一氧化氮供體JS-K對(duì)H22荷瘤小鼠抑瘤作用的研究

劉 玲，王 靜，劉沐辰，慎會(huì)娜，花昌林

一氧化氮(nitric oxide,NO)是一種普遍存在的水溶性自由基氣體，在各種生理及病理過(guò)程中發(fā)揮著十分重要的作用[1-3]。研究表明，高濃度NO可通過(guò)抑制血管生成和轉(zhuǎn)移、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等機(jī)制抑制腫瘤細(xì)胞增殖[4-6]。NO供體是指在體內(nèi)經(jīng)酶或非酶作用釋放NO的化合物，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)多種結(jié)構(gòu)類(lèi)型的NO供體，如機(jī)硝酸酯類(lèi)、亞硝基硫醇、呋咱氮氧化合物和偶氮鎓二醇鹽等，其中偶氮鎓二醇鹽類(lèi)在靶向性釋放NO方面優(yōu)勢(shì)明顯[7-9]。O2-(2,4-二硝基苯基)1-[(4-乙氧羰基)哌嗪-1-yl]偶氮-1-鎓-1,2-二醇(JS-K)是一種新型偶氮鎓二醇鹽類(lèi)衍生物，是在偶氮二醇鹽O2端以硝基芳香取代基進(jìn)行取代[10-11]。本組前期研究顯示：JS-K對(duì)體外多種肝癌細(xì)胞(HepG2、SMMC-7721、Bel-7402)的增殖均有較強(qiáng)的抑制作用，可通過(guò)增加Ca2+水平，升高Bax/Bcl-2比值，激活caspase通路等機(jī)制誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[12]。本研究將以H22腹水瘤細(xì)胞和H22荷瘤小鼠為研究對(duì)象，分別從體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步觀察JS-K對(duì)H22腹水瘤細(xì)胞和腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用，為該化合物的應(yīng)用提供理論依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物、試劑和主要儀器健康雄性Balb/c小鼠40只，體質(zhì)量(20±2) g，由河南科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(鄂)2010-0007，將小鼠飼養(yǎng)在室溫18～25 ℃，光照12 h，相對(duì)濕度45%～55%，通風(fēng)良好的環(huán)境中，喂普通飼料自由飲水。JS-K(純度≥97%，分子量384)，美國(guó)Santa Cruz公司。氟尿嘧啶注射液(10 mL：0.25 g，批號(hào)100605，上海旭東海普藥業(yè)有限公司)。丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine transaminase，ALT)、天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate transaminase，AST)測(cè)試盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。Bcl-2、Bax和cleaved-caspase-3兔多克隆抗體、辣根過(guò)氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)標(biāo)記羊抗兔 IgG為武漢三鷹生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；其他化學(xué)試劑均為分析純。ZS-板式酶標(biāo)儀(美國(guó)Molecular Device公司)。

1.2動(dòng)物及分組體外傳代培養(yǎng)的H22細(xì)胞用無(wú)菌生理鹽水配成1×107·mL-1的濃度。取0.2 mL接種于小鼠的腹腔，在小鼠腹腔內(nèi)常規(guī)傳代3次代以后，選擇腹水飽滿(mǎn)的小鼠抽取腹水，按照1∶3的比例用生理鹽水稀釋制成瘤細(xì)胞混懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107·mL-1。每只0.2 mL接種在小鼠的右側(cè)腋窩皮下。接種次日，稱(chēng)重，將小鼠隨機(jī)分成5組，每組8只，分為空白對(duì)照組、模型組、5-Fu陽(yáng)性藥對(duì)照組(20 mg·kg-1)、JS-K 低劑量組(0.75 mg·kg-1)和JS-K高劑量組(1.50 mg·kg-1)?？瞻讓?duì)照組和模型組尾靜脈注射生理鹽水，每3 d給藥1次；5-FU組腹腔注射，每天給藥1次；JS-K給藥組尾靜脈注射，每3 d給藥1次，連續(xù)14 d。期間每天記錄各組小鼠的體質(zhì)量、進(jìn)食量和生存狀態(tài)。

1.3腫瘤抑制率計(jì)算腋窩接種后第15天以脫頸椎法處死小鼠，完整取出右側(cè)腋窩皮下的瘤組織，準(zhǔn)確稱(chēng)質(zhì)量(g)，計(jì)算腫瘤抑制率。抑瘤率(%)=(模型組平均瘤質(zhì)量—給藥組平均瘤質(zhì)量)/ 模型組平均瘤質(zhì)量×100%。

