南方水稻黑條矮縮病毒安徽分離物S5片段的克隆及S5-2基因的原核表達(dá)

江 彤，單文書，夏偉偉，張享享，蔣西子

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院, 安徽 合肥 230036)

南方水稻黑條矮縮病毒安徽分離物S5片段的克隆及S5-2基因的原核表達(dá)

江 彤，單文書，夏偉偉，張享享，蔣西子

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院, 安徽 合肥 230036)

【目的】探討南方水稻黑條矮縮病毒(Southern rice black-streaked dwarf virus，SRBSDV)安徽分離物(SRBSDV-AnHui-HN2)的遺傳特性，并獲得原核表達(dá)的P5-2蛋白?！痉椒ā縍T-PCR擴(kuò)增SRBSDV S5片段，克隆、測序并進(jìn)行序列分析。將S5-2基因插入原核表達(dá)載體，重組載體轉(zhuǎn)化大腸埃希菌并用IPTG誘導(dǎo)，Ni2+-NTA親和柱純化融合蛋白，SDS-PAGE分析P5-2蛋白的表達(dá)情況?！窘Y(jié)果】SRBSDV-AnHui-HN2 S5片段全長3 167 bp，包含S5-2基因全長612 bp，編碼204個氨基酸。序列比對結(jié)果顯示，SRBSDV-AnHui-HN2 S5片段與其他SRBSDV分離物S5片段的序列相似性極高，達(dá)99.0%～99.7%，而與斐濟(jì)病毒屬(Fijivirus)其他成員S5片段的序列相似性較低，僅為38.0%～71.3%；構(gòu)建的 S5片段系統(tǒng)發(fā)育樹表明SRBSDV和RBSDV聚成1個分支，其中6個SRBSDV分離物聚成1個亞分支。原核表達(dá)獲得相對分子質(zhì)量約為47 000的重組蛋白，Western blot分析顯示，GST單抗能夠與重組融合蛋白發(fā)生特異性反應(yīng)?！窘Y(jié)論】SRBSDV各分離物之間親緣關(guān)系非常近，而與Fijivirus其他成員親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，原核表達(dá)獲得的融合蛋白為靶標(biāo)蛋白。

南方水稻黑條矮縮病毒； S5片段；S5-2基因； 原核表達(dá)

南方水稻黑條矮縮病毒(Southern rice black-streaked dwarf virus, SRBSDV)為呼腸孤病毒科Reovirides斐濟(jì)病毒屬Fijivirus[1]。該病毒由遷飛性昆蟲介體白背飛虱Sogatellafurcifera傳播[2]，病毒可在蟲體內(nèi)增殖，蟲體一旦獲毒，可終身帶毒[3]。研究[4]表明SRBSDV可侵染水稻Oryzasativa、玉米Zeamays、稗草Echinochloacrusgalli和白草Pennisernmflaccidum等多種禾本科植物。感染SRBSDV的水稻表現(xiàn)出植株矮縮、葉色深綠、節(jié)部氣生須根倒生等典型癥狀[5]。近年來，由于耕作制度的改變、氣候變暖和白背飛虱暴發(fā)等多種因素的影響，SRBSDV在我國多個省市流行成災(zāi)。2009年，SRBSDV在江西、湖南和廣東等部分地區(qū)嚴(yán)重發(fā)生，受害面積超過30萬hm2，約6 500 hm2水稻絕收[6-7]。2010年，SRBSDV在安徽省6市26縣水稻種植區(qū)大發(fā)生，受災(zāi)面積約3.3萬hm2[8]。

SRBSDV病毒粒體為正二十面體等軸狀粒子，直徑70～75 nm，其基因組由 10 條 dsRNA 組成，分別命名為S1～S10，共編碼 13 個蛋白[1,9]。根據(jù)水稻黑條矮縮病毒(Rice black-streaked dwarf virus, RBSDV)基因組結(jié)構(gòu)推測SRBSDV共編碼6個結(jié)構(gòu)蛋白(S1、S2、S3、S4、S8、S10)和7個非結(jié)構(gòu)蛋白(S5-1、S5-2、S6、S7-1、S7-2、S9-1、S9-2)[10-12]。目前，僅有部分片段編碼的蛋白功能得到注釋，S1 編碼Rep蛋白，指導(dǎo)基因組RNA的復(fù)制；S4編碼外殼蛋白的B型突起[13]；S5-2編碼的蛋白主要定位于細(xì)胞質(zhì)，且能在細(xì)胞質(zhì)中形成較大的顆粒狀聚集體[14]；S6編碼1個RNA沉默抑制子，協(xié)助病毒克服寄主的防御體系，利于病毒的侵染[15]；S7-1編碼一種小管蛋白，與病毒的胞間移動有關(guān)[10]；S8編碼核心內(nèi)衣殼蛋白，參與形態(tài)構(gòu)建[16]；S9-1編碼蛋白與病毒基質(zhì)的形成密切相關(guān)，是 dsRNA 合成及病毒組裝的重要場所[10]；S10編碼外殼蛋白，決定了該病毒的表面抗原特性[17]。

