基于SRAP標記的任豆遺傳多樣性分析

林 瑋，周 瑋，周 鵬，周祥斌，吳林瑛，陳曉陽

(華南農(nóng)業(yè)大學 林學與風景園林學院/廣東省森林植物種質創(chuàng)新與利用重點實驗室/廣東木本飼料工程技術研究中心，廣東 廣州 510642)

基于SRAP標記的任豆遺傳多樣性分析

林 瑋，周 瑋，周 鵬，周祥斌，吳林瑛，陳曉陽

(華南農(nóng)業(yè)大學 林學與風景園林學院/廣東省森林植物種質創(chuàng)新與利用重點實驗室/廣東木本飼料工程技術研究中心，廣東 廣州 510642)

【目的】研究任豆Zeniainsignis種群遺傳多樣性，為有效保護任豆種質資源并進行遺傳改良提供理論基礎?！痉椒ā吭诮⑷味筍RAP-PCR反應體系的基礎上，對17個任豆種源進行遺傳多樣性分析，并利用UPGMA聚類分析，對任豆種源進行類群劃分?！窘Y果】12對引物組合共擴增出151條帶，平均每對引物獲得12.58條。其中，多態(tài)性條帶106條，平均每對引物8.83條，平均多態(tài)率為70.39%。種源間多態(tài)位點比率為38.96%～72.73%，平均為59.66%；基因多樣性指數(shù)為0.175 5～0.313 3，平均為0.256 8；Shannon信息指數(shù)為0.249 4～0.450 2，平均為0.369 1；觀測等位基因數(shù)(na)為1.519 5～1.727 3，平均達1.600 0，種源水平的na為1.724 9；有效等位基因數(shù)(ne)為1.330 5～1.577 3，平均達1.471 3，種源水平的ne為1.502 6；種源間的遺傳一致度為0.703 1～0.886 5；遺傳距離為0.120 5～0.352 3。根據(jù)聚類結果，將任豆17個種源分為3個地理類群：第1類為廣西和貴州種源，第2類為廣東、湖南和廣西種源，第3類為云南種源，地理距離相近的種源基本上聚在同一類?！窘Y論】任豆種源間和種源個體間均存在較豐富的遺傳多樣性，且種源內(nèi)更豐富，遺傳改良時應更注重種源內(nèi)個體的選擇。任豆種源間基因流不高，且根據(jù)聚類結果劃分的3個類群的地理格局明顯，應是由任豆特定的生活環(huán)境造成的隔離所致。

任豆； 種源； SRAP； 遺傳多樣性

任豆Zeniainsignis又稱翅莢木、任木，蘇木科任豆屬落葉大喬木，為單種屬，是華南石灰?guī)r地區(qū)的特有種，也是國家二級重點保護植物[1]。該樹種樹形高大、通直，樹高可達15～20 m，胸徑可達1 m以上。任豆在我國主要分布于廣西、廣東、云南、湖南、貴州等地[2]，也分布于印度-馬來西亞-越南(或中南半島)一帶。任豆適應性廣，具有適應干旱、干熱性強等優(yōu)良特點，能在石灰?guī)r風化發(fā)育的酸性紅壤和赤紅壤上生長，是西南和華南地區(qū)石質山地造林、植被恢復重建的首選鄉(xiāng)土樹種之一[3]。任豆耐刈割，萌芽力強，枝葉粗蛋白含量高，適口性好，也是優(yōu)良的木本飼料[4]。

遺傳多樣性研究可以為揭示物種的起源、物種間的親緣關系等提供依據(jù)，對于有效地保護種質資源、開展遺傳改良具有重要的意義。目前，對任豆遺傳多樣性的研究不多見，ISSR已有報道[1]。SRAP (Sequence-related amplified polymorphism)是一種基于PCR的分子標記技術，它結合了AFLP及RAPD的優(yōu)點，具有簡便、穩(wěn)定、產(chǎn)率高、容易克隆目標片段等特點[5]，且試驗結果穩(wěn)定，重復性較好[6]。本研究以17個任豆種源作為研究材料，采用SRAP分子標記技術，對任豆種源間以及種源內(nèi)的遺傳多樣性進行分析，以期在DNA分子水平上揭示任豆的遺傳多樣性。

