表面等離子體共振譜儀用于糖蛋白檢測(cè)研究

王 金 美， 于 清 旭

( 大連理工大學(xué) 物理與光電工程學(xué)院, 遼寧 大連 116024 )

表面等離子體共振譜儀用于糖蛋白檢測(cè)研究

王 金 美， 于 清 旭*

( 大連理工大學(xué) 物理與光電工程學(xué)院, 遼寧 大連 116024 )

介紹了一種表面等離子體共振(SPR)生化分析儀，采用角度掃描與強(qiáng)度調(diào)制相結(jié)合的方法來實(shí)現(xiàn)對(duì)糖蛋白的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)．在糖蛋白的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中，對(duì)不同pH的再生液進(jìn)行對(duì)比，pH=3的再生能力達(dá)到97%，選擇該pH的溶液作為再生液；對(duì)同一濃度的糖蛋白進(jìn)行5次測(cè)量，得出相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為3.83%；通過非糖蛋白與糖蛋白的對(duì)比實(shí)驗(yàn)，說明本實(shí)驗(yàn)方法可以對(duì)糖蛋白進(jìn)行特異性檢測(cè)；最后對(duì)濃度在0.01～1 mg/mL的糖蛋白進(jìn)行檢測(cè)，并進(jìn)行了線性擬合和多項(xiàng)式擬合，通過殘差分析和相關(guān)系數(shù)的比較得出RNase B的濃度與歸一化光強(qiáng)的關(guān)系更符合多項(xiàng)式擬合，因此以多項(xiàng)式擬合曲線作為其標(biāo)準(zhǔn)曲線．實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該SPR譜儀可以對(duì)糖蛋白進(jìn)行特異性檢測(cè)，該技術(shù)將會(huì)在醫(yī)學(xué)方面得到廣泛應(yīng)用．

表面等離子體共振(SPR)；實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)；糖蛋白；硼酸

0 引 言

蛋白質(zhì)的糖基化修飾廣泛地存在于生物體內(nèi)，對(duì)自身免疫、老化、癌細(xì)胞異常增殖及轉(zhuǎn)移、病原體感染等過程起著重要作用[1-2]．糖蛋白翻譯后加工修飾異常與疾病密切關(guān)聯(lián)，因此對(duì)于異常糖蛋白檢測(cè)可以使疾病在早期發(fā)生時(shí)即可做出診斷[3-4]．目前糖蛋白的檢測(cè)主要有親和層析技術(shù)、質(zhì)譜等，但是這些方法有一定不足，不能在短時(shí)間內(nèi)獲得檢測(cè)結(jié)果，需要標(biāo)記[5-6]．表面等離子體共振(SPR)技術(shù)由于具有能實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)反應(yīng)動(dòng)態(tài)過程，分析樣品無須純化、無須標(biāo)記，反應(yīng)靈敏度高，無背景干擾[7-9]，尤其是在研究動(dòng)力學(xué)系數(shù)方面的突出優(yōu)點(diǎn)[10]，成為近幾年的研究熱點(diǎn)[11-13]，目前已經(jīng)被廣泛應(yīng)用到生物、化學(xué)、醫(yī)學(xué)、環(huán)境及食品安全等領(lǐng)域[14-15]，因此本文采用SPR技術(shù)檢測(cè)糖蛋白．

SPR是利用金屬薄膜耦合產(chǎn)生的一種物理光學(xué)現(xiàn)象．1902年，Wood在光學(xué)實(shí)驗(yàn)中首次發(fā)現(xiàn)了SPR現(xiàn)象[16]；1968年Kretschmann等建立了Kretschmann結(jié)構(gòu)，為SPR研究奠定了基礎(chǔ)[17]；1983年，Liedberg等首次提出將SPR技術(shù)運(yùn)用到生化大分子檢測(cè)方面[18]；1990年，BiacoreAB公司生產(chǎn)出第一臺(tái)商業(yè)化SPR生化分析儀，此后SPR技術(shù)得到迅速發(fā)展．

