熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)在結(jié)核病診斷中的應(yīng)用價值探討

陸飛越+建華+仁其+婷婷+良平

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌（MTB）感染引起的慢性傳染病，對疑似結(jié)核病人進行痰抗酸桿菌涂片染色鏡檢及分枝桿菌培養(yǎng)，直接找到病原菌，對診斷結(jié)核病具有重要意義。但上述兩種方法也有其局限性：涂片鏡檢法總的敏感性為22%～80%[1]，并且無法在鏡下區(qū)分與MTB形態(tài)、染色相同的非結(jié)核分枝桿菌（NTM），而NTM 與MTB一樣嚴重威脅人類健康[2-3]。分枝桿菌培養(yǎng)法是臨床診斷結(jié)核病的“金標準”，但該方法靈敏度也不夠高，陽性率約為40%～60%[4]，并且該法檢測周期長，從培養(yǎng)至菌種鑒定一般需要8周甚至更長，且對早期結(jié)核菌感染者、藥物治療后細胞壁缺損L型細菌難以檢出。為此，找到一種適合基層醫(yī)療單位應(yīng)用，并能快速、靈敏診斷結(jié)核病，有效區(qū)分MTB與NTM的實驗室診斷方法，在臨床上有重要應(yīng)用價值。熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（FQ-PCR）是一種在聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）體系中引入熒光基團，利用熒光信號實時監(jiān)測整個PCR擴增進程的方法，可對標本中起始DNA模板進行定量，提高檢測靈敏度，同時省去了電泳步驟，減少污染機會，特異性更好。FQ-PCR結(jié)果以循環(huán)閾值（Ct值）表示， Ct值越小，說明起始模板核酸濃度越高。本研究試圖應(yīng)用FQ-PCR法檢測痰標本中MTB，以為臨床提供一種快速、靈敏、特異的結(jié)核病輔助診斷方法。

1 材料與方法

1.1標本來源

分批收集自2013年5月—2014年6月，在平湖市第一人民醫(yī)院（結(jié)核病定點診斷醫(yī)院）留取的經(jīng)抗酸桿菌涂片染色鏡檢陽性，且同時開展了分枝桿菌培養(yǎng)的合格痰標本共計115份，凍存于-20℃冰箱供FQ-PCR法檢測MTB使用。

1.2儀器與試劑

儀器有安捷倫公司的MX3000P實時熒光定量PCR儀、貝克曼庫爾特高速冷凍離心機、生物安全柜、-80℃超低溫冰箱等。試劑為中山大學達安基因股份有限公司的結(jié)核分枝桿菌核酸檢測試劑盒（PCR-熒光法），針對結(jié)核分枝桿菌特異性插入序列6110（IS6110）進行檢測，所有試劑均在有效期內(nèi)使用。

1.3方法

用4% 氫氧化鈉對樣本進行前處理，提取核酸，上機進行PCR擴增及熒光檢測，之后分析檢測結(jié)果。擴增條件：93℃持續(xù)2 min預(yù)變性，93℃ 45s→55℃ 60s循環(huán)10次，之后93℃ 30s→55℃ 45s循環(huán)30次，設(shè)置55℃用FAM通道檢測熒光信號。

1.4結(jié)果判斷

陰性對照品無S型擴增曲線，陽性對照品擴增呈S型曲線，樣本Ct值=30或無數(shù)值判為陰性，樣本擴增呈S型曲線，且Ct值<30判為陽性。

1.5統(tǒng)計學分析

將不同方法檢測結(jié)果錄入Excel數(shù)據(jù)庫，運用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計學分析。

2 結(jié)果

本次收集的115份痰涂陽標本中，用FQ-PCR法檢測，檢出MTB陽性106份，陽性率為92.2%；用改良羅氏培養(yǎng)法培養(yǎng)，經(jīng)PNB/TCH試驗鑒定為MTB的87份，陽性率為75.7%，用SPSS 16.0軟件進行卡方檢驗，兩者差異有非常顯著的統(tǒng)計學意義（χ2=11.63，P<0.001），見表1。

115份痰涂陽標本中，F(xiàn)Q-PCR法檢測MTB結(jié)果有9份陰性，占7.8%（9/115）。115份痰涂陽標本中，用改良羅氏培養(yǎng)法培養(yǎng)，結(jié)果分枝桿菌陽性97份，陽性率為84.35%，其中經(jīng)PNB/TCH試驗鑒定為NTM的10份，占培養(yǎng)陽性數(shù)的10.3%（10/97）， 占涂陽數(shù)的8.7%（10/115）；培養(yǎng)結(jié)果分枝桿菌陰性16份，報告污染雜菌的2份。用改良羅氏培養(yǎng)法培養(yǎng)，經(jīng)PNB/TCH試驗鑒定為NTM的10份標本中，F(xiàn)Q-PCR法檢測MTB結(jié)果陰性4份，陽性6份；FQ-PCR法檢測MTB結(jié)果陰性的9份標本中，除4份培養(yǎng)鑒定為NTM外，3份培養(yǎng)結(jié)果陰性，2份培養(yǎng)結(jié)果MTB陽性。