1 材料與方法

1.1 材料

根據(jù)任豆的天然分布，按照均衡抽樣的原則，選取廣東陽山和樂昌，廣西那坡和平果，貴州羅甸和冊亨，云南西疇和麻栗坡，湖南通道和江華等17個種源任豆作為研究材料，采種點覆蓋任豆主要分布區(qū)，并均勻分布(表1)。于2013—2014年分批播種，苗圃設在華南農(nóng)業(yè)大學。2014年7月初，每個種源選取10個家系，每個家系選出2株作為樣株并掛牌標記，以幼嫩葉片作樣品，葉片按單株編號，再分別置入塑料封口袋中，放入-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 任豆采種點地理位置

Tab.1 Geographic location of different seed collection sites ofZeniainsignis

編號種源經(jīng)度(E)/(°)緯度(N)/(°)1廣西靖西113．0824．802廣西都安108．0923．943廣西羅城108．9124．794廣西桂林109．6024．255廣東陽山112．6424．486湖南江華111．7924．977廣西靈川110．4525．078湖南通道109．8826．269廣西德保106．6123．3510廣西平果107．5923．3311廣西那坡106．0123．3812貴州冊亨105．8024．9813云南西疇104．6723．4314云南麻栗坡104．7123．1215貴州梵凈山108．7827．8316貴州羅甸106．4125．7217廣東樂昌112．8525．52

1.2 方法

1.2.1 DNA提取與純化 使用由Omega Bio-tek公司生產(chǎn)的DNA提取試劑盒(HP plant DNA Kit, OMEGA)對任豆總DNA進行提取和純化。用質量濃度為8 g·L-1的瓊脂糖凝膠電泳檢測純度，對照DNA標準相對分子質量，計算所提取基因組DNA的濃度。

1.2.2 SRAP-PCR反應體系建立與優(yōu)化 對SRAP反應體系主要因素[包括Taq酶，Mg2+濃度，模板DNA，三磷酸脫氧核苷酸(dNTP)，引物]進行多水平優(yōu)化試驗。PCR產(chǎn)物用2.0 g·kg-1瓊脂糖凝膠和溴化乙錠(EB)染色檢測。根據(jù)最佳因素水平組合進行梯度退火試驗，建立并優(yōu)化SRAP反應體系。最適宜任豆的25 μL體系為：10×PCR buffer 2.5 μL、模板DNA 80 ng、Mg2+2.0 mmol·L-1、dNTP 0.225 mol·L-1、引物0.3 μmol·L-1和TaqDNA聚合酶1.25 U。經(jīng)過反復試驗，反應程序為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性1 min、35 ℃退火1 min、72 ℃延伸 1 min，5個循環(huán)；94 ℃ 變性 1 min、55 ℃退火1 min、72 ℃延伸 1 min，30個循環(huán)；72 ℃ 延伸10 min，4 ℃條件下保存。

再隨機選取6個種源的任豆DNA，對建立的體系進行驗證。

1.2.3 引物篩選 運用優(yōu)化的SRAP-PCR反應體系進行引物篩選，挑選出4個地理差距較大的任豆種源DNA(云南西疇，湖南江華，貴州羅甸，廣東陽山)作為模板，對729對引物組合進行初步篩選。從中挑選出120對可以產(chǎn)生多態(tài)性條帶的引物組合，其條帶較為清晰。再以隨機選取的廣東陽山、湖南通道、廣西桂林、廣西靈川、廣西平果、廣西那坡、貴州冊亨、云南西疇8個種源為模板，對引物進行復篩，最后確定出12對效果最佳、擴增條帶較多、背景清晰的引物用于SRAP-PCR反應。本試驗根據(jù)Li等[7]提出的原則，設計SRAP引物，PCR擴增的引物采用上海生工生物工程技術服務有限公司的產(chǎn)品。最終設計出的引物見表2。

