冬凌草活性成分KY3對食管癌EC109 細胞增殖的抑制作用*

方 莉，王賽琪，陳雪梅，薛博涵，王冠濤，李玉萍，劉宏民#

1)鄭州大學(xué)醫(yī)院檢驗科 鄭州 450001 2)鄭州大學(xué)藥學(xué)院 鄭州 450001 3)鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)系 鄭州 450001

冬凌草活性成分KY3對食管癌EC109 細胞增殖的抑制作用*

方 莉1)，王賽琪2)，陳雪梅3)，薛博涵3)，王冠濤3)，李玉萍3)，劉宏民2)#

1)鄭州大學(xué)醫(yī)院檢驗科 鄭州 450001 2)鄭州大學(xué)藥學(xué)院 鄭州 450001 3)鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)系 鄭州 450001

#通信作者，男，1960年3月生，博士，教授，研究方向：藥物化學(xué)，E-mail:liuhm@zzu.edu.cn

EC109細胞；凋亡；周期阻滯；KY3

目的：探討冬凌草活性成分KY3對食管癌細胞EC109增殖的抑制作用及其機制。方法：MTT法測定0、10、20、30、40、60、80、100 μmol/L KY3對EC109細胞增殖的影響；流式細胞術(shù)檢測0、10、20、30 μmol/L KY3對EC109細胞凋亡和細胞周期分布的影響，免疫熒光法觀察KY3對EC109細胞中微管結(jié)構(gòu)的影響，Hoechst 33258染色觀察KY3作用后EC109細胞核的形態(tài)。結(jié)果：KY3能夠抑制EC109細胞的體外增殖；KY3處理后EC109細胞周期阻滯在G2/M期并發(fā)生凋亡(P<0.05)；KY3作用于EC109細胞后，微管遭到破壞，隨著KY3劑量的增加，α-微管蛋白逐漸發(fā)生降解并出現(xiàn)細胞核固縮、濃染等典型的凋亡形態(tài)。結(jié)論：冬凌草活性成分KY3在體外對EC109細胞具有增殖抑制作用，其機制可能與破壞細胞微管結(jié)構(gòu)、G2/M期細胞周期阻滯及誘導(dǎo)細胞凋亡有關(guān)。

食管癌是發(fā)生于食管上皮組織的常見消化系統(tǒng)腫瘤，分為腺癌和鱗狀細胞癌,在世界范圍內(nèi)發(fā)病率位居惡性腫瘤第8位，主要流行于發(fā)展中國家。我國食管癌發(fā)病率和病死率均居世界首位，其中河南、山西、河北等太行山以南的一些省份是食管鱗狀細胞癌的高發(fā)地區(qū)[1]。冬凌草，又名冰凌草，系唇形科香茶菜屬多年生草本植物，具有抗腫瘤、抗突變、抗菌抗炎、抗氧化等多種藥理作用，其主要成分是貝殼杉烷型二萜類化合物[2]。冬凌草的主要成分冬凌草甲素被證實對多種腫瘤細胞具有體內(nèi)外增殖抑制作用[3-6]，包括食管癌、結(jié)腸癌、胃癌、肝癌、卵巢癌、宮頸癌等。最近，作者所在的課題組從冬凌草中分離得到一種結(jié)構(gòu)全新的貝殼杉烷型二萜類化合物KY3，該研究旨在探索KY3對食管癌EC109細胞體外增殖的影響及其分子學(xué)機制。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 KY3由鄭州大學(xué)新藥研究開發(fā)中心提供，RPMI 1640培養(yǎng)基和胎牛血清均為Thermo Scientific HyClone公司產(chǎn)品。兔抗α-微管蛋白多克隆IgG抗體購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，Alexa Fluor 488標記山羊抗兔IgG購自Jackson 公司，Annexin V-FITC/PI雙染凋亡檢測試劑盒購自凱基生物有限公司，MTT、PI等購自Sigma公司，RNase A購自索萊寶科技有限公司，Hoechst 33258購自西安沃爾森生物技術(shù)有限公司。

1.2 細胞培養(yǎng) EC109細胞購自中國科學(xué)院上海細胞庫，用含體積分數(shù)10%胎牛血清、100 kU/L青霉素、100 mg/L 鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液在體積分數(shù)5% CO2、37 ℃、飽和濕度條件下培養(yǎng)，取對數(shù)期生長的細胞進行實驗。

1.3 MTT法測定細胞生存率[7-8]2.5 g/L胰蛋白酶消化后收集細胞，吹打成單細胞懸液，將細胞密度調(diào)整為2.0×105mL-1并接種于96孔板，每孔200 μL，待細胞貼壁后棄上清，加入含不同濃度(0、10、20、30、40、60、80、100 μmol/L)KY3的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24、48或72 h。藥物作用結(jié)束后每孔加入5 g/L MTT 溶液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄上清，每孔加入DMSO 150 μL，振蕩10 min，酶標儀檢測570 nm 波長處各孔吸光度(A)值，計算細胞生存率。細胞生存率=A給藥組/A對照組×100%。每組設(shè)6個平行孔，實驗重復(fù)3次。將細胞生存率數(shù)據(jù)輸入SPSS 17.0，采用回歸分析計算半數(shù)抑制濃度(IC50)。

