半胱氨酰白三烯受體1在胰腺癌組織中的表達及臨床意義

孟 艷， 朱 瑩, 張亞慶, 鄒凌云, 張秋楠

(1 葫蘆島市中心醫(yī)院龍灣院區(qū) 急診科， 遼寧 葫蘆島125001；2 葫蘆島市中心醫(yī)院 消化科， 遼寧 葫蘆島125001)

半胱氨酰白三烯受體1在胰腺癌組織中的表達及臨床意義

孟 艷1， 朱 瑩2, 張亞慶2, 鄒凌云2, 張秋楠2

(1 葫蘆島市中心醫(yī)院龍灣院區(qū) 急診科， 遼寧 葫蘆島125001；2 葫蘆島市中心醫(yī)院 消化科， 遼寧 葫蘆島125001)

目的 探討半胱氨酰白三烯受體(CysLTR)1在胰腺癌組織中的表達及其與臨床特征和預后的關系。方法 選取2015年1月-10月葫蘆島中心醫(yī)院收治的病理確診為胰腺癌的患者42例，收集癌組織及癌旁組織，采用real-time PCR檢測組織CysLTR-1 mRNA相對表達量，并對患者隨訪1年。計量資料兩組間比較采用t檢驗；多組間比較采用方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。胰腺癌患者預后的影響因素采用多因素logistic回歸分析。結果 癌組織中CysLTR-1 mRNA相對表達量高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學意義(0.037 1±0.020 5 vs 0.016 8±0.011 4，t=6.58，P<0.001)；CysLTR-1 mRNA相對表達量與患者的TNM分期(t=2.731，P=0.009)、分化程度(F=10.537，P<0.001)和淋巴結轉移相關(t=3.408，P=0.002)。隨訪期內死亡17例，存活25例；死亡患者CysLTR-1 mRNA相對表達量高于存活患者(0.045 6±0.021 7 vs 0.031 3±0.019 8)，差異有統(tǒng)計學意義(t=2.21，P=0.03)。logistic回歸分析顯示，TNM分期[比值比(OR)=6.92，95%可信區(qū)間(95%CI)：1.30～36.82，P=0.02]、分化程度(OR=5.71，95%CI：1.44～22.62，P=0.01)以及淋巴結轉移(OR=9.62，95%CI：2.23～41.46，P<0.001)是影響胰腺癌預后的危險因素；控制患者年齡、性別、TNM分期、腫瘤分化程度、腫瘤發(fā)生部位及淋巴結轉移等因素后，CysLTR-1 mRNA表達量仍是影響患者預后的危險因素(OR=1.11，95%CI：1.07～1.15，P=0.03)。結論 CysLTR-1參與胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展過程，可作為判斷胰腺癌預后的分子標志物。

胰腺腫瘤； 受體， 白三烯； 腫瘤標記， 生物學

胰腺癌發(fā)病率在世界范圍內逐年升高。全球疾病負擔調查顯示，從1990年到2013年，胰腺癌死亡率從18.6/10萬增加至35.2/10萬，死亡率上升47%[1]。我國胰腺癌2015年發(fā)病率為9/10萬，死亡率高達7.9/10萬[2]。由于胰腺癌發(fā)病隱匿，病情進展迅速，5年生存率不足5%[3]。胰腺癌的病因及發(fā)病機制尚不明確，但研究[4]證實炎癥在胰腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要的作用。半胱氨酰白三烯(cysteinyl leukotriene，CysLT)與其G蛋白偶聯受體共同參與炎癥反應，現已有研究[5-6]證實半胱氨酰白三烯受體(cysteinyl lenkotriene receptor，CysLTR)1在乳腺癌及大腸癌組織中表達上調，但國內目前尚無CysLTR-1在胰腺癌組織中表達的相關報道。故本研究探討胰腺癌組織中CysLTR-1 mRNA的表達及其與臨床特征和預后的關系，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 研究對象 收集2015年1月-10月于葫蘆島市中心醫(yī)院行手術治療的胰腺癌患者。納入標準：(1)所有患者術后病理證實為胰腺癌；(2)患者無其他惡性腫瘤病史；(3)術前無放療、化療等其他治療；(4)取得胰腺癌及癌旁組織標本；(5)患者均知情同意。胰腺癌患者經全面檢查，若無禁忌證，首選手術治療(Whipple手術)。能切除者應盡量切除腫瘤及相關淋巴結；不能切除者則行姑息性手術治療，如膽腸吻合術。所有患者術后均隨訪，隨訪截止日期為2016年8月。