表2 任豆SRAP分析的引物序列
Tab.2 Primer sequences used for SRAP analysis ofZeniainsignis

引物編號正向序列引物編號反向序列Me15′TGAGTACAAACCGGATA3′Em15′GACTGCGTACGAATTTGC3′Me25′TGAGTACAAACCGGAGC3′Em25′GACTGCGTACGAATTTGC3′Me35′TGAGTACAAACCGGAAT3′Em35′GACTGCGTACGAATTGAC3′Me45′TGAGTACAAACCGGACC3′Em45′GACTGCGTACGAATTTGA3′Me55′TGAGTACAAACCGGAAG3′Em55′GACTGCGTACGAATTAAC3′Me65′TGAGTACAAACCGGTAA3′Em65′GACTGCGTACGAATTGCA3′Me75′TGAGTACAAACCGGTCC3′Em75′GACTGCGTACGAATTGAG3′Me85′TGAGTACAAACCGGTGC3′Em85′GACTGCGTACGAATTGCC3′Me95′TGAGTACAAACCGGACA3′Em95′GACTGCGTACGAATTTCA3′Me105′TGAGTACAAACCGGACG3′Em105′GACTGCGTACGAATTCAA3′Me115′TGAGTACAAACCGGACT3′Em115′GACTGCGTACGAATTGCA3′Me125′TGAGTACAAACCGGAGG3′Em125′GACTGCGTACGAATTCAT3′Me135′TGAGTACAAACCGGAAA3′Em135′GACTGCGTACGAATTCTA3′Me145′TGAGTACAAACCGGAAC3′Em145′GACTGCGTACGAATTCTC3′Me155′TGAGTACAAACCGGAGA3′Em155′GACTGCGTACGAATTCTT3′Me165′TGAGTACAAACCGGATA3′Em165′GACTGCGTACGAATTGAT3′Me175′TGAGTACAAACCGGTAG3′Em175′GACTGCGTACGAATTATG3′Me185′TGAGTACAAACCGGCAT3′Em185′GACTGCGTACGAATTAGC3′Me195′TGAGTACAAACCGGTTG3′Em195′GACTGCGTACGAATTACG3′Me205′TGAGTACAAACCGGTGT3′Em205′GACTGCGTACGAATTTAG3′Me215′TGAGTACAAACCGGTCA3′Em215′GACTGCGTACGAATTTCG3′Me225′TGAGTACAAACCGGGCA3′Em225′GACTGCGTACGAATTGTC3′Me235′TGAGTCCAAACCGGATG3′Em235′GACTGCGTACGAATTGGT3′Me245′TGAGTCCAAACCGGGAT3′Em245′GACTGCGTACGAATTCAG3′Me255′TGAGTCCAAACCGGGCT3′Em255′GACTGCGTACGAATTCTG3′Me265′TTCAGGGTGGCCGGATG3′Em265′GACTGCGTACGAATTCGG3′Me275′TGGGGACAACCCGGCTT3′Em275′GACTGCGTACGAATTCCA3′

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 SRAP-PCR產(chǎn)物經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，統(tǒng)計凝膠同一位置上DNA帶的有和無，有帶的記為“1”，無帶的記為“0”，形成0、1數(shù)據(jù)矩陣。采用POPGENE軟件對全部群體和各單個群體分別進行基因多樣性指數(shù)(h)、Shannon信息指數(shù)(I)、總基因多樣度(Ht)、群體內(nèi)的基因多樣度(Hs)、種源遺傳分化系數(shù)(Gst)和基因流(Nm)等遺傳參數(shù)的分析[8]，利用POPGENE 1.32計算遺傳距離，根據(jù)采種點的經(jīng)緯度，在http://jan.ucc.nau.edu/cvm/latlongdist.html上計算任豆各種源之間的地理直線距離(m)，運用GenLAE 6.2進行Mantel檢驗[9]，分析地理距離與遺傳距離的相關性，分析時設定9 999次數(shù)據(jù)隨機選擇，利用NTSYS 2.1軟件進行UPGMA聚類分析。

2 結果與分析

2.1 SRAP擴增結果分析

對樣本進行了SRAP-PCR分析，用篩選出來的12對SRAP引物擴增出151條帶(圖1)。其中，106條具有多態(tài)性。平均每個引物擴增的多態(tài)性條帶為8.83條，各引物多態(tài)性條帶占58.34%～81.18%，平均為70.39%。多態(tài)性條帶占比最高的引物組合為Me9/Em14，達到了81.18%，其次為Me7/Em10和Me17/Em14，均達到了76.92%。多態(tài)性條帶占比最低的引物組合為Me1/Em17，但也達到了58.34%(表3)。