3 討論

本研究結(jié)果表明，用FQ-PCR法檢測115份痰涂陽標本，檢出MTB陽性106份，陽性率為92.2%；而用改良羅氏培養(yǎng)法鑒定，結(jié)果MTB陽性87份，陽性率為75.7%，兩者差異有非常顯著的統(tǒng)計學意義。表明FQ-PCR法檢測MTB是一種快速、靈敏的檢測方法，對于臨床早期診斷結(jié)核病具有重要的應(yīng)用價值。按照0.05 mL痰涂片成200 mm2的標本膜，用100×油鏡觀察，每片約有5 000個視野，而鏡檢結(jié)果為1+的報告標準為3～9條/100視野，按此計算，鏡檢結(jié)果1+的痰含菌量至少在3 000條/mL。另一方面，F(xiàn)Q-PCR法的檢測靈敏度為10個菌即可檢出（達安基因提供）。在此基礎(chǔ)上，結(jié)合分析痰涂片結(jié)果及FQ-PCR檢測結(jié)果，對痰涂片結(jié)果抗酸桿菌陽性，特別是菌量在1+以上的，而FQ-PCR法檢測MTB陰性的情況，極有可能為NTM感染，將上述兩種方法的結(jié)果結(jié)合進行分析，對于基層不具備分枝桿菌基因分型條件的醫(yī)療單位早期診斷NTM感染具有一定意義。

本研究結(jié)果顯示，用FQ-PCR法檢測115份涂陽痰標本，有9份NTM陰性（涂片結(jié)果陽性而FQ-PCR法結(jié)果陰性），占涂陽標本數(shù)的7.83%，培養(yǎng)法鑒定有10份NTM陽性，占涂陽標本數(shù)的8.70%。據(jù)梁莉等[5]報道，上海市1998—2004年NTM感染占分枝桿菌屬培養(yǎng)陽性率分別為1.49%、1.17%、1.98%、2.46%、2.66%、2.72%、3.00%，基本呈上升趨勢。陜西省結(jié)核病防治院王智存、鄒遠嫵等[6-7]報道，陜西省2012—2013年NTM感染占分枝桿菌培養(yǎng)陽性率為7%～16.9%。本次研究結(jié)果顯示，平湖地區(qū)NTM感染占分枝桿菌培養(yǎng)陽性率為10.3%，表明NTM感染在平湖市分枝桿菌肺病中占有一定比例，NTM的大多數(shù)菌種對治療MTB的藥物呈現(xiàn)高耐藥[5-10]，容易導致臨床治療失敗。快速、準確區(qū)分MTB與NTM感染對于結(jié)核病的診治非常必要，對于FQ-PCR法提示為NTM感染的肺病病人，建議及早開展菌型鑒定及藥物敏感性試驗以便進行進一步的治療。

本次研究結(jié)果中，痰培養(yǎng)結(jié)果陽性，而實時熒光定量PCR法陰性的2份標本，除了檢測方法靈敏度因素外，還可能與檢測時取痰樣的部位有關(guān)，另據(jù)文獻報道，在國內(nèi)發(fā)現(xiàn)有IS6110單拷貝和零拷貝結(jié)核分枝桿菌菌株[11]，而本次研究中所用實時熒光定量PCR法檢測的靶序列即為IS6110，這也可能是導致實時熒光定量PCR法檢測結(jié)果陰性的因素之一。

FQ-PCR法陽性而培養(yǎng)鑒定法陰性的21份標本中，除了10份鑒定為NTM外，剩余的11份可能與培養(yǎng)法的靈敏度及培養(yǎng)過程中污染雜菌有關(guān)，也有可能與痰中的抗酸桿菌是死菌有關(guān)。本次研究結(jié)果中，經(jīng)培養(yǎng)及PNB/TCH試驗鑒定，屬于NTM的10份標本，其中6份實時熒光定量PCR法檢測結(jié)果為結(jié)核分枝桿菌陽性，可能存在混合感染，導致痰培養(yǎng)時只有優(yōu)勢菌種生長。此外，由于菌種鑒定使用的是PNB/TCH試驗，未最終鑒定到種的水平，根據(jù)浙江省疾病預(yù)防控制中心柳正衛(wèi)等[12]報道，用DNA微陣列芯片法和16sRNA測序法對70株P(guān)NB/TCH試驗初步鑒定為NTM的菌株進行菌種鑒定，結(jié)果61.43%為結(jié)核分枝桿菌，其余38.57%為NTM。李國利等[13]報道，以PCR-反向核酸探針雜交和PCR-DNA測序結(jié)果為鑒定標準， 264株NTM菌株中233（88% ）株P(guān)NB生長試驗為陽性， 其余31株（12% ）為陰性，認為僅應(yīng)用PNB生長試驗鑒別結(jié)核分枝桿菌與NTM存在局限性。

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基金項目：平湖市科技發(fā)展計劃項目（2012-62）

【作者簡介】陸飛越（1979—），女，副主任技師 （收稿日期：2015-04-29）