1.2 主要儀器 -80 ℃超低溫冰箱、NanoDrop 2000分光光度計、紫外凝膠成像分析儀、超速冷凍臺式離心機、普通PCR擴增儀、GeneAmp PCR System9700擴增儀、熒光定量Roche LC480 PCR儀、電泳槽、移液器、電泳儀、離心管、電子分析天平等。

1.3 主要試劑 總RNA提取試劑盒、Real-time PCR試劑盒、PCR引物、瓊脂糖、焦炭酸二乙酯、溴化乙錠、DNA ladder marker、蒸餾水、無水乙醇、液氮、異丙醇等。

1.4 研究方法

1.4.1 總RNA提取 從-80 ℃超低溫冰箱取出20 mg癌組織及癌旁組織，按照總RNA提取試劑盒說明書進行操作，并加入少量焦炭酸二乙酯進行溶解。

1.4.2 RNA純度及濃度測定 取上述1 μl熱變性總RNA，采用1%瓊脂糖凝膠電泳方法測定RNA完整性，對有DNA污染的RNA采用DNaseⅠ進行相應處理。取1 μl上述總RNA，采用分光光度計測定光密度(OD)值，即OD160/OD280，比值為1.8～2.0提示RNA無降解，同時測定RNA濃度，并進行濃度調制。

1.4.3 逆轉錄cDNA合成 所有步驟均按照real-time PCR試劑盒說明書進行操作。(1)去除基因組DNA反應：冰上配置10 μl A反應體系(總RNA、gDNA Eraser、Buffer和RNase Free dH2O)，置于普通PCR擴增儀，42 ℃，2 min。(2)逆轉錄反應：冰上配置10 μl B反應體系(RT Primer MixⅠ、Buffer、PrimeScriptRT Enzyme MixⅠ和RNase Free dH2O)，混合反應體系A和B，置于基因擴增儀，37 ℃，15 min，85 ℃，5 s。(3)CysLTR-1及內參GAPDH引物：上海Invitrogen公司完成引物的設計及合成。CysLTR-1上游引物：5′-GCACCATTGCTTTGTATCTCAACC-3′，下游引物：5′-ATACCTAACGACACATACCAACC-3′，擴增基因145 bp。內參GAPDH上游引物：5′-GCTCCTCTATGTATGTCGTGA-3′，下游引物為5′-ACCTCCGGCCATGGTGTCTGA-3′，擴增基因80 bp。(4)PCR擴增：配置20 μl反應體系(cDNA、dNTP、Buffer、上下游引物、Tag DNA聚合酶和雙氧水)。CysLTR-1 PCR反應溫度：預熱95 ℃、變性95 ℃、退火60 ℃、延伸72 ℃和4 ℃，反應時間分別為30 s、10 s、1 min、10 min和30 min，共循環(huán)30次。GAPDH內參PCR反應溫度：預熱95 ℃、變性95 ℃、退火50 ℃、延伸72 ℃和4 ℃，反應時間分別為5 min、30 s、30 s、10 min和30 min，共循環(huán)30次。

2 結果

2.1 一般資料 共納入胰腺癌患者42例，其中男31例，女11例，年齡38～77歲，平均(61.25±13.78)歲。納入患者中26例腫瘤發(fā)生在胰頭，14例發(fā)生在胰體，2例發(fā)生在胰尾。隨訪期內死亡17例，存活25例，且隨訪時間均滿1年。

2.2 CysLTR-1 mRNA相對表達量的比較 癌旁組織中CysLTR-1 mRNA相對表達量為0.016 8±0.011 4，癌組織中的CysLTR-1 mRNA相對表達量為0.037 1±0.020 5，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義(t=6.58,P<0.001)。