水稻葉片膠體金定位和本氏煙葉片亞細(xì)胞定位研究[18]發(fā)現(xiàn)，RBSDV編碼的13個蛋白中，僅S5-2編碼的P5-2蛋白定位在葉綠體上，RBSDV侵染水稻表現(xiàn)的葉色深綠癥狀可能與P5-2蛋白有關(guān)，推測P5-2蛋白可能是RBSDV的癥狀決定子。SRBSDVS5-2基因編碼的P5-2蛋白可能具有相似的功能，因此，本研究克隆SRBSDV安徽分離物S5片段序列，探究來源于安徽的SRBSDV S5片段與Fijivirus其他成員S5片段之間的序列差異；再進(jìn)行原核表達(dá)獲得P5-2融合蛋白，以期為深入研究P5-2蛋白的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

感染SRBSDV的水稻樣本于2012年8月采自安徽懷寧，樣本保存于-80 ℃冰箱；大腸埃希菌EscherichiacoliDH5α和BL21及原核表達(dá)載體pET-GST保存于安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院植物病理研究室；克隆載體pMD19-T、T4-DNA連接酶及DNA內(nèi)切酶購自TaKaRa公司，硝酸纖維素膜購自北京索萊寶公司，Ni2+柱購自QiaGen公司；GST-Taq·Antibody單抗、AP·羊抗小鼠IgG二抗及異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)購自美國Amersham Pharmacia公司；DNA marker、蛋白marker、PCR凝膠回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒購自天根生化科技公司；Trizol? Plus RNA Purification Kit購自北京全氏金生物科技有限公司；TaqDNA聚合酶、HiFi-MMV反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Promega公司；其余試驗藥品均購自國藥生物公司。引物合成及測序為上海Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 SRBSDV S5片段的克隆與序列分析 稱取0.1 g水稻感病樣本，加液氮研磨，再用RNA抽提試劑盒提取水稻葉片總RNA，詳細(xì)方法參照Trizol? Plus RNA Purification Kit說明書。反轉(zhuǎn)錄水稻總RNA，得到cDNA。 以cDNA為模板擴(kuò)增S5片段，引物S5-F：5′-AAGTTTTTTTCACTCATGACATATTCGA-3′/S5-R：5′-GACATCAGCTGTATTCACTCC-3′，反應(yīng)條件為 94 ℃ 45 s，53 ℃ 45 s，72 ℃ 120 s，循環(huán)30次。用純化的目的片斷連接載體pMD19-T，熱擊轉(zhuǎn)化DH5α，挑取單菌落為模板，PCR擴(kuò)增篩選陽性轉(zhuǎn)化子。根據(jù)測序結(jié)果獲得SRBSDV S5片段核苷酸序列。運(yùn)用軟件DNAMAN Version 5.22和DNAStar進(jìn)行序列分析。采用鄰近相連法(Neighbor-joining)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.2 SRBSDVS5-2基因的克隆及原核表達(dá)載體的構(gòu)建 根據(jù)SRBSDV片段S5的核苷酸序列設(shè)計擴(kuò)增引物，正向引物添加酶切位點BamH I，S5-2-F：5′-ACGGATCCATGTCTATGACACGTT-3′，反向引物添加酶切位點SalI位點，S5-2-R：5′-CCGTCGACTCA-AACATGAAGTATA-3′。以含有S5片段的質(zhì)粒DNA為模板，PCR擴(kuò)增S5-2基因，反應(yīng)條件為94 ℃ 45 s，56 ℃ 45 s，72 ℃ 60 s，循環(huán)30次。瓊脂糖電泳純化擴(kuò)增的DNA目的片段，連接載體pMD19-T，熱擊轉(zhuǎn)化DH5α，挑取單菌落PCR篩選陽性轉(zhuǎn)化子pMD-S5-2。重組載體pMD-S5-2和表達(dá)載體pET-GST均用限制性內(nèi)切酶BamH I和SalI酶切，再將S5-2基因插入表達(dá)載體pET-GST，熱擊轉(zhuǎn)化DH5α，挑取單菌落PCR篩選陽性轉(zhuǎn)化子pET-S5-2。

