谷氨酸棒狀桿菌葡萄糖代謝阻斷工程菌的構(gòu)建

韓武洋，劉金雷，杜紅燕，王北辰，儀 宏，李天明,*

谷氨酸棒狀桿菌葡萄糖代謝阻斷工程菌的構(gòu)建

韓武洋1，劉金雷1，杜紅燕1，王北辰2，儀 宏1，李天明1,*

（1.河北科技大學生物科學與工程學院，河北 石家莊 050018；2.威斯康星大學農(nóng)業(yè)與生命學院，美國 麥迪遜 53706）

采用反向代謝工程的策略，以谷氨酸棒桿菌ATCC 13032野生型為出發(fā)菌株，利用無抗性標記的同源重組方法，敲除了編碼葡萄糖pts系統(tǒng)關(guān)鍵轉(zhuǎn)運蛋白基因ptsG、ptsH-ptsI和葡萄糖轉(zhuǎn)運系統(tǒng)關(guān)鍵轉(zhuǎn)運蛋白基因abc、abc2和iolt1，得到了5 株逐次敲除了相應基因的突變株。結(jié)果表明：當以葡萄糖為唯一碳源培養(yǎng)時，CGΔptsG菌株的葡萄糖的消耗是野生型的50%，菌體OD值為1.473；CGΔptsH-ptsI菌株的葡萄糖的消耗是野生型的39.5%，菌體OD值為1.226；CGΔabc菌株的葡萄糖的消耗是野生型的36%，菌體OD值為1.092；CGΔabc2菌株的葡萄糖的消耗是野生型的26.2%，菌體OD值為0.486；CGΔiolt1葡萄糖的消耗和菌體生長OD值為0，實現(xiàn)了谷氨酸棒狀桿菌葡萄糖代謝的阻斷，說明ptsG、ptsH-ptsI、abc、abc2和iolt1所編碼的轉(zhuǎn)運蛋白具有葡萄糖轉(zhuǎn)運功能。

谷氨酸棒狀桿菌；葡萄糖；基因敲除

谷氨酸棒狀桿菌（Corynebacterium glutamicum）是重要的工業(yè)生產(chǎn)菌之一，在50多年的發(fā)展過程中，主要被用于工業(yè)生產(chǎn)風味增強劑和動物飼料中的添加劑，如谷氨酸、賴氨酸、谷氨酰胺等[1-3]。C. glutamicum可利用多種糖類和蜜糖作為原料進行工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)[4]，葡萄糖是C. glutamicum工業(yè)生產(chǎn)氨基酸等產(chǎn)品中使用最多的碳源，雖然關(guān)于C. glutamicum葡萄糖代謝及其調(diào)控的生理研究已經(jīng)有了一些報道和進展，但在葡萄糖運輸系統(tǒng)及分子水平上調(diào)節(jié)的研究相對較少[5]。近年來，C. glutamicum ATCC 13032全基因組測序的完成[6-7]和其他組學數(shù)據(jù)的積累[8]，使科研人員可以利用反向代謝工程的技術(shù)手段[9-10]，進一步探明葡萄糖運輸系統(tǒng)和分子水平上的調(diào)節(jié)，為利用代謝工程改良菌種提供理論指導，以實現(xiàn)提高葡萄糖的利用效率、促進菌體生長的目標，或者實現(xiàn)不利用葡萄糖與其他利用葡萄糖微生物共發(fā)酵生產(chǎn)的目標。

綜合目前的國內(nèi)外研究，認為谷氨酸棒狀桿菌中存在著兩條不同的葡萄糖轉(zhuǎn)運途徑[11]。一是當谷氨酸棒狀桿菌以葡萄糖為唯一碳源生長時，大部分葡萄糖會在磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)（phosphotransferase system，pts）的作用下磷酸化成6-磷酸葡萄糖，然后進入糖酵解途徑[12]；二是少部分的葡萄糖會先以葡萄糖分子的形態(tài)進入細胞內(nèi)，再在葡萄糖磷酸激酶的作用下生成6-磷酸葡萄糖進入糖酵解途徑[13-14]。根據(jù)文獻及基因組信息，可能的涉及轉(zhuǎn)運相關(guān)的基因及運輸途徑如圖1所示，但是對于有些基因的功能還不十分清楚，需要進一步研究確證。

圖11 C. glutamiiccuumm ATCC 13032葡萄糖代謝途徑[[2200]]Fig. 1 Schematic illustration of the glucose metabolic pathways of C. glutamicum ATCC 13032