2.3 CysLTR-1 mRNA相對表達量與臨床特征的關系胰腺癌組織CysLTR-1 mRNA相對表達量與TNM分期、分化程度和淋巴結轉移相關(P值均<0.05)(表1)。

表1 胰腺癌組織中的CysLTR-1 mRNA相對表達量與臨床特征的關系

注：與高分化程度比較，1)P<0.05；與中分化程度比較，2)P<0.05

2.4 CysLTR-1 mRNA相對表達量與生存狀態(tài)的關系 42例患者隨訪1年內死亡17例，病死率為40.5%。死亡患者CysLTR-1 mRNA相對表達量為0.045 6±0.021 7，高于生存患者的CysLTR-1 mRNA相對表達量(0.031 3±0.019 8)，差異有統(tǒng)計學意義(t=2.21,P=0.03)。

2.5 影響胰腺癌預后的多因素分析 經logistic回歸分析發(fā)現，TNM分期、分化程度以及淋巴結轉移是影響胰腺癌預后的危險因素(P值均<0.05);控制其他因素后，CysTLR-1 mRNA仍然是影響胰腺癌預后的危險因素(P<0.05)(表2)。

表2 影響胰腺癌預后的logistic回歸分析

注：由于高分化無死亡病例，故合并高、中分化

3 討論

胰腺癌是惡性程度較高的消化道腫瘤，95%的胰腺癌為導管細胞腺癌。外科手術仍是目前治療胰腺癌的唯一有效方法[7-8]。東北地區(qū)胰腺癌標化病死率顯著高于華北、華中、華南等地區(qū)。胰腺癌的病因及發(fā)病機制尚不明確，其發(fā)生發(fā)展是遺傳因素、環(huán)境因素以及疾病因素等相互作用的結果。研究[4]發(fā)現炎癥如胰腺炎、膽管炎等是胰腺癌發(fā)生的危險因素。CysLTs是一系列炎癥介質，包括LTC4、LTE4和LTD4，由花生四烯酸和5-脂氧合酶途徑代謝產生，C-6位上含有半胱氨酸殘基及硫酯肽鍵是他們的共同特點。CysLT通過其特異的G蛋白偶聯受體(GysLTR-1、GysLTR-2)共同參與生物學作用，如炎癥反應、血管平滑肌反應、免疫反應以及組織修復等。

CysLT及其受體不僅在哮喘、心血管疾病、腦損傷等方面起著重要作用，同時，研究[5-6]發(fā)現CysLTR(GysLTR-1)在多種腫瘤中表達上調。早在2002年，國外學者Hennig等[9]檢測人胰腺癌組織，發(fā)現CysTL的兩種受體表達量與正常胰腺組織相比，均顯著升高。王欣等[10]通過real-time PCR檢測90例乳腺癌組織，發(fā)現乳腺癌組織中的CysLTR-1基因表達量顯著高于癌旁組織，且與腫瘤大小、TNM分期、組織學類型及淋巴結轉移呈正相關；CysLTR-1 mRNA高表達患者的生存率顯著低于低表達患者。張世強等[11]采用免疫組化法檢測大腸癌組織、癌旁組織和腺瘤性息肉組織，發(fā)現CysLTR-1陽性表達率顯著高于癌旁組織和腺瘤性息肉，且與腫瘤大小、臨床分期、淋巴結轉移和組織學分級有關。