1.2.3 融合蛋白的表達(dá)、純化與檢測 將獲得的質(zhì)粒pET-S5-2轉(zhuǎn)化BL21，挑取陽性轉(zhuǎn)化子接種于LB培養(yǎng)基，37 ℃條件下振蕩培養(yǎng)12 h，再擴(kuò)大培養(yǎng)至菌液D600 nm= 0.6。誘導(dǎo)條件為28 ℃、10 h、0.2 mmoL·L-1IPTG。將培養(yǎng)好的菌液離心，收集菌體，在超聲破碎儀內(nèi)處理15 min，12 000 r·min-1條件下，將破碎的菌液離心 30 min；上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管，加入1 mL的鎳膠親和純化瓊脂糖(Ni2+-NTA)，過柱純化獲得融合蛋白。

共設(shè) 4 個處理的菌液，空載體pET-GST未誘導(dǎo)、空載體pET-GST誘導(dǎo)、重組載體pET-S5-2未誘導(dǎo)和重組載體pET-S5-2誘導(dǎo)。各處理菌液用PBS緩沖液重新懸浮，混入5×Buffer，在沸水中處理 5 min，再冰浴 10 min；離心后，上清液轉(zhuǎn)移到新的離心管，即為制備的上樣樣品。相同方法處理過柱純化獲得的融合蛋白制備上樣樣品。制備2塊聚丙烯酰胺凝膠，同時電泳，第 1 塊凝膠用考馬斯亮藍(lán)染色后觀察蛋白條帶，第 2 塊凝膠用作Western blot分析，先覆蓋NC膜進(jìn)行轉(zhuǎn)印，再將NC膜轉(zhuǎn)移至 50 g·L-1奶粉溶液中，25 ℃輕微振蕩處理 2 h，加入稀釋 2 000 倍的GST-Taq·Antibody單抗(一抗)，25 ℃條件下振蕩處理 1 h，PBST溶液沖洗 3 次，再用稀釋 2 000 倍的AP·羊抗小鼠IgG(二抗)振蕩處理 2 h，PBST溶液沖洗 5 次，最后加入NBT/BCIP顯色。

2 結(jié)果與分析

2.1 SRBSDV S5片段的克隆與序列分析

將PCR擴(kuò)增的SRBSDV安徽分離物(SRBSDV-AnHui-HN2)S5片段克隆并測序，序列長度為3 167 bp，序列的GenBank登錄號為：HF954999。比對SRBSDV-AnHui-HN2 S5片段和NCBI下載的斐濟(jì)病毒屬(Fijivirus)其他分離物S5片段的序列相似性，發(fā)現(xiàn)SRBSDV-AnHui-HN2 S5片段與其他SRBSDV S5片段的序列相似性極高，達(dá)99.0%～99.7%，而與其他Fijivirus成員S5片段的序列相似性較低，僅為38.0%～71.3%(表1)。

表1 SRBSDV-Anhui-HN2 S5片段與16個斐濟(jì)病毒屬其他分離物S5片段核苷酸序列的相似性

Tab.1 Nucleotide sequence similarity between S5 segment of SRBSDV-Anhui-HN2 and S5 segments of 16 other isolates ofFijivirus

分離物GenBank登錄號來源地相似性/%SRBSDV?Anhui?HN2HF954999中國安徽100．0SRBSDV?VNMJQ692576越南99．7SRBSDV?HuNyyJQ034352中國湖南99．5SRBSDV?HubeiHM585275中國湖北99．4SRBSDV?YN?MShiJQ773424中國云南99．2SRBSDV?HNFN563993中國海南99．0RBSDV?HBKC134293中國河北71．3RBSDV?JSKM921677中國江蘇71．1RBSDV?SDZZ10JX421768中國山東70．2RBSDV?MX8HF954989中國安徽70．2RBSDV?Anhui?LJHF955009中國安徽70．2RBSDV?WZKC801047中國浙江70．1RBSDV?LHKC801046中國浙江70．0RBSDV?KoreanHQ670667韓國69．9FDV?AUSNC＿007160澳大利亞49．9MRCV?ArgAY607587阿根廷64．1NLRV?TSUD49697古巴38．0