本實驗以C. glutamicum ATCC 13032野生型為出發(fā)菌株，利用無抗性標記的同源重組方法，逐個敲除了調(diào)控葡萄糖pts和葡萄糖轉(zhuǎn)運系統(tǒng)關(guān)鍵酶基因ptsG、ptsH-ptsI、abc、abc2和iolt1，實現(xiàn)C. glutamicum葡萄糖代謝系統(tǒng)的阻斷，為在分子水平研究葡萄糖轉(zhuǎn)運與代謝提供參考依據(jù)。同時，也為C. glutamicum與其他葡萄糖利用微生物共發(fā)酵提供了基礎(chǔ)遺傳資源。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

本實驗所用的菌株、質(zhì)粒分別如表1所示。

表1 本實驗所用的菌株、質(zhì)粒Table1 Strains and plasmids used in this study

1.1.2 試劑

表2 本實驗所用引物Table2 PCR primers used in this study

High-Fidelity DNA聚合酶 北京全式金生物技術(shù)有限公司；限制性內(nèi)切酶XhoⅠ、Hind Ⅲ、BamHⅠ和EcoRⅠ 美國NEB公司；T4 DNA 連接酶 大連寶生物工程公司；基因組提取試劑盒、質(zhì)粒小提中量試劑盒、超薄DNA產(chǎn)物純化試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒 天根生化科技（北京）有限公司；聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成（表2）。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、NaCl 10 g/L，調(diào)pH值為6.5左右，需要時加入卡那霉素至終質(zhì)量濃度30 mg/L。固體培養(yǎng)基則添加瓊脂粉至20 g/L。

成分確定（chemical difined，CD）培養(yǎng)基：KH2PO41 g/L、(NH4)2SO43 g/L、NH4NO31 g/L、MgSO40.5 g/L、CaCl20.2 g/L、Fe2(SO4)30.01 g/L、MnSO40.01 g/L、CuSO40.002 g/L、ZnSO40.001 g/L、生物素0.002 g/L，pH 6.5左右。

孵育培養(yǎng)基：CD培養(yǎng)基、乳酸鈉50 g/L、乙酸鈉50 g/L，pH 6.5左右。

1.2 儀器與設(shè)備

HWS型培養(yǎng)箱 寧波江南儀器廠；SW-CJ型超凈工作臺 蘇凈集團安泰公司制造；PCR儀、電轉(zhuǎn)儀美國Bio-Rad公司；Neofuge23R冷凍離心機 力新儀器（上海）有限公司；pH211酸度計 意大利Hanna公司；Jl003A型電子天平 常熟雙杰測試儀器廠；DZKW-D水浴鍋 河北黃驊航天儀器廠；HYG型搖床 上海欣蕊自動化設(shè)備有限公司；F1-F2凝膠成像儀上海天能科技有限公司；PoweWave HT酶標儀 美國伯騰儀器有限公司；BCD-191W/HC冰箱 上海海爾股份有限公司；G80W23YCsL-03(RO)微波爐 上海申安醫(yī)療器械廠；Finnpipette移液槍 美國Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株培養(yǎng)

C. glutamicum ATCC 13032在30 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)，E. coli TransT1在37 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)。

1.3.2 打靶質(zhì)粒的構(gòu)建

ptsG基因敲除打靶質(zhì)粒構(gòu)建方法如下：首先以C. glutamicum ATCC 13032野生型菌株基因組為模板，利用PCR擴增出待敲除基因ptsG上游和下游同源臂片段，利用重疊PCR技術(shù)將ptsG基因的上下游同源臂融合，將所得片段純化后與pK18mobsacB空質(zhì)粒利用XhoⅠ和EcoRⅠ進行雙酶切，酶切體系（50 μL）為：XhoⅠ 1.5 μL、EcoRⅠ 1.5 μL、10×buffer 5 μL、模板2 000 ng/μL和超純水，37 ℃條件下反應3 h。目的片段與pK18mobsacB空質(zhì)粒酶切產(chǎn)物通過超薄DNA產(chǎn)物回收試劑盒回收，再通過T4連接酶16 ℃過夜連接。連接體系（25 μL）為：目的片段酶切產(chǎn)物5 μL、pK18mobsacB空質(zhì)粒酶切產(chǎn)物1 μL、10×buffer 1.25 μL、T4連接酶0.5 μL、超純水17.25 μL。連接過程應在冰上操作并充分混勻。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E. coli TransT1感受態(tài)中，轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒，經(jīng)酶切驗證后獲得打靶質(zhì)粒pK18mobsacB/ΔptsG。構(gòu)建示意圖如圖2所示。

圖2 pK18mobsaaccBB/ΔppttssGG構(gòu)建示意圖Fig. 2 Schematic illustration of construction of pK18mobsacB/ΔptsG