M：100 bp DNA ladder；任豆種源分別為1：廣西靖西；2：廣西都安；3：廣西羅城；4:廣西桂林；5:廣東陽山；6:湖南江華；7:廣西靈川；8:湖南通道；9:廣西德保；10:廣西平果；11:廣西那坡；12:貴州冊亨；13:云南西疇；14:云南麻栗坡；15:貴州梵凈山；16:貴州羅甸；17:廣東樂昌。

圖1 各種源任豆SRAP引物擴增結果
Fig.1 Amplified results of SRAP primers

表3 任豆不同引物組合的多態(tài)性條帶

Tab.3 Polymorphic bands of different primer combinations ofZeniainsignis

引物組合多態(tài)性條帶數(shù)量多態(tài)性條帶占比/%Me8/Em51066．67Me9/Em6861．54Me2/Em9969．23Me3/Em9866．67Me7/Em101076．92Me9/Em14981．18Me17/Em141076．92Me2/Em15666．67Me2/Em161074．42Me1/Em17758．34Me24/Em211173．33Me16/Em21872．73平均值8．8370．39

從表4可以看出，任豆17個種源的多態(tài)位點比率為38.96%～72.73%，平均為59.66%。其中貴州冊亨種源的多態(tài)位點比率最高(72.73%)，廣西靈川種源的最低(38.96%)。由此表明：任豆種源間具有較高的多態(tài)位點比率，在種源內(nèi)也存在較豐富的遺傳多樣性。種源內(nèi)遺傳多樣性豐富有利于任豆對環(huán)境變化的適應。

表4 不同種源任豆的多態(tài)位點

Tab.4 Polymorphic loci forZeniainsignisfrom different provenances

種源多態(tài)位點數(shù)多態(tài)位點比率/%廣西靖西7558．44廣西都安7761．04廣西羅城7761．04廣西桂林8470．13廣東陽山7761．04湖南江華7254．55廣西靈川6038．96湖南通道7153．25廣西德保7355．84廣西平果7558．44廣西那坡7862．34貴州冊亨8672．73云南西疇8064．94云南麻栗坡7862．34貴州梵凈山7051．95貴州羅甸7761．04廣東樂昌8166．23平均值75．859．66

2.2 任豆種源的遺傳分化

各個種源的遺傳多樣性水平高低，可采用基因多樣性指數(shù)(h)和Shannon信息指數(shù)(I)2種表型多樣性指數(shù)來衡量。從表5可以看出：不同種源任豆的基因多樣性指數(shù)差異明顯。其中貴州冊亨種源的基因多樣性指數(shù)最高，達0.313 3，廣西靈川種源的基因多樣性指數(shù)最低，為0.175 5，全部種源間的基因多樣性指數(shù)為0.285 8。不同種源任豆的Shannon信息指數(shù)以貴州冊亨種源最高，達0.450 2，以廣西靈川種源的Shannon信息指數(shù)最低，為0.249 4，全部種源間的Shannon信息指數(shù)為0.418 6。綜合基因多樣性和Shannon 2個指數(shù)，貴州冊亨和廣西桂林種源的遺傳多樣性水平較高，而貴州梵凈山和廣西靈川種源的遺傳多樣性水平較低，這可能與采種地的任豆林分布密集程度相關。此外，從表5還可以看出：17個種源任豆的觀測等位基因數(shù)(na)為1.389 6～1.727 3，平均達1.600 0，種源水平的na為1.724 9；有效等位基因數(shù)(ne)為1.330 5～1.577 3，平均達1.471 3，種源水平的ne為1.502 6。以上分析結果均反映出任豆種源具有一定的遺傳多樣性。

表5 各種源任豆的遺傳多樣性
Tab.5 Genetic diversities inZeniainsignisfrom different provenances

