expressions of IL-22,JAK1 and STAT3 in the BPG group were significantly higher than those in the MG,BG and PG groups,while the expression of SREBP-1c was significantly declined(P<0.01).Conclusion Blueberry probiotics could effectively ameliorate the pathological tissue structure of NAFLD,attenuates hepatocyte steatosis,its mechanism may be that blueberry probiotics could increase expression of IL-22,activates the downstream signaling pathway of JAK1/STAT3,down-regulates the SREBP-1c gene expression and inhibits SREBP-1c role,enhances cholesterol metabolism,attenuates lipid deposit in liver,which may be an adjuvant scheme to treat NAFLD.

blueberry;probiotics;interleukin-22;JAK1;STAT3;non-alcoholic fatty liver

??·基礎(chǔ)研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.02.004

貴州省科技廳社會(huì)攻關(guān)資助項(xiàng)目(黔科合SY[2010]3017號(hào))；黔東南苗族侗族自治州林業(yè)局科研基金資助項(xiàng)目(ZLYJZFCG-2012-7);貴州省衛(wèi)計(jì)委科技項(xiàng)目(gzwjkj2016-1-02)。

祝娟娟(1983-)，主治醫(yī)師，碩士，主要從事肝臟代謝性疾病方面研究?！?/p>

E-mail：chengml@21cn.com。

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A

1671-8348(2017)02-0156-05

2016-07-12

2016-09-12)