本實驗所涉及的敲除ptsH-ptsI、abc、abc2和iolt1基因打靶質(zhì)粒利用類似方法構(gòu)建，分別獲得打靶質(zhì)粒pK18mobsacB/ΔptsH-ptsI、pK18mobsacB/Δabc、pK18mobsacB/Δabc2和pK18mobsacB/Δiolt1。

1.3.3 C. glutamicum感受態(tài)的制備及轉(zhuǎn)化

C. glutamicum感受態(tài)細胞制備方法參考Jang等[15]，將過夜培養(yǎng)的菌株按體積分數(shù)10%接種于三角瓶中培養(yǎng)，當OD600nm達到0.35～0.45時，于4℃條件下4 000 r/min離心5 min收集菌體，4 ℃條件下利用10%甘油吹懸漂洗2 次，取約5 μg打靶質(zhì)粒與40 μL感受態(tài)細胞輕輕混合，轉(zhuǎn)入電擊杯，靜置5 min后進行電擊（電擊條件：2.5 kV/cm電壓、250 Ω電阻、25 μF電容、2 mm電擊杯）。電擊完成后，30 ℃、180 r/min條件下孵育培養(yǎng)4 h，涂布于含有卡那霉素抗性的固體培養(yǎng)基上，30 ℃條件下培養(yǎng)約40 h，固體培養(yǎng)基平板上長出均勻單菌落，挑取單菌落進行篩選。

1.3.4 工程菌株的篩選及鑒定

將單菌落擴培至含卡那霉素抗性的LB固體平板上，經(jīng)菌落PCR驗證，確定打靶質(zhì)粒經(jīng)同源重組整合到染色體上。選取驗證正確的轉(zhuǎn)化子，在無抗性壓力條件下振蕩培養(yǎng)6 h，稀釋涂布于含有10%蔗糖的LB固體平板上，利用蔗糖致死基因sacB反向篩選出發(fā)生第2次同源重組的轉(zhuǎn)化子，挑取蔗糖平板上單菌落，分別轉(zhuǎn)接至卡那霉素抗性平板及10%蔗糖平板上，能在蔗糖平板上生長但不能在卡那霉素抗性平板生長的菌株即為發(fā)生第2次重組的菌株，但可能是突變菌株和恢復突變菌株兩種可能，通過設(shè)計相對應的驗證引物來進行菌落PCR驗證，從而獲得陽性工程菌。

1.3.5 工程菌株搖瓶發(fā)酵

從新鮮活化的LB固體平板上刮取菌株于種子培養(yǎng)基中，30 ℃條件下培養(yǎng)14 h，將種子液4 000 r/min離心2 min收集菌體，并用0.9%生理鹽水洗滌1～2 次，接種于含2%葡萄糖的CD培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)接前后OD600nm保持不變。培養(yǎng)溫度30 ℃，搖床轉(zhuǎn)速180 r/min，pH 7.0左右，發(fā)酵過程中間歇性調(diào)節(jié)pH值，使發(fā)酵液pH值保持在7.0左右，并于不同時間檢測菌體濃度并取樣保留，利用葡萄糖測定儀測定樣品中殘留的葡萄糖濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 ptsG基因缺失菌株構(gòu)建及葡萄糖利用特性

2.1.1 ptsG基因敲除打靶質(zhì)粒構(gòu)建

圖3 PCR產(chǎn)物（A）和打靶質(zhì)粒pK18mobsaaccBB/ΔppttssGG酶切驗證（BB）Fig. 3 PCR products (A) and identification of targeting plasmid pK18mobsacB/ΔptsG by enzymatic digestion (B)

ptsG是葡萄糖pts特異酶EⅡ的編碼基因。以C. glutamicum ATCC 13032基因組DNA為模板，經(jīng)PCR擴增獲得上下同源臂，利用重疊PCR融合獲得目的片段，大小為2 900 bp，結(jié)果如圖3A所示。將目的片段與空質(zhì)粒pK18mobsacB連接，獲得重組質(zhì)粒pK18mobsacB/ΔptsG，經(jīng)酶切驗證，得到5 600 bp載體片段和2 900 bp目的片段兩條條帶，結(jié)果如圖3B所示，說明重組質(zhì)粒pK18mobsacB/ΔptsG構(gòu)建成功。

2.1.2 工程菌株CGΔptsG的篩選及驗證

圖4 同源交換原理示意圖Fig. 4 Schmatic illustration of the principle of homologous exchange

將重組質(zhì)粒pK18mobsacB/ΔptsG電轉(zhuǎn)化至C. glutamicum ATCC 13032感受態(tài)細胞中，利用兩次同源重組方法和sacB基因反向篩選技術(shù)來實現(xiàn)基因的無痕敲除，基因重組過程如圖4所示。