實(shí)驗(yàn)室已搭建的系統(tǒng)[19]采用角度掃描結(jié)構(gòu)，該調(diào)制方法具有測(cè)量靈敏度高、簡(jiǎn)單直觀、易觀測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，但實(shí)時(shí)性較差．本文提出角度掃描與強(qiáng)度調(diào)制相結(jié)合的檢測(cè)方法，以實(shí)現(xiàn)SPR譜儀對(duì)被測(cè)物的實(shí)時(shí)在線監(jiān)測(cè)．由于光強(qiáng)檢測(cè)法容易受光源功率穩(wěn)定性的影響，引入?yún)⒖纪ǖ赖姆椒▉硖岣呦到y(tǒng)的穩(wěn)定性．

1 原 理

1.1 SPR生物傳感原理

SPR利用了衰減全反射的原理，當(dāng)入射光的平行偏振分量從棱鏡等光密介質(zhì)入射到金屬等光疏介質(zhì)的分界面處發(fā)生全反射現(xiàn)象時(shí)，將會(huì)產(chǎn)生消逝波，它將進(jìn)入金屬薄膜內(nèi)并激發(fā)金屬中的自由電子產(chǎn)生表面等離子體波．當(dāng)表面等離子體波和消逝波沿界面方向的分量相同時(shí)，反射光的能量急劇衰減，這種現(xiàn)象就稱為表面等離子體共振[20]，發(fā)生表面等離子體共振時(shí)的入射角稱為SPR共振角．

SPR對(duì)被測(cè)物的折射率非常敏感，但是無修飾的SPR傳感器只與被測(cè)物的折射率有關(guān)，而與樣品種類無關(guān)[21]．SPR生物傳感器是先在金屬薄膜表面修飾一層自組裝單分子層，這層分子具有特異性識(shí)別的功能，只能吸附特定物質(zhì)，這樣就實(shí)現(xiàn)了特異性檢測(cè)．

角度調(diào)制采用固定入射波長(zhǎng)來進(jìn)行角度掃描，通過掃描曲線得出共振角，此方法具有測(cè)量靈敏度高、易觀測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，因此被廣泛應(yīng)用．在金屬薄膜上修飾了自組裝單分子層后的掃描曲線如圖1中的曲線1；被測(cè)物與修飾上的分子特異性結(jié)合引起金屬界面折射率的變化，從而引起共振角的變化，如圖1中的曲線2．角度掃描式檢測(cè)方法通過掃描曲線得出共振角，因此檢測(cè)速度較慢，不能很好地監(jiān)測(cè)曲線的動(dòng)態(tài)過程，實(shí)時(shí)性較差．強(qiáng)度調(diào)制是固定入射波長(zhǎng)和入射角來進(jìn)行光強(qiáng)監(jiān)測(cè)的，因此檢測(cè)速度快，本文采用角度掃描與強(qiáng)度調(diào)制相結(jié)合的方法進(jìn)行檢測(cè)，即固定入射角后檢測(cè)反射光強(qiáng)．固定入射角后定點(diǎn)監(jiān)測(cè)是先利用角度調(diào)制的方法掃描出修飾了自組裝單分子層的曲線1，找出曲線共振峰左側(cè)斜率最大值，以此角度為入射角進(jìn)行定點(diǎn)監(jiān)測(cè)，得出動(dòng)態(tài)曲線．

圖1 SPR檢測(cè)原理

1.2 糖蛋白檢測(cè)原理

在水溶液中，硼酸分子可以與含有順式二醇類的分子共價(jià)結(jié)合，形成五元環(huán)或六元環(huán)硼酸酯，如圖2所示．因此硼酸分子被廣泛應(yīng)用于葡萄糖、糖蛋白等含有順式二醇類生物分子的識(shí)別中．硼酸分子與順式二醇類分子共價(jià)結(jié)合具有在堿性環(huán)境中穩(wěn)定，而在酸性條件下可逆解離的特點(diǎn)．因此改變pH可以實(shí)現(xiàn)硼酸物質(zhì)對(duì)含有順式二醇類生物分子可逆的解離[22]．