種源觀測等位基因數(shù)(na)有效等位基因數(shù)(ne)基因多樣性指數(shù)(h)Shannon信息指數(shù)(I)廣西靖西1．58441．48890．26080．3715廣西都安1．61041．48630．26360．3786廣西羅城1．61041．44540．24900．3626廣西桂林1．70131．57300．30800．4405廣東陽山1．61041．48630．26360．3786湖南江華1．54551．42440．23200．3344廣西靈川1．38961．33050．17550．2494湖南通道1．53251．45980．24270．3441廣西德保1．55841．45730．24560．3512廣西平果1．58441．44790．24610．3556廣西那坡1．62341．49190．26750．3848貴州冊亨1．72731．57730．31330．4502云南西疇1．64941．48250．26800．3892云南麻栗坡1．62341．47820．26260．3795貴州梵凈山1．51951．37920．21190．3087貴州羅甸1．61041．50680．27100．3865廣東樂昌1．66231．52220．28410．4087種源間1．72491．50260．28580．4186

任豆種源的遺傳多樣性相關指數(shù)顯示，任豆所有種源總基因多樣度(Ht)為0.382 6，種源群體內(nèi)的基因多樣度(Hs)為0.256 8，種源遺傳分化系數(shù)(Gst)為0.328 8。這表明任豆種源內(nèi)存在一定的遺傳多樣性。此外，任豆的基因流(Nm)為1.020 7，與其他異花授粉植物相比偏小，說明任豆種源間存在一定的基因交流，但偏少。種源間的遺傳變異占總遺傳變異的32.88%，67.12%的遺傳變異發(fā)生在種源內(nèi)的個體間，表明任豆種源間存在一定的遺傳分化，但遺傳變異主要還是來源于種源內(nèi)。

2.3 任豆種源間遺傳一致度和遺傳距離

遺傳一致度可用來判斷種源之間的親緣關系。當2個種源無親緣關系時，遺傳一致度為0，當2個群體完全一樣時，遺傳一致度為1。為了進一步了解任豆種群間的遺傳關系，表6列出了17個任豆種源的遺傳一致度和遺傳距離。從表6可知，廣西德保種源與云南西疇種源的遺傳一致度最小，僅為0.703 1，二者遺傳距離最大，為0.352 3。而廣西都安與廣西羅城、云南西疇與云南麻栗坡種源的遺傳一致度最大，達0.886 5，遺傳距離最小，為0.120 5。種源之間的親緣關系雖然比較近，但仍然存在一定程度的遺傳差異和遺傳分化。

運用IBD軟件對任豆遺傳距離及地理距離進行Mantel檢驗，結果表明，任豆種源間遺傳距離與地理距離之間的相關性達到極顯著水平(r=0.312 5，P=0.001)。

2.4 任豆種源聚類分析

根據(jù)Nei[8]的遺傳距離，采用UPGMA聚類分析，繪制任豆種源遺傳關系聚類圖(圖2)。以遺傳一致度為0.78為界，可以將17個種源分為3大類。第1類來自廣西、貴州，包含有廣西靖西、都安、羅城等種源和貴州羅甸、梵凈山、冊亨種源；第2類來自廣東、湖南和廣西，包括廣東陽山、樂昌種源，湖南江華和通道種源，以及廣西靈川種源；第3類僅來自云南，包括云南西疇和麻栗坡種源。從聚類結果可以看出，地理距離相近的種源幾乎都聚在了同一類群。

表6 任豆種源間的遺傳一致度和遺傳距離1)
Tab.6 Genetic identity degrees and genetic distances betweenZeniainsignisfrom different provenances