圖5 ptsGptsG缺失基因PCR驗證PCRFig. 5 Identification of deletion of ptsG by PCR

按照C. glutamicum ATCC 13032基因組序列中待敲除基因ptsG的基因序列設(shè)計敲除驗證引物QPTSGYZF/ QPTSGYZR，分別以CGΔptsG菌株與C. glutamicum ATCC 13032菌株的基因組DNA為模板，進行PCR驗證，結(jié)果如圖5所示，C. glutamicum ATCC 13032菌株基因組能擴增出大小為2 502 bp的ptsG基因片段，與理論值大小一致，而CGΔptsG菌株基因組沒有擴增出相應大小的片段，并且空白陰性對照（超純水為模版）無條帶，說明CGΔptsG工程菌基因組中的ptsG基因已被敲除。

2.1.3 工程菌株CGΔptsG的生長狀況研究

CGΔptsG和C. glutamicum ATCC 13032在以葡萄糖為唯一碳源的條件下CD培養(yǎng)基中搖瓶發(fā)酵48 h，測定生長曲線和葡萄糖濃度，結(jié)果如圖6所示，敲除ptsG基因的突變株與野生型相比在延滯期生長速率開始降低，生長速率緩慢，而葡萄糖濃度升高，表明敲除ptsG基因使菌株對葡萄糖利用率降低，但仍能利用葡萄糖繼續(xù)生長。工程菌株CGΔptsG的生長速率、菌液OD600nm和葡萄糖利用率分別是野生菌株的74.4%、77.7%和50%。

圖6 C. glutamicum ATCC 13032 和C GppttssGG在以葡萄糖為碳源培養(yǎng)基上的生長曲線（A）及葡萄糖利用情況（BB）Fig. 6 Growth curves and glucose consumption of C. glutamicum ATCC 13032 and CGΔptsG on glucose as the sole carbon source

2.2 ptsH、ptsI基因簇缺失菌株構(gòu)建及葡萄糖利用特性

2.2.1 ptsH-ptsI基因簇敲除打靶質(zhì)粒構(gòu)建

圖7 PCR產(chǎn)物（A）和打靶質(zhì)粒pK18mobsacB/ΔppttssHH-ppttssII酶切驗證（BB）Fig. 7 PCR products (A) and identification of targeting plasmid pK18mobsacB/ΔptsH-ptsI by enzymatic digestion (B)

葡萄糖pts還與特異性蛋白E1（由ptsH編碼）和搬運蛋白HPr（由ptsI編碼）相關(guān)，在C. glutamicum ATCC 13032基因組中，p t s H和p t s I基因是一個基因簇。以C. glutamicum ATCC 13032基因組DNA為模板，分別擴增出ptsH-ptsI基因簇的上下游同源臂，利用重疊PCR融合獲得目的片段，大小為2 700 bp，結(jié)果如圖7A所示。將目的片段與空質(zhì)粒pK18mobsacB連接，獲得重組質(zhì)粒pK18mobsacB/ΔptsH-ptsI，經(jīng)酶切驗證，得到5 600 bp載體片段和2 700 bp目的片段兩條條帶，結(jié)果如圖7B所示，說明重組質(zhì)粒pK18mobsacB/ΔptsH-ptsI構(gòu)建成功。

2.2.2 工程菌株CGΔptsH-ptsI的篩選及驗證

將重組質(zhì)粒pK18mobsacB/ΔptsH-ptsI電轉(zhuǎn)化至CGΔptsG感受態(tài)細胞中，利用兩次同源重組方法和sacB基因反向篩選技術(shù)來實現(xiàn)基因的無痕敲除，基因重組過程與圖4相似。

按照C. glutamicum ATCC 13032基因組序列中待敲除基因ptsH-ptsI的基因序列設(shè)計敲除驗證引物QPTSHIYZF/ QPTSHIYZR，分別以CGΔptsH-ptsI菌株與CGΔptsG菌株的基因組DNA為模板，進行PCR驗證，結(jié)果如圖8所示，CGΔptsG菌株基因組能擴增出大小為1 700 bp的ptsH-ptsI基因片段，與理論值大小一致，而CGΔptsH-ptsI菌株基因組沒有擴增出相應大小的片段，并且空白陰性對照（超純水為模版）無條帶，說明CGΔptsH-ptsI工程菌基因組中的ptsH-ptsI基因已被敲除。

圖8 ptsHptsH-ptsIptsI缺失基因PCR驗證PCRFig. 8 Identification of deletion of ptsH-ptsI by PCR