圖2 硼酸分子與順式二醇類化合物相互作用

利用以上性質(zhì)，采用SPR技術(shù)檢測(cè)糖蛋白核糖核酸酶B(RNase B)．首先，含巰基的11-巰基十一烷酸(MA)與硼酸分子3-氨基苯硼酸(APB)利用羧基與氨基的縮合反應(yīng)生成11-巰基十一烷酸-3-氨基苯硼酸(MA-APB)．利用金與末端含巰基的分子可以形成牢固Au—S鍵的性質(zhì)[23]，鍍有金膜的傳感芯片在MA-APB溶液中浸泡12 h，就可以在金膜表面形成一層穩(wěn)定的自組裝單分子層．這樣金膜末端連接了能特異性識(shí)別RNase B的APB分子，再將糖蛋白R(shí)Nase B溶液通過流通系統(tǒng)通入傳感芯片，RNase B與APB特異性結(jié)合，SPR信號(hào)響應(yīng)增強(qiáng)，實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)快速檢測(cè)．

2 糖蛋白檢測(cè)實(shí)驗(yàn)

2.1 實(shí)驗(yàn)裝置

實(shí)驗(yàn)裝置如圖3所示．He-Ne激光器發(fā)出激光，首先經(jīng)過斬波器調(diào)制成某一特定頻率的方波，再經(jīng)過反射鏡1進(jìn)入分光棱鏡分成兩路，一路作為補(bǔ)償光路進(jìn)入探測(cè)器2，一路通過反射鏡2進(jìn)入圓柱棱鏡系統(tǒng)，產(chǎn)生SPR現(xiàn)象后的反射光進(jìn)入探測(cè)器1．?dāng)夭ㄆ鲗⒄{(diào)制的方波作為參考信號(hào)，信號(hào)通道和補(bǔ)償通道都經(jīng)過探測(cè)器后作為兩個(gè)信號(hào)通道進(jìn)入雙通道鎖相放大器，最后通過串口發(fā)送給計(jì)算機(jī)，利用LabVIEW上位機(jī)軟件顯示并保存數(shù)據(jù)．

圖3 SPR譜儀系統(tǒng)簡(jiǎn)圖

進(jìn)樣系統(tǒng)的主要部分是流通池，待測(cè)液從流通池的進(jìn)液口進(jìn)入，通過蠕動(dòng)泵的輸送，從出液口排出到廢液缸中．

補(bǔ)償通道是通過加入分光棱鏡，再分出一路光直接連接到探測(cè)器2，實(shí)時(shí)測(cè)量激光器的功率，將信號(hào)通道與參考通道作比值，這樣就可以消除光源不穩(wěn)定性對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響．

2.2 實(shí)驗(yàn)藥品

糖蛋白檢測(cè)實(shí)驗(yàn)所需配制的溶液如下．

磷酸鹽(PBS)緩沖液：8 g NaCl、0.2 g KCl、1.44 g Na2HPO4和0.24 g KH2PO4加去離子水至800 mL，再用鹽酸或NaOH溶液調(diào)pH至7.4，用去離子水定容至1 L．

MA-APB溶液：用體積比為1∶1的甲醇和二氯甲烷混合液配制1 mg/mL的MA-APB溶液．

牛血清白蛋白(BSA)溶液：用PBS溶液配制5 mg/mL的BSA溶液．

再生液：乙醇與PBS溶液體積比為3∶1，pH=3．

不同濃度的RNase B溶液：用PBS溶液配制不同濃度的RNase B溶液．

2.3 實(shí)驗(yàn)方法

(1)傳感芯片表面金膜的修飾：將鍍好金膜的傳感芯片浸泡在MA-APB溶液中12 h，利用Au—S共價(jià)鍵穩(wěn)定結(jié)合的性質(zhì)使MA-APB分子緊密結(jié)合在金膜表面，形成一層自組裝單分子層．

(2)通入PBS溶液，先角度調(diào)制掃描出一條SPR譜線，得出共振峰左側(cè)斜率最大值，以此角度為入射角進(jìn)行定點(diǎn)監(jiān)測(cè)．

(3)BSA封端：MA-APB溶液中還含有少量的MA和APB，那么在金膜表面就會(huì)有MA-APB和MA，用BSA封閉少量的MA中的羧基，以免對(duì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生干擾．如圖4所示．