種源123456789101112131415161710．84720．83840．73360．75550．74670．80350．80790．82530．84720．82530．76860．74670．72050．79040．80350．742420．16590．88650．79910．75980．81220．76420．79480．82970．83410．81220．79910．71620．71620．79480．80790．772930．17620．12050．84280．75110．82970．77290．76860．82100．83410．85590．79910．74240．71620．77730．75550．755540．30980．22420．17100．77730．80350．76420．75110．74240．75550．81220．81660．73360．71620．76860．72930．772950．28040．27470．28620．25190．86030．77730．79910．75550．76860．73800．75110．80790．81660．78170．73360．864660．29210．20800．18670．21880．15050．79480．82530．77290．81220．77290．77730．76420．79910．79910．74240．812270．21880．26890．25760．26890．25190．22970．84720．79480．73800．73360．73800．70740．72490．79480．79040．764280．21340．22970．26320．28620．22420．19200．16590．80790．77730．72050．79480．73800．75550．79040．79480．803590．19200．18670．19730．29790．28040．25760．22970．21340．85590．77290．77730．70310．73800．79910．79480．8035100．16590．18140．18140．28040．26320．20800．30380．25190．15560．85590．76420．71620．71620．78600．80790．7904110．19200．20800．15560．20800．30380．25760．30980．32780．25760．15560．80350．74670．72050．73800．75980．7249120．26320．22420．22420．20260．28620．25190．30380．22970．25190．26890．21880．79480．73360．79480．80790．7729130．29210．33390．29790．30980．21340．26890．34610．30380．35230．33390．29210．22970．88650．74670．74240．7686140．32780．33390．33390．33390．20260．22420．32170．28040．30380．33390．32780．30980．12050．79040．74240．7773150．23520．22970．25190．26320．24630．22420．22970．23520．22420．24080．30380．22970．29210．23520．84720．7773160．21880．21340．28040．31570．30980．29790．23520．22970．22970．21340．27470．21340．29790．29790．16590．7817170．29790．25760．28040．25760．14550．20800．26890．21880．21880．23520．32170．25760．26320．25190．25190．2463

1)對角線上方為遺傳一致度，對角線下方為遺傳距離； 任豆種源分別為 1：廣西靖西, 2：廣西都安, 3：廣西羅城, 4:廣西桂林, 5:廣東陽山, 6:湖南江華, 7:廣西靈川, 8:湖南通道, 9:廣西德保, 10:廣西平果, 11:廣西那坡, 12:貴州冊亨, 13:云南西疇, 14:云南麻栗坡, 15:貴州梵凈山, 16:貴州羅甸, 17:廣東樂昌。

圖2 任豆種源UPGMA聚類圖Fig.2 Dendrogram based on genetic distances among Zenia insignis from different provenances

3 討論與結論

SRAP-PCR反應體系受諸多因素的影響。本試驗建立并優(yōu)化了任豆SRAP-PCR反應體系，并進行了任豆種源遺傳多樣性分析。本試驗所得到的任豆SRAP-PCR擴增體系與麻瘋樹Jatrophacarcas[10]、油茶Camelliaoleifera[11]、楊樹Populusadenopoda[12]等的擴增體系及循環(huán)條件都有所不同，可能與不同材料的基因組和材料本身的特殊性以及讀帶時主觀性等因素有關，因此需要對PCR體系進行優(yōu)化，對任豆模板DNA 、Mg2+、引物和Taq酶等關鍵條件水平進行探索。研究發(fā)現(xiàn)，SRAP對任豆DNA濃度的要求不高，有一個較寬的適宜濃度范圍。經(jīng)過反復試驗后，根據(jù)電泳條帶的數(shù)量、清晰度及背景顏色等條件為所得條帶綜合評分。最終探索出的25 μL體系為：10×PCR buffer 2.5 μL、模板DNA 80 ng、Mg2+2.0 mmol·L-1、dNTP 0.225 mol·L-1、引物0.3 μmol·L-1和TaqDNA聚合酶1.25 U。該體系實現(xiàn)了最佳擴增的目的。以廣西平果、廣西那坡、湖南通道、湖南江華、廣東陽山、貴州冊亨的6個任豆種源DNA為模板，選取引物Me7/Em8進行SRAP-PCR反應體系穩(wěn)定性驗證，結果表明，篩選體系能很好地滿足任豆基因組SRAP-PCR擴增的要求，且不同種源間條帶有明顯差異。對篩選出的12對引物組合進行PCR擴增，平均每對引物擴增出8.83條帶，多態(tài)帶比率平均為70.39%，較好地顯示了任豆的多態(tài)性。