2.2.3 工程菌株CGΔptsH-ptsI的生長狀況研究

圖9 C. glutamicum ATCC 13032和CGptsH--ppttssII在以葡萄糖為碳源培養(yǎng)基上的生長曲線（A）及葡萄糖利用情況（BB）Fig. 9 Growth curves and glucose consumption of C. glutamicum ATCC 13032 and CGΔptsH-ptsI on glucose as the sole carbon source

CGΔptsH-ptsI和C. glutamicum ATCC 13032在以葡萄糖為唯一碳源的條件下CD培養(yǎng)基中搖瓶發(fā)酵48 h，測定菌株生長曲線和殘留的葡萄糖，結(jié)果如圖9所示，敲除ptsH-ptsI基因的突變株與野生型相比在延滯期生長速率開始降低，生長速率緩慢，而葡萄糖殘量升高，表明敲除ptsH-ptsI基因使菌株對葡萄糖利用率降低。CGΔptsH-ptsI的生長速率、菌液OD600nm和葡萄糖利用率分別是野生型菌株的59.7%、66.8%和39.5%。

2.3 abc基因缺失菌株構(gòu)建及葡萄糖利用特性

2.3.1 abc基因敲除打靶質(zhì)粒構(gòu)建

圖10 PCR產(chǎn)物（A）和打靶質(zhì)粒pK18mobsacB/Δaabbcc酶切驗證（BB）Fig. 10 The PCR products (A) and identification of targeting plasmid pK18mobsacB/Δabc by digestion (B)

2.3.2 工程菌株CGΔabc的篩選及驗證

圖11 abcabc缺失基因PCR驗證PCRFig. 11 Identification of deletion of abc by PCR

將重組質(zhì)粒pK18mobsacB/Δabc電轉(zhuǎn)化至CGΔptsH-ptsI感受態(tài)細胞中，利用兩次同源重組方法和sacB基因反向篩選技術(shù)來實現(xiàn)基因的無痕敲除，基因重組過程與圖4相似。

按照C. glutamicum ATCC 13032基因組序列中待敲除基因abc的基因序列設(shè)計敲除驗證引物QABCYZF/ QABCYZR，分別以CGΔabc菌株與CGΔptsH-ptsI菌株的基因組DNA為模板，進行PCR驗證，結(jié)果如圖11所示，CGΔptsH-ptsI菌株基因組能擴增出大小為1 000 bp的abc基因片段，與理論值大小一致，而CGΔabc菌株基因組沒有擴增出相應大小的片段，并且空白陰性對照（超純水為模版）無條帶，說明CGΔabc工程菌基因組中的abc基因已被敲除。

2.3.3 工程菌株CGΔabc的生長狀況研究

CGΔabc和C. glutamicum ATCC 13032在以葡萄糖為唯一碳源的條件下CD培養(yǎng)基中搖瓶發(fā)酵48 h，測定菌株生長曲線和殘留的葡萄糖，結(jié)果如圖12所示，CGΔabc的生長速率、菌液OD600nm和葡萄糖利用率分別是野生型菌株的53.6%、60%和36%，說明敲除abc基因后，工程菌株對葡萄糖的利用率進一步降低。

圖12 C. glutamiiccuumm ATCC 13032和CCGGΔaabbcc在以葡萄糖為碳源培養(yǎng)基上的生長曲線（A）及葡萄糖利用情況（BB）Fig. 12 Growth curves and glucose consumption of C. glutamicum ATCC 13032 and CGΔabc on glucose as the sole carbon source

2.4 abc2基因缺失菌株構(gòu)建及葡萄糖利用特性

2.4.1 abc2基因敲除打靶質(zhì)粒構(gòu)建

圖13 PCR產(chǎn)物（A）和打靶質(zhì)粒pK18mobsacB/Δabc2abc2酶切驗證（B）Fig. 13 PCR products (A) and identification of targeting plasmid pK18mobsacB/Δabc2 by enzymatic digestion (B)

abc2基因是C. glutamicum ATCC 13032另一個abc型糖轉(zhuǎn)運系統(tǒng)的相關(guān)基因。以C. glutamicum ATCC 13032基因組DNA為模板，分別擴增出abc基因的上下游同源臂基因片段，利用重疊PCR融合獲得目的片段，大小為2 600 bp，結(jié)果如圖13A所示。將目的片段與空質(zhì)粒pK18mobsacB連接，獲得重組質(zhì)粒pK18mobsacB/Δabc2，經(jīng)酶切驗證，得到5 600 bp載體片段和2 600 bp目的片段兩條條帶，結(jié)果如圖13B所示，說明重組質(zhì)粒pK18mobsacB/Δabc2構(gòu)建成功。