1.4 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡[9]消化、收集對數(shù)期生長的EC109細胞，制成單細胞懸液，計數(shù)后按1.0×105/孔接種于6孔板，培養(yǎng)24 h后棄去培養(yǎng)基，加入含不同濃度(0、10、20、30 μmol/L)KY3的新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。24 h后，消化、收集細胞，4 ℃預(yù)冷PBS洗滌2次，按試劑盒說明書進行操作：加入500 μL Binding Buffer 重懸細胞，加入5 μL Annexin V-FITC，混勻后室溫、避光染色15 min，再加入5 μL PI，室溫、避光染色5 min后上流式細胞儀檢測細胞早期和晚期凋亡率[10]。每組設(shè)2個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次。

1.5 流式細胞術(shù)檢測細胞周期 消化、收集對數(shù)生長期的EC109細胞，制成單細胞懸液，計數(shù)后按1.0×105/孔接種于6孔板，培養(yǎng)24 h后棄去培養(yǎng)基，PBS洗滌1次后加入含不同濃度(0、10、20、30 μmol/L)KY3的新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。10 h后消化、收集細胞，4 ℃預(yù)冷PBS洗滌2次，體積分數(shù)70%乙醇4 ℃固定過夜。預(yù)冷PBS洗滌2次，加入PI染液，室溫避光染色30 min 后上機檢測。每組設(shè)2個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次。

1.6 免疫熒光法檢測α-微管蛋白 消化、收集細胞，制成單細胞懸液，接種于含有蓋玻片的24孔板中，培養(yǎng)24 h后棄去培養(yǎng)基，加入含有不同濃度(0、10、20、30 μmol/L)KY3的新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)20 h后取出細胞爬片，PBS洗滌3次，40 g/L多聚甲醛固定20 min，PBS洗滌3次，體積分數(shù)0.1% Triton X-100通透10 min，PBS洗滌3次，體積分數(shù)5%胎牛血清室溫封閉1 h。兔抗α-微管蛋白多克隆抗體4 ℃孵育過夜，PBS洗滌3次，Alexa Fluor 488標記的山羊抗兔IgG二抗室溫孵育2 h，PBS洗滌3次，Hoechest 33258染液(10 mg/L)染色15 min，滴加抗淬滅劑封片后共聚焦顯微鏡下觀察。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 17.0進行數(shù)據(jù)分析，不同組間凋亡率、細胞周期分布情況及不同時間KY3的IC50的比較均采用單因素方差分析和SNK-q檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 KY3對EC109細胞增殖的抑制作用 結(jié)果見圖1。由圖1可知，隨著KY3濃度的增加和干預(yù)時間的延長，EC109細胞生存率不斷下降，即KY3在體外對EC109細胞具有增殖抑制作用。24、48、72 h的IC50分別為(31.01±1.49)、(14.70±1.17)、(4.10±0.61) μmol/L(F=284.200,P<0.001)。

圖1 KY3對EC109細胞增殖的抑制作用

2.2 KY3誘導(dǎo)EC109細胞凋亡 各組細胞凋亡率的比較見表1。由表1可知，20、30 μmol/L KY3組細胞早期凋亡率和晚期凋亡率均高于0 μmol/L KY3組。

2.3 KY3對EC109細胞周期的影響 結(jié)果見表2。由表2可知，30 μmol/L KY3處理EC109細胞后，G0/G1期細胞增多，S期細胞減少，G2/M期細胞增多，與0 μmol/L KY3組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.4 KY3對EC109細胞微管的影響 KY3處理EC109細胞后用免疫熒光法檢測α-微管蛋白表達情況，Hoechst 33258染色檢測細胞核形態(tài)，結(jié)果見圖2。由圖2可知，正常細胞微管呈均勻、規(guī)律的絲狀，以輻射狀排列在整個細胞中，支撐細胞形狀；10 μmol/L KY3處理細胞后，微管骨架遭到破壞、絲狀微管消失，細胞萎縮呈圓形；當KY3的濃度增加到20 μmol/L時，α-微管蛋白的綠色熒光信號開始減弱；當KY3的濃度增加到30 μmol/L時，α-微管蛋白信號明顯減弱，大量α-微管蛋白降解，同時細胞核開始固縮、濃染，細胞發(fā)生凋亡。在凋亡的細胞中，殘存的α-微管蛋白僅分布在細胞核周圍，而在未發(fā)生凋亡的細胞中，殘存的α-微管蛋白主要聚集在細胞膜。

表1 KY3對EC109細胞凋亡率的影響 %

*：與0 μmol/L KY3組相比，P<0.05。

表2 KY3對EC109細胞周期的影響 %

*：與0 μmol/L KY3組相比，P<0.05。

上排：Hoechst 33258;中排：α-微管蛋白；下排：合并。圖2 免疫熒光法檢測KY3處理后α-微管蛋白的形態(tài)(×400)