多態(tài)位點比率、Shannon信息指數(shù)和基因多樣性指數(shù)作為評價種群內(nèi)和種群間遺傳多樣性的指標，其數(shù)值越大，表明種群的遺傳多樣性越高。據(jù)測定，17個任豆種源平均多態(tài)位點比率達到59.66%，種源間Shannon信息指數(shù)為0.249 4～0.450 2，平均為0.369 1，基因多樣性指數(shù)在0.175 5～0.313 3，平均為0.256 8。與其他樹種相比，任豆種群遺傳多樣性并不高。例如，楓香Liquidambarformosana、木荷Schimasuperba、油松Pinustabuliformis、蠟梅Chimonanthuspraecox群體多態(tài)位點比率分別為87.41%、90.02%、91.67%、88.70%[13]。此外，近幾年基于SPRAP分子標記的木本植物遺傳多樣性研究結果表明：紅椎Castanopsishystrix多態(tài)性比率為94.89%[13]，小果油茶Camelliameiocarpa多態(tài)性比率和Shannon信息指數(shù)分別為84.96%～95.58%和0.4732～0.5676[14]；白花樹Styraxtonkinensis在物種水平上的多態(tài)位點比率為91.0%，Shannon表型多樣性指數(shù)為0.453 6[15]；側柏Platycladusorientalis的Shannon信息指數(shù)為0.194 9[16]；大花黃牡丹Paeonialudlowii多態(tài)位點比率為90.15%，Shannon信息指數(shù)平均為0.252 1[17]；構樹Broussonetiapapyrifera多態(tài)位點比率為72.6%，Shannon信息指數(shù)均值為0.227 5[18]。

不同種源的遺傳多樣性差異較大，而物種遺傳多樣性水平?jīng)Q定著物種對選擇的反應能力，是制定物種遺傳多樣性保護與利用策略的必需信息。貴州冊亨和廣西桂林種源的遺傳多樣性水平較高，這可能與其生境多樣復雜、地理隔離特殊等因素有關，從而有利于遺傳變異的積累。在開展任豆種質資源保護中，應更加重視對貴州冊亨和廣西桂林等遺傳多樣性水平較高種群的保護。

任豆種源間和種源內(nèi)均存在顯著的遺傳變異。其中，種源間的遺傳變異占總遺傳變異的32.88%，種源內(nèi)的個體間遺傳變異占67.12%，說明任豆種源內(nèi)個體間的遺傳變異是主要的。Hamrick等[19]總結了322種木本植物的遺傳結構，認為廣布、異交且種子隨風傳播或鳥獸取食的木本植物，其群體內(nèi)的遺傳多樣性比群體間更豐富。根據(jù)目前國內(nèi)所報道的木本植物遺傳多樣性的研究結果，所有樹種的遺傳多樣性主要來自種群內(nèi)個體間。例如，麻瘋樹[10]、小果油茶[14]、白花樹[15]、側柏[16]和大花黃牡丹[17]等，都表明種群間的遺傳多樣性小于種群內(nèi)個體間。 因此，任豆遺傳改良要注重優(yōu)良種源選擇，更要注重種源內(nèi)個體的選擇。

物種基因流是影響植物種群遺傳結構的重要因子[20]，對物種形成及其適應性進化有積極的作用?；蛄髟酱?，群體間花粉和種子互相遷移的頻率越高，則種源間相似性就越大。受限制的基因流使群體間發(fā)生分化，因為每個群體中都會或多或少的獨立發(fā)生適應演變和遺傳漂變。植物瀕危的原因是多方面的，遺傳多樣性貧乏可造成種群或物種難以適應變化的環(huán)境，人為破壞和過度采伐也可能導致植物瀕危。任豆為國家二級保護植物，隨著人類對天然林的砍伐、破壞，導致任豆種群的片段化，降低了種群間的基因交流，造成有效群體較小，種群間出現(xiàn)遺傳分化。 一般認為，基因流有利于珍稀瀕危植物的保護，當基因流>1時，基因流就可以防止種群之間由遺傳漂變引起的遺傳分化，當基因流<1時，就會產(chǎn)生遺傳漂變，導致種群間遺傳結構的變化。經(jīng)估算，任豆的基因流(Nm)為1.020 7。與其他樹種相比，任豆基因流不高。例如，西伯利亞杏Armeniacasibirica群體間的基因流為3.836 0[21]，花楸樹Zanthoxylumbungeanum的基因流為3.047 2[22]。 由于任豆種群間基因流不高，長期隔離會導致地理遺傳變異，雖然任豆種源間的遺傳變異小于種群間，但仍然達到32.88%。