2.4.2 工程菌株CGΔabc2的篩選及驗證

圖14 ptsabc2sabc2缺失基因PCR驗證PCRFig. 14 Identification of deletion of ptsabc2 by PCR

將重組質(zhì)粒pK18mobsacB/Δabc2電轉(zhuǎn)化至CGΔabc感受態(tài)細胞中，利用兩次同源重組方法和sacB基因反向篩選技術(shù)來實現(xiàn)基因的無痕敲除，基因重組過程與圖4相似。

按照C. glutamicum ATCC 13032基因組序列中待敲除基因abc2的基因序列設(shè)計敲除驗證引物QABC2YZF/ QABC2YZR，分別以CGΔabc2菌株與CGΔabc菌株的基因組DNA為模板，進行PCR驗證，結(jié)果如圖14所示，CGΔabc菌株基因組能擴增出大小為1 130 bp的abc2基因片段，與理論值大小一致，而CGΔabc2菌株基因組沒有擴增出相應大小的片段，并且空白陰性對照（超純水為模版）無條帶，說明CGΔabc2工程菌基因組中的abc2基因已被敲除。

2.4.3 工程菌株CGΔabc2的生長狀況研究

CGΔabc2和C. glutamicum ATCC 13032在以葡萄糖為唯一碳源的條件下CD培養(yǎng)基中搖瓶發(fā)酵48 h，測定菌株生長曲線和殘留的葡萄糖，結(jié)果如圖15所示，CGΔabc2的生長速率、菌液OD600nm和葡萄糖利用率分別是野生型菌株的10.3%、30.1%和26.2%，說明abc2基因?qū)τ谡{(diào)控葡萄糖轉(zhuǎn)運有重要作用，敲除abc2基因后，工程菌株對葡萄糖的利用率大大降低。

圖15 C. glutamicum ATCC 13032和CGaabbcc22在以葡萄糖為碳源培養(yǎng)基上的生長曲線（A）及葡萄糖利用情況（BB）Fig. 15 Growth curves and glucose consumption of C. glutamicum ATCC 13032 and CGΔabc2 on glucose as the sole carbon source

2.5 iolt1基因缺失菌株構(gòu)建及葡萄糖利用特性

2.5.1 iolt1基因敲除打靶質(zhì)粒構(gòu)建

圖16 PCR產(chǎn)物（A）和打靶質(zhì)粒pK18mobsacB/Δiioolltt11酶切驗證（BB）Fig. 16 PCR products (A) and identification of targeting plasmid pK18mobsacB/Δiolt1 by enzymatic digestion (B)

在基因組中iolt1基因是編碼肌醇轉(zhuǎn)運的基因，但在Krings等[16]報道中，其可以轉(zhuǎn)運葡萄糖。以C. glutamicum ATCC 13032基因組DNA為模板，分別擴增出abc基因的上下游同源臂基因片段，利用重疊PCR融合獲得目的片段，大小為1 800 bp，結(jié)果如圖16A所示。將目的片段與空質(zhì)粒pK18mobsacB連接，獲得重組質(zhì)粒pK18mobsacB/ Δiolt1，經(jīng)酶切驗證，得到5 600 bp載體片段和1 800 bp目的片段兩條條帶，結(jié)果如圖16B所示，說明重組質(zhì)粒pK18mobsacB/Δiolt1構(gòu)建成功。

2.5.2 工程菌株CGΔiolt1的篩選及驗證

圖17 ptsGptsG缺失基因PCR驗證PCRFig. 17 Identification of deletion of ptsGptsG by PCR

將重組質(zhì)粒pK18mobsacB/Δiolt1電轉(zhuǎn)化至CGΔabc2感受態(tài)細胞中，利用兩次同源重組方法和sacB基因反向篩選技術(shù)來實現(xiàn)基因的無痕敲除，基因重組過程與圖4相似。

按照C. glutamicum ATCC 13032基因組序列中待敲除基因iolt1的基因序列設(shè)計敲除驗證引物QIOLT1YZF/ QIOLT1YZR，分別以CGΔiolt1菌株與CGΔabc2菌株的基因組DNA為模板，進行PCR驗證，結(jié)果如圖17所示，CGΔabc2菌株基因組能擴增出大小為1 480 bp的iolt1基因片段，與理論值大小一致，而CGΔiolt1菌株基因組沒有擴增出相應大小的片段，并且空白陰性對照（超純水為模版）無條帶，說明CGΔiolt1工程菌基因組中的iolt1基因已被敲除。

