四種白血病細(xì)胞血涂片染色方法的比較

李 濤,李文哲,王霖濤,薛瑞冰,孫欒彪,張雨薇,姬新穎

1．河南省核蛋白基因調(diào)控國際聯(lián)合實驗室，河南 開封475004； 2．河南大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河南 開封475004

白血病(Leukemia)，亦稱作血癌，是一種造血系統(tǒng)的惡性腫瘤，也是我國最常見的惡性腫瘤之一。白血病患者過分生產(chǎn)不成熟的白細(xì)胞，妨害骨髓的正常工作，使得骨髓生產(chǎn)其他血細(xì)胞的功能降低，其結(jié)果嚴(yán)重威脅患者的生命安全[1-4]。結(jié)合臨床癥狀在患者的外周血中檢出白血病細(xì)胞是確診白血病的診斷依據(jù)。制作結(jié)構(gòu)清晰的白血病血涂片標(biāo)本對臨床診斷和組織學(xué)教學(xué)具有重要意義[5-7]。由于白血病患者血液中含有過多的未成熟白細(xì)胞(即白血病細(xì)胞)，實際操作中染色效果多不理想, 影響觀察分類與診斷，為尋找較好的血涂片染色方法，我們將四種染色方法用于白血病標(biāo)本制作，并對染色效果進行比較觀察，旨在得到更好的血涂片染色效果。

1 材料與方法

1.1 主要儀器

恒溫保溫箱，電子秤，秒表，顯微鏡，載玻片，蓋玻片，濾紙，移液器，漏斗，玻璃棒，乳缽乳棒，燒杯，儲存瓶，膠頭滴管，中性樹膠，棉簽。

1.2 主要試劑的配制

1.2.1 Wright氏染液 參考《血液細(xì)胞學(xué)》(第2版)8配制。稱取干燥的Wright氏染料0.1 g，甲醇(AR)60 mL。將Wright氏染料放置乳缽內(nèi)，用乳棒輕輕研磨成粉末；加少許甘油或甲醇溶解研磨，使染料在乳缽內(nèi)徹底成光滑細(xì)致的粉末而無染料粉粒沉著，再加較多量甲醇研磨呈一面鏡光亮；靜置片刻，將上層液體倒入一清潔棕色瓶內(nèi)貯存；乳缽內(nèi)再加甲醇研磨，重復(fù)數(shù)次，直至乳缽內(nèi)染料及甲醇用完為止。搖勻，過濾，濾液密封瓶口，存室溫暗處，儲存愈久，則染料溶解、分解就越好。

1.2.2 Giemsa氏染液[8]配制方法：取Giemsa氏色素染料1 g加入66 mL甘油，混勻，60 ℃保溫溶解2 h，再加入66 mL甲醇混勻，放置24 h,過濾，貯存在棕色瓶內(nèi)，即配成Giemsa氏染液原液。此原液用前用PBS(pH 6.8)稀釋10倍左右就可以使用此為Giemsa氏染液工作液。工作液可室溫保存1 mon左右。

1.2.3 磷酸鹽緩沖液(PBS 6.8) 取0.2 mol/L磷酸二氫鉀溶液250 mL，加0.2 mol/L氫氧化鈉溶液118 mL，用蒸餾水稀釋至1 000 mL，即得。

1.3 標(biāo)本采集、涂片

白血病血標(biāo)本取樣于河南大學(xué)第一附屬醫(yī)院血液病科，診斷為慢性粒細(xì)胞白血病患者。使用移液器吸取混勻血樣，滴取2 μL血液于潔凈載玻片上，用推片在血樣前方接觸血滴，使血滴均勻呈一直線，推片與載玻片呈45°角，用力均勻?qū)⒀瓮崎_，自然晾干。大量制作教學(xué)標(biāo)本可一次推出所需血涂片，晾干待用。

1.4 染色

1.4.1 Wright氏染色法 Wright氏染色法參考《實用組織學(xué)技術(shù)》(第2版)9。將3片血涂片平放在染色架上，分別加Wright氏染液2～3滴，使之覆蓋整個血涂片，染色0.5～1.0 min；滴加等量或稍多的新鮮蒸餾水，與Wright氏染液混勻分別染色10、15、20 min,然后用自來水緩慢從血涂片一端沖洗去染液(注意：勿先倒去染液或直接對血涂片沖洗),待自然干燥后，中性樹膠封片，即可放置血涂片于顯微鏡高倍鏡下進行觀察。

1.4.2 Giemsa氏染色法 Giemsa氏染色法參考文獻[8]。Giemsa氏原液用前用PBS(pH 6.8)稀釋10倍左右為Giemsa氏工作染液，此工作染液需要新鮮配制。將3片標(biāo)本血涂片用無水甲醇固定3 min，滴加Giemsa氏工作液，將血涂片分別染色10、15、20 min。用自來水緩慢從血涂片一端沖洗去染液(注意：勿先傾倒去染液或直接對血涂片沖洗),置于空氣中干燥，用中性樹膠加蓋玻片封片，于顯微鏡高倍鏡下進行觀察。