根據(jù)任豆種群間遺傳一致度聚類結果，可將17個種群大體分為3大類：第1類為廣西和貴州種源；第2類為廣東、湖南和廣西種源；第3類為云南種源?；旧系乩砭嚯x相近的種源聚為一類，地理格局明顯。地理距離和遺傳距離的相關性錯綜復雜，受植物的進化、分布格局等影響較大。很多植物的遺傳距離均與地理距離相關，如香果樹Emmenopteryshenryi[23]、紫丁香Syringaoblata[24]、西伯利亞杏[21]和栓皮櫟Quercusvariabilis[25]等。Mantel檢驗表明，任豆種群間的遺傳距離和地理距離之間的相關性達到極顯著水平(r=0.312 5，P=0.001)。這也解釋了任豆各種源類群地理格局明顯的現(xiàn)象。3個種源類群間所處地形差異較大，一定程度造成了地理隔離。第1類群處于任豆分布區(qū)域高海拔地區(qū)，第2類群基本處于海拔較低的平原地帶，第3類群為云南種源，與其他2類相距甚遠，處于地理封閉狀態(tài)。由于西南山區(qū)的地形等特定的隔離機制阻礙了群體間基因的交流，造成種群之間的差異。

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【責任編輯 李曉卉】

Genetic diversity of Zenia insignis based on SRAP markers

LIN Wei, ZHOU Wei, ZHOU Peng, ZHOU Xiangbin, WU Linying, CHEN Xiaoyang

(College of Forestry and Landscape Architecture, South China Agricultural University/Guangdong Key Laboratory for Innovation Development and Utilization of Forest Plant Germplasm/Guangdong Research Center of Woody Forage Engineering Technology, Guangzhou 510642, China)

【Objective】 To study population genetic diversity ofZeniainsignis, and to provide a basis forZ.insignisgermplasm protect and promote genetic improvement.【Method】 Base on establishing of SRAP-PCR system inZ.insignis, the genetic diversity among 17 provenances was analyzed. UPGMA clustering analysis was used to divideZ.insignisprovenances into different groups.【Result】 A total of 151 bands were amplified from 12 primer pairs, and in average 12.58 bands were amplified from each primer pair. There were 106 polymorphic bands, in average 8.83 bands per primer sets, and the average percentage of polymorphic bands was 70.39%. The ratios of polymorphic loci among provenances were 38.96%-72.73%, and 59.66% in average. The genetic diversity indices were 0.175 5-0.313 3, and 0.256 8 in average. The Shannon information indices were 0.249 4-0.450 2, and 0.369 1 in average. The numbers of alleles (na) observed were 1.519 5-1.727 3, and 1.600 0 in average. The number of alleles (na) at the provenance level was 1.724 9. The numbers of effective alleles (ne) were 1.330 5-1.577 3, and 1.4713 in average. The number of effective alleles (ne) at the provenance level was 1.502 6. The genetic identity degrees among provenances were 0.703 1-0.886 5.The genetic distances were 0.120 5-0.352 3. According to cluster analysis, 17 provenances were divided into three groups. The first group included Guangxi and Guizhou provenances. The second group included Guangdong, Hunan and Guangxi provenances. The third group only included Yunnan provenance. The provenances with geographic proximity were generally clustered into the same group.【Conclusion】The genetic diversity is abundant amongZ.insignisprovenances and among individuals within provenance, but is mainly from individuals within provenance. Therefore more attention should be paid to individuals in genetic improvement ofZ.insignis. Both the low level of gene flow among provenances and three clear geographic clustering should be caused by the geographic isolation due to the specific living environment ofZ.insignis.

Zeniainsignis; provenance; SRAP; genetic diversity

2016- 02- 23優(yōu)先出版時間：2016-12-28

林 瑋(1989—)，男，碩士研究生，E-mail:35417328@qq.com；通信作者：陳曉陽(1958—)，男，教授，博士，E-mail:xychen@scau.edu.cn

863計劃專項(2011AA10020203)

S792.99

A

1001- 411X(2017)01- 0082- 08

優(yōu)先出版網(wǎng)址：http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1110.s.20161228.0924.020.html

林 瑋，周 瑋，周 鵬，等.基于SRAP標記的任豆遺傳多樣性分析[J].華南農(nóng)業(yè)大學學報，2017,38(1):82- 89.