構(gòu)建SRBSDV安徽分離物與Fijivirus其他成員S5核苷酸序列系統(tǒng)關(guān)系樹(圖1)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SRBSDV和RBSDV聚成一個分支，其中6個SRBSDV分離物聚成一個亞分支，8個RBSDV分離物聚成另一個亞分支。而里奧夸爾托病毒(Mal de Rio Cuarto virus, MRCV)、稻飛虱呼腸孤病毒(Nilaparvata lugens reovirus, NLRV)和斐濟(jì)病病毒(Fiji disease virus, FDV)分別單獨(dú)聚成一個分支。

圖1 基于S5片段核苷酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)關(guān)系樹

Fig.1 Relationship dendrogram of SRBSDV-Anhui-HN2 and other isolates ofFijivirusbased on S5 segment sequences

2.2 SRBSDV S5-2重組表達(dá)載體的構(gòu)建

PCR擴(kuò)增的模板為含有S5片段的質(zhì)粒DNA，引物為S5-2-F和S5-2-R，只能擴(kuò)增出1條約600 bp的條帶，將此特異性條帶克隆并測序，證明插入pMD19-T simple的S5-2基因沒有發(fā)生變異。再將S5-2基因亞克隆到原核表達(dá)載體pET-GST上，BamH I和SalI雙酶切驗證，片段大小和理論值完全相符(圖2)，測序驗證S5-2基因序列未發(fā)生突變，說明插入的S5-2基因讀碼框正確。

2.3 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與純化

從圖3a 可以看出，pET-S5-2誘導(dǎo)表達(dá)的P5-2蛋白條帶相對分子質(zhì)量大約為47 000，與理論預(yù)測完全符合。從圖3b 可以看出，GST-Taq·Antibody單抗可以和pET-S5-2誘導(dǎo)表達(dá)的P5-2融合蛋白以及純化的P5-2融合蛋白特異性結(jié)合，在蛋白相對分子質(zhì)量47 000的P5-2融合蛋白位置均出現(xiàn)一條明顯的條帶；而pET-GST空載體未誘導(dǎo)、pET-GST空載體誘導(dǎo)和pET-S5-2未誘導(dǎo)3個處理，各個泳道蛋白相對分子質(zhì)量47 000位置均未出現(xiàn)條帶。

M：DNA marker DL2000； 1：BamH I和SalI雙酶切pET-S5-2； 2：BamH I單酶切pET-S5-2；3：SalI單酶切pET-S5-2；4：重組質(zhì)粒pET-S5-2。

圖2 重組質(zhì)粒pET-S5-2的酶切電泳圖譜

Fig.2 Electrophoresis pattern of recombinant plasmid pET-S5-2 digested with restriction enzyme

M：分子質(zhì)量蛋白Marker；1：pET-GST空載體未誘導(dǎo)；2：pET-GST空載體誘導(dǎo)；3：pET-S5-2未誘導(dǎo)；4：pET-S5-2誘導(dǎo)；5：純化的融合蛋白。

圖3 融合蛋白的SDS-PAGE和Western blot分析

Fig.3 SDS-PAGE and Western blot analysis of fusion protein

3 討論與結(jié)論

序列比對發(fā)現(xiàn)SRBSDV-AnHui-HN2與其他SRBSDV各分離物S5片段的序列相似性極高，說明SRBSDV S5片段核苷酸序列在序列進(jìn)化過程中非常保守。系統(tǒng)關(guān)系樹表明SRBSDV和RBSDV聚成一個分支，而NLRV、FDV和MRCV分別單獨(dú)聚成一個分支。研究發(fā)現(xiàn)，SRBSDV和RBSDV同屬于Fijivirus屬亞組II，SRBSDV和RBSDV的血清學(xué)關(guān)系較強(qiáng)[19]，均為害水稻和玉米，主要發(fā)病地區(qū)是東亞和東南亞，但SRBSDV的傳播介體是白背飛虱，RBSDV的傳播介體是灰飛虱Laodelphaxstriatellus[2]。NLRV屬于Fijivirus屬亞組V，只能侵染褐飛虱Nilaparavatalugens，與Fijivirus屬其他成員沒有任何血清學(xué)關(guān)系[20]。FDV屬于Fijivirus屬亞組I，傳播介體是甘蔗扁角飛虱Perkinsiellaspp.，自然寄主為甘蔗Saccharumofficinarum，主要發(fā)病地區(qū)是澳大利亞，與Fijivirus屬其他成員也沒有任何血清學(xué)關(guān)系[21]。MRCV雖屬于Fijivirus屬亞組II，但其傳播介體是明飛虱Delphacodeskuscheli，主要寄主是玉米，也能侵染高粱SorghumbicolorL.、小麥TriticumaestivumLinn.和燕麥AvenasativaL.等禾本科作物，一般發(fā)生于南美洲的阿根廷和巴西南部，與SRBSDV和RBSDV血清學(xué)關(guān)系均較弱[22]。