圖4 APB固定及其與RNase B結(jié)合、再生過程示意圖

Fig.4 APB fixed and combination with RNase B, regeneration process diagram

(4)RNaseB檢測(cè)實(shí)驗(yàn)(如圖5所示)：①通PBS緩沖液10min左右至基線平穩(wěn)．PBS緩沖液的作用是模擬生理環(huán)境，為生化反應(yīng)提供一個(gè)穩(wěn)定的環(huán)境．②通入RNaseB樣品15min，使RNaseB與APB特異性結(jié)合，得到生長(zhǎng)曲線，將最高點(diǎn)作為響應(yīng)值．③再通入PBS緩沖液10min左右，可以看出曲線有一段回落，這是由于清洗掉物理吸附上去的RNaseB，但回落很少，說明RNaseB與APB結(jié)合牢固．④通入再生液，將RNaseB洗脫掉，使傳感芯片表面再生，以便進(jìn)行重復(fù)性測(cè)試．⑤最后再通入PBS緩沖液回到基線，完成一個(gè)循環(huán)．

圖5 RNase B在線監(jiān)測(cè)過程圖

2.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果及討論

2.4.1 穩(wěn)定性測(cè)試 圖6為激光器的穩(wěn)定性測(cè)試和加入?yún)⒖纪ǖ篮笙到y(tǒng)的穩(wěn)定性測(cè)試，測(cè)試時(shí)間為45min，穩(wěn)定性可用(Pmax-Pmin)/Pavg來計(jì)算．

(a) 激光器穩(wěn)定性測(cè)試

(b) 加入?yún)⒖纪ǖ篮笙到y(tǒng)穩(wěn)定性測(cè)試

圖6 穩(wěn)定性測(cè)試

Fig.6 Stability test

通過測(cè)試得出，激光器穩(wěn)定性為1.44%，加入?yún)⒖纪ǖ篮笙到y(tǒng)的穩(wěn)定性為0.136%．由此可見，加入?yún)⒖纪ǖ篮蟮南到y(tǒng)穩(wěn)定性比未優(yōu)化系統(tǒng)的穩(wěn)定性提高了一個(gè)數(shù)量級(jí)，因此系統(tǒng)測(cè)量精度也會(huì)有所提高．

2.4.2 再生條件探究 洗脫再生對(duì)于檢測(cè)的準(zhǔn)確性、檢測(cè)時(shí)間以及傳感元件的使用壽命都有很大的影響．本文比較再生液為乙醇與PBS溶液體積比為3∶1，pH分別為5、4、3的洗脫再生效果，如圖7所示．

再生能力是用后面不同pH的響應(yīng)值與開始pH=3的響應(yīng)值之比來表示．表1為不同pH的再生液再生能力對(duì)比．

從表中可以直觀地看出，pH越小再生效果越好．由于pH=3的再生能力達(dá)到97%，已經(jīng)滿足實(shí)驗(yàn)要求了，所以沒有再配制pH更小的溶液，以pH=3的溶液作為再生液．

圖7 再生曲線

表1 不同pH的再生液再生能力對(duì)比表

2.4.3 重復(fù)性 重復(fù)性[24]是指多次測(cè)量某一量時(shí)，測(cè)定值的離散程度．它反映分析方法或測(cè)量系統(tǒng)存在隨機(jī)誤差的大小，也是檢驗(yàn)一臺(tái)儀器是否合格的關(guān)鍵參數(shù)．在相同實(shí)驗(yàn)條件下，進(jìn)行5次實(shí)驗(yàn)，如圖8(a)所示．將5次的響應(yīng)值做成柱狀圖，如圖8(b)所示．

數(shù)據(jù)分析得出5組響應(yīng)值的標(biāo)準(zhǔn)差為0.010 72，均值為0.279 9，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)=標(biāo)準(zhǔn)差/均值=3.83%<10%，說明該測(cè)試方法具有較好的可重復(fù)性和穩(wěn)定性．

2.4.4 特異性檢測(cè) 傳感芯片表面的非特異性吸附是影響SPR傳感器檢測(cè)準(zhǔn)確性的一個(gè)重要因素．由于RNase A與RNase B的結(jié)構(gòu)相似，本文選擇RNase A來做特異性對(duì)比實(shí)驗(yàn)，如圖9所示．