3 討論

微管由α-微管蛋白和β-微管蛋白異二聚體組成，是細胞骨架的主要成分。正常的微管在維持細胞形態(tài)、細胞有絲分裂、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及物質(zhì)運輸?shù)冗^程中起著重要作用[11]。在有絲分裂期間，胞質(zhì)中的微管解聚成微管蛋白，微管蛋白聚合形成紡錘體，紡錘體通過微管的聚合與解聚不斷延長和縮短，牽引染色體向細胞兩極移動進入2個子細胞中，完成有絲分裂[12]。干擾微管蛋白聚合-解聚過程的藥物往往干擾細胞的有絲分裂，引起細胞周期阻滯，最終導(dǎo)致細胞凋亡，因而是一類極具前景的抗腫瘤藥物[13]。

冬凌草是我國一味傳統(tǒng)的中草藥，味甘苦、性微寒，具有清熱解表、消炎止痛、健胃活血、增強免疫及抗腫瘤等功效。河南食管癌高發(fā)區(qū)林州、濟源等地的居民依據(jù)經(jīng)驗將冬凌草用于治療賁門癌、食管癌已有30 a的歷史，且治愈率很高。由于冬凌草具有獨特的抗食管癌、賁門癌及原發(fā)肝癌的功效，因而被譽為“紫杉醇第二”[14]。

在以往的工作中，作者從冬凌草中分離得到了一種結(jié)構(gòu)全新的二萜類化合物KY3，初步評價了KY3對人食管癌細胞EC109增殖的抑制作用。結(jié)果顯示，在3個時間段內(nèi)，EC109細胞的生存率均隨著KY3濃度的增加而降低；同時，在相同的KY3濃度下，EC109細胞的生存率隨著KY3處理時間的延長而逐漸降低。該結(jié)果提示，KY3呈劑量和時間依賴性降低EC109細胞的生存率。為探尋KY3抑制EC109細胞增殖的分子機制，作者隨后檢測了KY3處理之后EC109細胞的凋亡情況。結(jié)果顯示，不同劑量的KY3作用后，EC109細胞均發(fā)生了凋亡，且凋亡率隨著KY3濃度增加而逐漸增加。在腫瘤的治療中，除了誘導(dǎo)細胞凋亡，誘導(dǎo)細胞周期阻滯也是一個行之有效的手段。因此，接下來作者觀察了KY3對EC109細胞周期分布的影響。結(jié)果顯示，隨著KY3濃度的增加，G2/M期細胞逐漸增多，提示KY3將EC109細胞周期阻滯在G2/M期。此外，作者還發(fā)現(xiàn)，KY3作用之后，EC109細胞的微管形態(tài)遭到了破壞，提示KY3抑制EC109細胞增殖可能與微管損傷有關(guān)。

總之，KY3通過誘導(dǎo)凋亡、將細胞周期阻滯在G2/M期、破壞微管結(jié)構(gòu)形態(tài)抑制EC109細胞體外的增殖。

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(2016-05-09收稿 責任編輯姜春霞)

Inhibitory effect of active ingredient of Rabdosia rubescens KY3 on proliferation of esophageal carcinoma EC109 cells

FANGLi1),WANGSaiqi2),CHENXuemei3),XUEBohan3),WANGGuantao3),LIYuping3),LIUHongmin2)

1)ClinicalLaboratory,HospitalofZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001 2)SchoolofPharmaceuticalSciences,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001 3)DepartmentofHumanAnatomy,CollegeofBasicMedicalSciences,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001

EC109 cell;apoptosis;cycle arrest;KY3

Aim: To investigate the proliferation inhibition and the mechanism of active ingredients of Rabdosia rubescens KY3 on esophageal carcinoma EC109 cells.Methods: MTT assay was performed to measure the effect of 0,10,20,30,40,60,80,100 μmol/L KY3 on EC109 cell proliferation. Flow cytometry assay was conducted to measure the effect of 0,10,20,30 μmol/L KY3 on apoptosis and cell cycle distribution of EC109 cells, immunofluorescence was used to determine the effect of KY3 on microtubule structure of EC109 cells, and Hoechst 33258 staining was used to detect the morphological changes of the nucleus of EC109 cells after the treatment of KY3. Results: KY3 could inhibit the proliferation of EC109 cellsinvitro,and induce cell cycle arrest in G2/M phase as well as apoptosis of EC109 cells(P<0.05). After being treated by KY3, the microtubule of EC109 cells was destroyed. After the dose of KY3 increasing, α-microtubulin degradated gradually and had a typical morphological characteristic of apoptosis such as nucleus pycnosis and bright nuclei. Conclusion: The active ingredient of Rabdosia rubescens KY3 could inhibit the proliferation of EC109 cellsinvitro, and the underlying mechanisms may be related to the destruction of microtubule, the cell cycle arrest at G2/M phase as well as the induction of the apoptosis of EC109 cells.

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.01.001

*國家自然科學(xué)基金面上項目 81430085，21372206，81172937；河南省科技廳基礎(chǔ)與前沿項目 142300410038；河南省教育廳基金資助項目 17A310006；第59批國家博士后基金面上資助項目 2016M592314

R979.1