本研究發(fā)現胰腺癌組織中CysTLR-1 mRNA相對表達量顯著高于癌旁組織，且CysTLR-1 mRNA相對表達量與TNM分期、腫瘤分化程度以及淋巴結轉移相關，即TNM分期越高、腫瘤分化程度越低以及有淋巴結轉移組織中的CysLTR-1 mRNA相對表達量顯著升高。同時對1年內不同存活狀態(tài)的患者進行比較，發(fā)現死亡患者的CysLTR-1 mRNA相對表達量顯著高于存活者，提示CysTLR-1能促進腫瘤細胞的增殖和擴散，從而影響患者預后。經多因素分析發(fā)現，控制患者年齡、性別、TNM分期、腫瘤分化程度、腫瘤發(fā)生部位及淋巴結轉移等因素，CysTLR-1 mRNA仍然是影響患者預后的危險因素。這與王欣等[10]和張世強等[11]的研究結果類似。腫瘤細胞的CysLTR分布密集，LTD4激活CysLTR-1，激活β-連環(huán)蛋白信號，從而提高TCF/LEF啟動子活性，促進腫瘤增殖[12]。編碼CysLTR-1基因位于X染色體的q13-21區(qū)，DNA編碼337個氨基酸，多以二聚體或多聚體形式存在。CysLTR-1通過誘導上皮細胞分泌生長因子、介導炎性介質生成，破壞細胞正常微環(huán)境，促使腫瘤細胞擴散。Ding等[13]在胰腺癌細胞系中通過合用環(huán)氧合酶2和5-脂氧合酶抑制劑，有效抑制胰腺癌細胞的CysTLR表達及血管生長因子，提示CysTLR促腫瘤增殖效應可被相應的受體拮抗劑所阻斷，通過損傷CysLTR-1信號通路，引起腫瘤細胞凋亡。因此筆者認為CysLTR-1表達與胰腺癌的發(fā)生發(fā)展及預后具有重要聯系。

綜上所述，CysTLR-1 mRNA在胰腺癌組織中表達增高，且CysTLR-1表達量與患者的預后有關，可作為判斷胰腺癌預后的分子標志物。

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(本文編輯：葛 俊)

Expression of cysteinyl leukotriene receptor-1 in pancreatic cancer tissue and its clinical significance

MENGYan,ZHUYing,ZHANGYaqing,etal.

(EmergencyDepartment,LongwanBranchofCentralHospitalofHuludao,Huludao,Liaoning125001,China)

Objective To investigate the expression of cysteinyl leukotriene receptor-1 (CysLTR-1) in pancreatic cancer tissue and its association with clinical features and prognosis. Methods A total of 42 patients with pathologically confirmed pancreatic cancer who were admitted to Central Hospital of Huludao from January to October, 2015 were enrolled, and cancer and adjacent tissues were collected. Real-time PCR was used to measure the relative mRNA expression of CysLTR-1 in these tissues, and the patients were followed up for 1 year. Thet-test was used for comparison of continuous data between groups; an analysis of variance was used for comparison between multiple groups, and the least significant differencet-test was used for comparison between any two groups. The multivariate logistic regression analysis was used to determine influential factors for the prognosis of patients with pancreatic cancer. Results The cancer tissues had significantly higher relative mRNA expression of CysLTR-1 than adjacent tissues (0.037 1±0.020 5 vs 0.016 8±0.011 4,t=6.58,P<0.001). The relative mRNA expression of CysLTR-1 was associated with TNM stage (t=2.731,P=0.009), degree of tumor differentiation (F=10.537,P<0.001), and lymph node metastasis (t=3.408,P=0.002). During the 1-year follow-up, 17 patients died and 25 survived; the patients who died had significantly higher relative mRNA expression of CysLTR-1 than those who survived (0.045 6±0.021 7 vs 0.031 3±0.019 8,t=2.21,P=0.03). The logistic regression analysis showed that TNM stage (OR=6.92, 95%CI: 1.30-36.82,P=0.02), degree of tumor differentiation (OR=5.71, 95%CI: 1.44-22.62,P=0.01), and lymph node metastasis (OR=9.62, 95%CI: 2.23-41.46,P<0.001) were prognostic factors for pancreatic cancer. After adjustment for age, sex, TNM stage, degree of tumor differentiation, tumor location, and lymph node metastasis, the mRNA expression of CysLTR-1 was still a prognostic factor for patientswith pancreatic cancer (OR=1.11, 95%CI: 1.07-1.15,P=0.03). Conclusion CysLTR-1 is involved in the development and progression of pancreatic cancer and can be used as a new molecular marker for prognostic evaluation in patients with pancreatic cancer.

pancreatic neoplasms； receptors， leukotriene； tumor markers， biological

10.3969/j.issn.1001-5256.2017.01.029

2016-09-06；

2016-09-20。

孟艷(1980-)，女，主治醫(yī)師，主要從事胰腺癌、肝纖維化的診治研究。

R735.9

A

1001-5256(2017)01-0133-04