1.4血清ALT、AST檢測(cè)第15天處死小鼠前，眼眶取血，離心取上清，按試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行操作，比色法檢測(cè)并計(jì)算血清中ALT和AST的含量。

1.5Western蛋白印跡法檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白水平將瘤組織剪碎，加裂解液裂解提取總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白含量。用12% SDS-PAGE電泳分離總蛋白，將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，5%脫脂奶粉常溫封閉1 h，加入一抗(稀釋倍數(shù)1∶1 000)于封閉袋中4 ℃孵育過(guò)夜；二抗室溫孵育 2 h。ECL化學(xué)發(fā)光法顯影，凝膠成像系統(tǒng)拍照并對(duì)蛋白條帶進(jìn)行半定量分析。以目的蛋白條帶積分吸光度值與內(nèi)參條帶吸光度值的比值表示目的蛋白相對(duì)含量。

2 結(jié)果

2.1JS-K對(duì)H22荷瘤小鼠瘤質(zhì)量的影響體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示，腫瘤接種前各組小鼠活動(dòng)正常，食欲良好。實(shí)驗(yàn)中后期，小鼠日進(jìn)食量、活潑度均有所下降，荷瘤模型組最為明顯，小鼠反應(yīng)遲緩，體型瘦小，毛色有黏連，不光滑，有脫毛現(xiàn)象。荷瘤模型組平均瘤質(zhì)量為(1.62±0.12) g，5-Fu 組移植瘤生長(zhǎng)受抑制，5-FU組瘤質(zhì)量為(0.65±0.11)g，抑瘤率60.02%。JS-K實(shí)驗(yàn)組平均瘤質(zhì)量明顯小于荷瘤模型組，JS-K治療組低劑量組瘤質(zhì)量為(1.23±0.15) g(P<0.05)，抑瘤率23.93%；JS-K高劑量組移植瘤生長(zhǎng)抑制更加明顯，移植瘤生長(zhǎng)較為局限，質(zhì)地稍硬，包膜較為完整。高劑量組瘤質(zhì)量為(0.81±0.16) g(P<0.05)，抑瘤率50.26%。結(jié)果JS-K能顯著抑制H22移植瘤小鼠體內(nèi)腫瘤的生長(zhǎng)，見(jiàn)圖1。

①與模型組比較，P<0.05。圖1 JS-K對(duì)H22荷瘤小鼠移植瘤質(zhì)量的影響

2.2JS-K對(duì)H22荷瘤小鼠ALT和AST的影響JS-K給藥14 d后，與正常對(duì)照組相比，JS-K對(duì)H22荷瘤小鼠血清中ALT和AST水平?jīng)]有顯著影響，提示JS-K對(duì)小鼠肝臟沒(méi)有損傷作用，見(jiàn)表1。

表1 JS-K對(duì)H22荷瘤小鼠ALT和AST的影響

注：ALT：丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶；AST：天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶。

2.3JS-K對(duì)H22荷瘤小鼠凋亡相關(guān)蛋白的影響與模型組比較，JS-K能降低腫瘤組織中抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)，升高促凋亡蛋白Bax表達(dá)，同時(shí)使caspase-3剪切形式(活化)cleaved-casapse-3蛋白表達(dá)增加，提示JS-K可激活促進(jìn)凋亡發(fā)生的相關(guān)通路，見(jiàn)圖2和圖3。

圖2 JS-K對(duì)H22荷瘤小鼠瘤組織中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

A：各組Bcl-2表達(dá)比較；B：各組Bax表達(dá)比較；C：各組cleaved-casapse-3表達(dá)比較。①與模型組比較，P<0.05。圖3 H22荷瘤小鼠瘤組織中凋亡相關(guān)蛋白比較