2.5.3 工程菌株CGΔiolt1在以葡萄糖為碳源培養(yǎng)基上的生長情況

圖18 C. glutamicum ATCC 13032和CGiioolltt11在以葡萄糖為碳源培養(yǎng)基上的生長曲線（A）及葡萄糖利用情況（BB）Fig. 18 Growth curves and glucose consumption of C. glutamicum ATCC 13032 and CGΔiolt1 on glucose as the sole carbon source

CGΔiolt1和C. glutamicum ATCC 13032在以葡萄糖為唯一碳源的條件下CD培養(yǎng)基中搖瓶發(fā)酵48 h，測定菌株生長曲線和殘留的葡萄糖，結(jié)果如圖18所示，CGΔiolt1幾乎無法利用葡萄糖生長，生長速率和殘留葡萄糖量接近于0。

2.6 工程菌株CGΔptsG、CGΔptsH-ptsI、CGΔabc、CGΔabc2、CGΔiolt1與野生型菌株在以葡萄糖為碳源培養(yǎng)基的生長情況

圖19 固體培養(yǎng)基上生長情況Fig. 19 Growth of C. glutamicum ATCC 13032 and engineered strains on glucose-containing solid minimal medium

將工程菌株CGΔptsG、CGΔptsH-ptsI、CGΔabc、CGΔabc2、CGΔiolt1與野生型菌株依次接種于在僅以葡萄糖為碳源的固體CD培養(yǎng)基上，生長情況如圖19所示，原始菌株生長良好，隨著葡萄糖轉(zhuǎn)運系統(tǒng)的相關(guān)基因ptsG、ptsH-ptsI、abc、abc2的依次敲除，菌株生長越來越弱，直至基因iolt1敲除后，工程菌株不生長。

圖20 8 h和24 h菌液ODD60000nnmmFig. 20 OD600nmof fermentation broths at 8 and 24 h

工程菌株與野生型菌株同時接種于液體CD培養(yǎng)基中進行發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中，分別在8、24 h取樣測OD600nm，結(jié)果如圖20所示，基因ptsG和ptsH、ptsI基因簇敲除后OD600nm降低，生長速率下降，但并沒有完全阻斷葡萄糖代謝，說明在C. glutamicum ATCC 13032中除葡萄糖轉(zhuǎn)運除了pts，還存在其他方式的轉(zhuǎn)運系統(tǒng)。基因abc和abc2敲除后OD600nm降低幅度大，生長速率下降幅度大；基因iolt1敲除后，菌株不生長，在敲除pts的基礎(chǔ)上，abc、abc2和iolt1 3個基因的敲除，完全阻斷了葡萄糖代謝，說明C. glutamicum ATCC 13032中，abc、abc2和iolt1 3個基因是負責葡萄糖分子轉(zhuǎn)運的關(guān)鍵基因。

3 討 論

據(jù)報道，C. glutamicum ATCC 13032中含有4 組pts，包括葡萄糖pts、果糖pts、蔗糖pts和一個未知pts[17-20]。葡萄糖pts由特異性蛋白E1（由ptsH編碼）、搬運蛋白HPr（由ptsI編碼）和酶Ⅱ（EⅡs）組成[21]。與C. glutamicum ATCC 13032不同，另一株野生型菌株C. glutamicum R含有兩組β-葡糖苷pts，他們負責β-葡糖苷的攝取，例如水楊苷、熊果苷和葡萄糖[22]。本研究獲得的ptsG和ptsI-ptsH基因缺失突變株，在以葡萄糖為唯一碳源培養(yǎng)基上的生長和葡萄糖的消耗都受到影響，說明在C. glutamicum ATCC 13032中，葡萄糖轉(zhuǎn)運的pts除了ptsG編碼的蛋白EⅡGlc，還包括特異性蛋白E1（由ptsH編碼）和搬運蛋白HPr（由ptsI編碼），與現(xiàn)有的文獻報道一致[21]。但是突變株仍保留了運輸葡萄糖糖的能力，說明葡萄糖的轉(zhuǎn)運除了pts外還存在其他轉(zhuǎn)運系統(tǒng)。