張蔚明等[17]制備的SRBSDV P10蛋白特異性抗血清，可用于帶毒白背飛虱和感病水稻寄主的快速檢測。羊健等[16]原核表達(dá)了RBSDV P8蛋白并制備了P8蛋白的多抗血清，可用于RBSDV田間病株的快速診斷。張上林等[23]原核表達(dá)了RBSDV P7-2蛋白，與水稻總蛋白進(jìn)行了Pull-Down試驗，鑒定出與P7-2互作的4個水稻蛋白。本研究利用載體pET-GST獲得了帶有6×His和GST雙標(biāo)簽的P5-2融合蛋白，28 ℃、10 h和0.2 mmol·L-1IPTG條件下誘導(dǎo)，P5-2蛋白能夠快速、大量地表達(dá)，但表達(dá)的P5-2蛋白為沉淀蛋白，缺乏生物活性，可用于抗血清制備，但不能進(jìn)行蛋白互作試驗[24]。為了獲得具有生物活性的可溶性蛋白，需降低誘導(dǎo)溫度，延長誘導(dǎo)時間，調(diào)整IPTG誘導(dǎo)濃度等優(yōu)化誘導(dǎo)條件，提高可溶性蛋白的表達(dá)量，為開展Pull-down和Co-IP等蛋白互作試驗奠定基礎(chǔ)。

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【責(zé)任編輯 霍 歡】

Prokaryotic expression of S5-2 gene and cloning of S5 segment from Anhui isolate of Southern rice black-streaked dwarf virus

JIANG Tong, SHAN Wenshu, XIA Weiwei, ZHANG Xiangxiang, JIANG Xizi

(School of Plant Protection, Anhui Agricultural University, Hefei 230036, China)

【Objective】 To study genetic characteristics of the isolates of Southern rice black-streaked dwarf virus(SRBSDV) from Anhui province, and to obtain P5-2 protein by prokaryotic expression. 【Method】The S5 segment of SRBSDV was amplified by RT-PCR, and it was cloned, sequenced and analyzed. GeneS5-2 was inserted into prokaryotic expression vector. The recombinant vector was transformed intoEscherichiacoliand was induced by IPTG. The fusion protein was purified by Ni2+-NTA affinity column. The expression of P5-2 protein was analyzed by SDS-PAGE. 【Result】 The S5 segment from Anhui isolate of SRBSDV(SRBSDV-AnHui-HN2) was 3 167 bp in full length and contained a 612 bpS5-2 gene encoding 204 amino acids. Sequence comparison showed that the S5 segment of SRBSDV-AnHui-HN2 shared high sequence similarity(99.0%-99.7%) with other SRBSDV isolates, while had relatively low sequence similarity(38.0%-71.3%) to otherFijivirusmembers. The phylogenetic tree based on S5 segment sequences showed that SRBSDV and RBSDV clustered into a branch, and six isolates of SRBSDV clustered into a sub-branch. The recombinant protein with approximately 47 000 relative molecular mass was obtained by prokaryotic expression. Western blot analysis revealed that GST monoclonal antibody could specifically bind to the fusion protein. 【Conclusion】All isolates of SRBSDV are closely related, and they have relatively far relationship to otherFijivirusmembers. The fusion protein obtained by prokaryotic expression is the target protein.

Southern rice black-streaked dwarf virus; S5 segment;S5-2 gene; prokaryotic expression

2016- 04- 18優(yōu)先出版時間：2016-12-28

江 彤(1970—)，男，副教授，博士，E-mail: jiangtong4650@sina.com

國家自然科學(xué)基金(31371915)；公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(201303028)

S435.111.4

A

1001- 411X(2017)01- 0058- 05

優(yōu)先出版網(wǎng)址：http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1110.s.20161228.0937.040.html

江 彤，單文書，夏偉偉，等.南方水稻黑條矮縮病毒安徽分離物S5片段的克隆及S5-2基因的原核表達(dá)[J].華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2017,38(1):58- 62.