3 討論

由于NO的半衰期很短，為提高體內(nèi)NO濃度，所以對(duì)其前體藥的研究日益增多，其中NO供體藥偶氮烯翁二醇鹽類(lèi)具有半衰期長(zhǎng)的特點(diǎn)，可明顯提高放療療效和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。為解決NO供體靶向作用這一難題，應(yīng)該針對(duì)體內(nèi)特定酶進(jìn)行研究，以期該酶能識(shí)別或活化的NO供體，或者是開(kāi)發(fā)對(duì)特定組織具有高度親和力的NO供體[13-15]。JS-K作為偶氮翁二醇鹽類(lèi)衍生物顯示了對(duì)多種腫瘤的抗腫瘤效應(yīng)，可在谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(glutathione-S-transfarase,GST)催化下，被谷胱甘肽的親核性巰基攻擊，生成偶氮鎓二醇鹽離子，在生理?xiàng)l件下偶氮鎓二醇鹽離子分解釋放NO[16-18]。研究發(fā)現(xiàn)JS-K可選擇性地在急性髓性白血病HL-60細(xì)胞內(nèi)釋放NO，殺滅癌細(xì)胞，而不傷害正常細(xì)胞，對(duì)免疫缺陷型小鼠體內(nèi)植入的HL-60細(xì)胞及前列腺癌細(xì)胞PC-3，JS-K均能抑制其生長(zhǎng)，且不導(dǎo)致小鼠血壓下降等副作用[19-20]。

藥物在體外敏感性試驗(yàn)是直接作用于細(xì)胞，但往往與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)效果并不一定完全相符。而且，藥物的活性成分在體內(nèi)受多種因素的影響，并且通過(guò)肝、腎器官可使藥物療效增強(qiáng)或減弱，因此體內(nèi)抗腫瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果是評(píng)價(jià)抗腫瘤藥物有效性的重要指標(biāo)。H22荷瘤小鼠肝癌細(xì)胞皮下移植模型是用于研究抗腫瘤藥物及篩選藥物作用機(jī)制的腫瘤模型。本研究分別通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)移植瘤實(shí)驗(yàn)觀察了JS-K的抗腫瘤作用。Ren等[21]發(fā)現(xiàn)JS-K可抑制Hep3B肝癌細(xì)胞的增殖，這與ERK、JNK和p38及其下游效應(yīng)c-Jun和AP-1的激活有關(guān)。NO清除劑可取消JS-K對(duì)MAPK的激活和腫瘤抑制作用。

本研究中，通過(guò)尾靜脈注射給藥的方式觀察了JS-K對(duì)小鼠移植H22腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用。結(jié)果顯示：與模型組相比，JS-K能顯著抑制小鼠 H22實(shí)體瘤的生長(zhǎng)，對(duì)移植瘤的重量都有較明顯的抑制作用。其中荷瘤模型組小鼠平均瘤質(zhì)量為(1.62±0.12) g ，超過(guò)1 g，表示造模成功，腫瘤生長(zhǎng)良好。JS-K低、高給藥組可在不同程度上抑制腫瘤的生長(zhǎng)，而且對(duì)肝臟功能影響較小。

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的自主的有序的死亡。凋亡是多基因嚴(yán)格控制的過(guò)程。這些基因在種屬之間非常保守，如Bcl-2家族、caspase家族、癌基因如C-myc、抑癌基因P53等[22-23]。Bcl-2通過(guò)阻止線粒體細(xì)胞色素C的釋放而發(fā)揮抗凋亡作用。此外， Bcl-2具有保護(hù)細(xì)胞的功能，Bcl-2的過(guò)度表達(dá)可引起細(xì)胞核谷胱苷肽的積聚，導(dǎo)致核內(nèi)氧化還原平衡的改變，從而降低了Caspase的活性。Bax是Bcl-2家族中參與細(xì)胞凋亡的一個(gè)成員，當(dāng)誘導(dǎo)凋亡時(shí)，它從胞液遷移到線粒體和核膜。細(xì)胞內(nèi)的Bax與Bcl-2比值決定線粒體外膜孔道形成，細(xì)胞色素C從線粒體釋放，在dATP存在的條件下能與凋亡相關(guān)因子1結(jié)合，使其形成多聚體，并促使caspase-9與其結(jié)合形成凋亡小體，caspase-9被激活，被激活的caspase-9能激活其他的caspase，如caspase-3等，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[24]。caspase-3即半胱天冬蛋白酶-3是凋亡中的關(guān)鍵執(zhí)行者。JS-K可增加Bax蛋白表達(dá)而降低Bcl-2蛋白表達(dá)，并促使caspase-3的活化形式即剪切的caspase-3表達(dá)增加。

因此，JS-K對(duì)H22荷瘤小鼠的抑瘤作用與其誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡有關(guān)。JS-K具有良好的抗腫瘤作用，可能成為一個(gè)理想的抗腫瘤候選藥。

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