1.4.3 Wright氏-Giemsa氏混合染色法 Wright氏-Giemsa氏混合染色法參考文獻[9]。將Wright氏染液∶Giemsa氏工作染液∶磷酸鹽緩沖液(PBS 6.8)按照5∶1∶6體積混合均勻。將3片血涂片平放在染色架上，甲醇固定2～5 min,甩干；加混合染液數(shù)滴，使之覆蓋整個血涂片，分別染色10、15、20 min，取出涂片，然后用自來水緩慢從血涂片一端沖洗去染液(注意：勿先傾倒去染液或直接對血涂片沖洗)。置于空氣中自然干燥，用中性樹膠及蓋玻片封片，放置于顯微鏡高倍鏡下進行觀察。

1.4.4 Wright氏-Giemsa氏分步聯(lián)合染色法 將3張血涂片平放在染色架上，首先加Wright氏染液2～3滴，使覆蓋整個血涂片，固定0.5～1.0 min，滴加等量或稍多的新鮮蒸餾水，與染液混勻分別染色10、15、20 min，用自來水緩慢從血涂片一端沖洗去染液。然后滴加Giemsa氏工作染液，將血涂片分別染色10、15、20 min。取出血涂片，再一次用自來水緩慢從血涂片一端沖洗去染液(注意：勿先倒去染液或直接對血涂片沖洗)，置于空氣中自然干燥,用中性樹膠加蓋玻片封片，置于顯微鏡高倍鏡下進行觀察。

2 結(jié)果

2.1 Wright氏染色

用Wright氏染色法分別染色10、 15、20 min，紅細(xì)胞呈橘黃色，白血病細(xì)胞核呈紫紅色，細(xì)胞質(zhì)顆粒呈淡藍(lán)色。染色時間無論長短細(xì)胞核均易著色，見圖1。

2.2 Giemsa氏染色

用pH 6.8的磷酸鹽緩沖液(PBS)配制的工作液，分別染色10、15、20 min，紅細(xì)胞呈藍(lán)灰色，白血病細(xì)胞核呈紫藍(lán)色，中性顆粒淺紫色；而pH<6.8和染色時間較短者，則核難著色，pH>6.8則核呈藍(lán)色，見圖2。

2.3 Wright氏-Giemsa氏混合染色

分別染色10、 15、20 min。紅細(xì)胞呈灰黃色或灰色，白血病細(xì)胞核呈紫紅色，細(xì)胞質(zhì)顆粒呈灰藍(lán)色或淡紫色，染色時間無論長短則細(xì)胞核易著色，細(xì)胞核結(jié)構(gòu)清晰，色澤艷麗，見圖3。

2.4 Wright氏-Giemsa氏分步聯(lián)合染色

分別染色10、 15、20 min。紅細(xì)胞紫粉色，白血病細(xì)胞核呈紫紅色，細(xì)胞質(zhì)顆粒呈淡藍(lán)色；細(xì)胞核結(jié)構(gòu)清晰，色澤明亮透徹干凈，富有立體感。染色時間短(10 min)則細(xì)胞核難著色，見圖4。

3 討論

血涂片是血液細(xì)胞學(xué)檢查的基本方法，應(yīng)用極廣，特別是對各種血液病的診斷有很大價值。但血片制備和染色不良，常使細(xì)胞鑒別發(fā)生困難，甚至導(dǎo)致錯誤結(jié)論。例如，血膜過厚細(xì)胞重疊縮小，血膜太薄白細(xì)胞多集中于邊緣，因此，染色良好的血片是血液學(xué)檢查的基本技術(shù)之一[10-12]。

本研究所采用的四種染色法，各有優(yōu)缺點：Wright氏染色法的優(yōu)點是染色時間短，結(jié)果出現(xiàn)快，較適于臨床檢驗，但其染色過程不易掌握、易污染是其缺點；Giemsa氏染色法的染色液不易污染是其最大的優(yōu)點，但是，染色效果對染液pH值要求高，較易偏堿，不易控制，經(jīng)過反復(fù)多次試驗，以pH 6.8染色效果最好(圖2)。Wright氏-Giemsa氏混合染色法雖能對前兩種染色法起互補作用，但對紅細(xì)胞著色不均勻，且染液變性快、易污染，也不適于教學(xué)標(biāo)本染色(圖3)。Wright氏-Giemsa氏分步聯(lián)合染色法的優(yōu)點是紅細(xì)胞呈紫粉色，白血病細(xì)胞核呈紫紅色，細(xì)胞質(zhì)顆粒細(xì)膩呈淡藍(lán)色，細(xì)胞核結(jié)構(gòu)清晰，色澤明亮透徹干凈，富有立體感，著色保持時間久；而缺點是染液變性快、易污染，適合新鮮配制，即適用于大批量制作組織病理學(xué)和組織胚胎學(xué)教學(xué)用片(圖4)。

綜上所述，我們的體會是：血液標(biāo)本一定要新鮮；四種血涂片滴加染液后，不要直接傾倒去染液，否則易使染液沉淀在血涂片上，影響結(jié)果觀察；直接用自來水沖洗比用蒸餾水或緩沖液沖洗更方便、徹底和節(jié)約。

圖1 不同時間Wright氏染色結(jié)果比較

圖2 不同時間Giemsa氏染色結(jié)果比較

圖3 不同時間Wright氏-Giemsa氏混合染色結(jié)果比較

圖4 不同的Wright氏-Giemsa氏分步聯(lián)合染色結(jié)果比較

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