從圖中可以看出，RNase A在芯片表面無明顯吸附，而RNase B響應(yīng)非常明顯，說明固定有3-氨基苯硼酸的芯片對(duì)于非特異性吸附非常小，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)RNase B的特異性檢測(cè)．

2.4.5 不同濃度RNase B的檢測(cè) 從低到高進(jìn)行不同濃度RNase B的檢測(cè)，得出如圖10的響應(yīng)曲線圖．

取各曲線的響應(yīng)值，做線性擬合及殘差分析．因?yàn)樵谕ú缓琑Nase B的PBS溶液時(shí)傳感器幾乎沒有響應(yīng)，所以應(yīng)設(shè)置擬合曲線過原點(diǎn)，如圖11所示．

(a) 測(cè)量曲線

(b) 響應(yīng)值柱狀圖

圖8 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

Fig.8 Reproducibility experiment

圖9 特異性實(shí)驗(yàn)

圖10 不同濃度RNase B響應(yīng)圖

圖11 線性擬合與殘差分析

線性擬合關(guān)系式為

y=0.354 09x

(1)

相關(guān)系數(shù)R2=0.957 29．

做多項(xiàng)式擬合及殘差分析，同樣設(shè)置擬合曲線過原點(diǎn)，如圖12所示．

圖12 多項(xiàng)式擬合與殘差分析

多項(xiàng)式擬合關(guān)系式為

y=-0.268 89x2+0.598 83x

(2)

相關(guān)系數(shù)R2=0.999 8．

從殘差分析和相關(guān)系數(shù)結(jié)果可知，濃度與歸一化光強(qiáng)更符合多項(xiàng)式擬合，因此以多項(xiàng)式擬合曲線作為RNase B檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線．

3 結(jié) 語

本文采用改進(jìn)的SPR譜儀對(duì)糖蛋白進(jìn)行了特異性檢測(cè)，對(duì)不同濃度的RNase B進(jìn)行線性擬合和多項(xiàng)式擬合，說明了濃度與歸一化光強(qiáng)更符合多項(xiàng)式擬合．以多項(xiàng)式擬合曲線作為其標(biāo)準(zhǔn)曲線，也證明了該SPR譜儀使用方便、檢測(cè)速度快、結(jié)果準(zhǔn)確，因此對(duì)于生化實(shí)驗(yàn)的分析是一種比較好的儀器．糖蛋白對(duì)人體健康具有重要意義，SPR技術(shù)對(duì)于糖蛋白的檢測(cè)具有無須標(biāo)記、檢測(cè)速度快、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，將會(huì)在醫(yī)學(xué)方面得到廣泛應(yīng)用．

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Research on detection of glycoprotein by surface plasmon resonance spectrometer

WANG Jinmei, YU Qingxu*

( School of Physics and Optoelectronic Engineering, Dalian University of Technology, Dalian 116024, China )

A surface plasmon resonance (SPR) biochemical analyzer is introduced. The method of combining angle scanning with intensity modulation is adopted to realize the real-time monitoring of glycoprotein. In the experiments of glycoprotein detection, the renewable solution of pH=3 is chosen because the regenerative capacity of the solution reaches 97% in the renewable solution of different pH comparison. Relative standard deviation (RSD) is 3.83% in the five measurements of the same concentration glycoprotein. The experimental method can detect the specificity of glycoprotein in the comparative experiments of non-glycoprotein and glycoprotein. Finally, the glycoprotein concentration between 0.01 mg/mL and 1 mg/mL is detected. The relationship between the concentration of RNase B and the normalized light intensity is more consistent with polynomial fitting by comparing the residual analysis and correlation coefficients of linear fitting and polynomial fitting, and polynomial fitting curve is used as standard curve. The experimental results show that the SPR spectrometer can detect the specificity of glycoprotein, while will be widely used in medical field.

surface plasmon resonance (SPR); real-time monitoring; glycoprotein; boronic acids

1000-8608(2017)01-0016-07

2016-04-11；

2016-09-30．

王金美(1988-)，女，碩士生，E-mail:891825471@mail.dlut.edu.cn；于清旭*(1955-)，男，教授，E-mail:yuqx@dlut.edu.cn.

TP212

A

10.7511/dllgxb201701003