據(jù)報道C. glutamicum能夠有效的使用葡萄糖酸和核糖作為唯一碳源，但他們的攝取是由非pts介導。葡萄糖酸由gntP編碼的特定葡萄糖酸透酶GntP調(diào)控吸收，再經(jīng)gntK編碼的葡萄糖酸激酶GntK磷酸化成6-磷酸葡萄糖酸進入戊糖磷酸途徑?；騡ntP或gntK的缺失都會影響在葡萄糖上的生長[22]。還有報道，核糖先通過rbsACBD基因編碼的特定轉(zhuǎn)運系統(tǒng)RbsACBD轉(zhuǎn)運到細胞內(nèi)，再通過rbsK1和rbsK2基因編碼的核糖激酶RbsK1和RbsK2磷酸化形成5-磷酸核糖進入戊糖磷酸途徑，rbsK1和rbsK2雙基因缺失會影響在核糖上的生長的[24-25]，但沒有文獻具體報道負責葡萄糖原型轉(zhuǎn)運的基因。本研究根據(jù)C. glutamicum ATCC 13032的KEGG數(shù)據(jù)庫，找到了類似葡萄糖酸透酶和abc型糖轉(zhuǎn)運系統(tǒng)的相關(guān)基因abc1和abc2基因（圖1）。為了確認這兩個基因?qū)ζ咸烟欠肿拥霓D(zhuǎn)運作用，實驗組利用兩次重組技術(shù)，逐次刪除了abc1和abc2基因，得到工程菌株CGΔabc1和CGΔabc2。葡萄糖的消耗速率和菌體的生長速率都大幅度下降，首次發(fā)現(xiàn)abc1和abc2基因編碼的糖類蛋白對葡萄糖的轉(zhuǎn)運起到重要作用。

Ikeda等[1]發(fā)現(xiàn)C. glutamicum中編碼肌醇轉(zhuǎn)運的兩個基因iolt1和iolt2可能介導葡萄糖的攝取，負責編碼葡萄糖通透酶。鑒于本研究得到的4 個葡萄糖轉(zhuǎn)運相關(guān)基因缺失的突變株仍具有葡萄糖代謝功能，本研究參考Ikeda等[1]的研究，在CGΔabc2突變株基礎(chǔ)上，敲除了iolt1基因，得到的工程菌株CGΔiolt1在葡萄糖為唯一碳源的培養(yǎng)基中不再生長，表明C. glutamicum ATCC 13032的葡萄糖代謝途徑已經(jīng)被完全阻斷，說明在基因組中標注為編碼肌醇轉(zhuǎn)運的蛋白質(zhì)，同樣負責葡萄糖的轉(zhuǎn)運，與其報道一致，但iolt2對葡糖糖轉(zhuǎn)運的作用還有待進一步的研究。

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Construction of Engineered Strain Blocking Glucose Metabolism in Corynebacterium glutamicum

HAN Wuyang1, LIU Jinlei1, DU Hongyan1, WANG Beichen2, YI Hong1, LI Tianming1,*
(1. College of Biological Science and Engineering, Hebei University of Science and Technology, Shijiazhuang 050018, China; 2. College of Agriculture and Life Science, University of Wisconsin, Madison 53706, USA)

In this study, we used the wild-type Corynebacterium glutamicum strain ATCC 13032 as a starting strain to obtain f ve mutants with knockout of the ptsG and ptsH-ptsI genes as well as the abc, abc2 and iolt1 genes by homologous recombination without resistance marker using reverse metabolic engineering strategies. Our experimental results showed that compared to the wild-type strain, the glucose consumption of the mutant CGΔptsG was 50% using glucose as the sole carbon source, giving an OD value of 1.473, the glucose consumption of the mutant CGΔptsH-ptsI was 39.5%, giving an OD value of 1.226, the glucose consumption of the mutant CGΔabc was 36%, giving an OD value of 1.09, and the glucose consumption of CGΔabc2 was 26.2%, giving an OD value of 0.486, while the mutant CGΔiolt1 could not utilize glucose to grow, suggesting that glucose metabolism of C. glutamicum was blocked. It turned out that the glucose transporter function was controlled by the ptsG, ptsH-ptsI, abc, abc2 and iolt1 genes, encoding transporter proteins.

Corynebacterium glutamicum; glucose; gene knockout

10.7506/spkx1002-6630-201702011

Q789

A

1002-6630（2017）02-0065-10

韓武洋, 劉金雷, 杜紅燕, 等. 谷氨酸棒狀桿菌葡萄糖代謝阻斷工程菌的構(gòu)建[J]. 食品科學, 2017, 38(2): 65-74. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201702011. http://www.spkx.net.cn

HAN Wuyang, LIU Jinlei, DU Hongyan, et al. Construction of engineered strain blocking glucose metabolism in Corynebacterium glutamicum[J]. Food Science, 2017, 38(2): 65-74. (in Chinese with English abstract)

10.7506/ spkx1002-6630-201702011. http://www.spkx.net.cn

2016-03-28

國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃（863計劃）項目（2014AA022102）

韓武洋（1991—），男，碩士研究生，研究方向為合成生物學與代謝工程。E-mail：924084885@qq.com

*通信作者：李天明（1986—），男，助理研究員，碩士，研究方向為合成生物學與代謝工程。E-mail：iamltm2000@hotmail.com