多種測序技術(shù)在藥品檢測環(huán)境微生物鑒定分析中的應(yīng)用

李恩澤，劉月芬，劉玉君，姜山

（青島大學(xué)附屬醫(yī)院，山東 青島 266003）

目前，藥品生產(chǎn)過程中總會存在微生物污染情況，而微生物的污染很容易對藥品臨床使用功效產(chǎn)生不良影響，因為經(jīng)濟(jì)水平發(fā)展和醫(yī)療技術(shù)的限制，藥品生產(chǎn)過程到目前為止都是采用空氣中的浮游菌和沉降菌數(shù)量多少作為評判是否安全合格的標(biāo)準(zhǔn)[1-3]，而這一標(biāo)準(zhǔn)顯然存在較大的缺陷，即該標(biāo)準(zhǔn)無法對微生物污染進(jìn)行源頭查找和污染控制。隨著生物學(xué)融入分子學(xué)的交叉發(fā)展，微生物的鑒定方法得到了大力發(fā)展，而新一代的測序技術(shù)在臨床藥品環(huán)境微生物鑒定工作中的運用推廣，也使得微生物分析工作進(jìn)入到一個新的領(lǐng)域。基于此，我院開展本次研究工作，以期探討多重測序技術(shù)在藥品檢測環(huán)境微生物鑒定分析中的應(yīng)用可行性和可靠性，為今后醫(yī)療界對環(huán)境微生物污染工作的開展提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

數(shù)碼攝影生物顯微鏡、全自動微生物生化儀、全自動革蘭氏染色儀、梯度96孔Verti PCR儀和全自動微生物基因分析鑒定系統(tǒng)[4-5]。

1.2 菌株來源

本次研究在持續(xù)不斷的12個月中對我院微生物實驗室環(huán)境中不同位置、研究員、實驗設(shè)備采用胰蛋白胨大豆瓊脂（TSA）平板，通過3種方式進(jìn)行微生物樣本采集工作，這3種方式分別是：接觸碟法、空氣沉降法及擦拭法。本次研究在12個月中共獲得10株細(xì)菌和11株霉菌，對所有采集到的標(biāo)本均進(jìn)行純化保存，保證標(biāo)本沒有相互污染。

1.3 研究方法

1.3.1 生化鑒定采用VITEK 2 Compact儀器對分離純化獲得的10株細(xì)菌開展常規(guī)生化鑒定工作，如革蘭染色鏡檢、鑒定試劑卡等鑒定方法，各鑒定過程均嚴(yán)格按照程序及儀器操作說明書操作。

1.3.2 一代測序技術(shù)的鑒定參照“1.3.1”項下生化鑒定結(jié)果對各菌株來源DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定。嚴(yán)格按照基因分析鑒定系統(tǒng)配套的試劑和操作程序?qū)赀M(jìn)行DNA提取、擴(kuò)增、純化等操作，并結(jié)合電泳測序結(jié)果比對數(shù)據(jù)庫進(jìn)行各菌株的種、屬鑒定。

1.3.3 宏基因組測序鑒定宏基因組測序依托高通量測序平臺進(jìn)行宏基因的建庫及信息分析，并對鑒定結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)庫比對，以證實鑒定數(shù)據(jù)的真實性。

選擇10株細(xì)菌和11株霉菌，并采用上述3種方法進(jìn)行種屬鑒定，并對3種方法鑒定結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，以判定該鑒定方法的可靠性。

2 結(jié)果

2.1 10種細(xì)菌的種屬鑒定

10株細(xì)菌的一代測序鑒定與生化鑒定比較，屬水平分類一致的有4株，種水平分類一致的有4株。采用宏基因組對各菌株進(jìn)行全基因組測序鑒定，共獲得了10株菌的信息，與一代測序相比，種水平一致的有5株，屬水平一致的有5株，多了5株菌的信息。見表1

2.2 11株霉菌的種屬鑒定

由表2可以看出，霉菌生化鑒定獲得5株菌信息，一代測序獲得了4株菌信息，與生化鑒定結(jié)果比較，缺失了1株菌的信息；宏基因組測序結(jié)果包含8屬和11種，8屬覆蓋了霉菌生化鑒定結(jié)果中的5株菌和一代測序的4株菌的信息，種水平全部覆蓋。

表1 一代測序鑒定與生化鑒定、宏基因組測序結(jié)果比較

表2 霉菌的一代測序鑒定和兩種宏基因組測序鑒定結(jié)果比較

3 討論

針對目前的藥物生產(chǎn)技術(shù)，藥品在進(jìn)行生產(chǎn)的過程中或多或少會出現(xiàn)微生物污染的情況，嚴(yán)重影響藥品的質(zhì)量，如果患者服用污染后的藥品，不僅達(dá)不到治療的效果，還會產(chǎn)生嚴(yán)重的并發(fā)癥，對患者的生命安全形成威脅，因此，針對藥品的質(zhì)量檢測非常的重要[5-6]。受醫(yī)療技術(shù)的限制，藥品生產(chǎn)過程都是采用空氣中的浮游菌和沉降菌數(shù)量多少作為評判是否安全合格的標(biāo)準(zhǔn)[7]，這一標(biāo)準(zhǔn)存在很大的缺陷，隨著生物學(xué)融入分子學(xué)的交叉發(fā)展，微生物的鑒定方法得到了大力發(fā)展，而新一代的測序技術(shù)在臨床藥品環(huán)境微生物鑒定工作中的運用推廣，也使得微生物分析工作進(jìn)入到一個新的領(lǐng)域[8]。

研究發(fā)現(xiàn)，生化鑒定的操作較一代測序和宏基因組測序簡單，但整體流程復(fù)雜，且鑒定結(jié)果簡單，只能鑒定一些具有明顯特異性種屬的菌株，而對非特異性種屬的菌株則無法鑒定。一代測序的明顯優(yōu)勢就是能明確菌株的基因序列，但不能完全實現(xiàn)對菌株種屬特異性基因的區(qū)分和鑒定，甚至對種屬鑒定的特異性低于常規(guī)生化鑒定。正如研究結(jié)果顯示，一代測序在對部分細(xì)菌和霉菌種屬鑒定過程中，菌株種屬的鑒定信息少于生化鑒定信息。宏基因組測序是最新一代的基因測序法，該方法不但能實現(xiàn)對菌株基因序列的鑒定，還能區(qū)分大部分菌株的特異性基因序列，實現(xiàn)對未知菌株的精確區(qū)分。從研究結(jié)果來看，宏基因組測序法能對收集到的全部細(xì)菌進(jìn)行種屬鑒定，對全部霉菌的種進(jìn)行區(qū)分，但對部分霉菌的屬尚無法完成鑒定區(qū)分。究其原因可能有以下幾個方面：首先是菌株污染，菌株收集后的存放過程可能導(dǎo)致微量污染，在提取菌株基因后擴(kuò)增時產(chǎn)生較多非特異性片段，致使無法確定特異性基因序列；其次，特異性基因序列多樣性，菌株各種屬鑒定時需要明確擴(kuò)增片段的基因序列，每次擴(kuò)增只能實現(xiàn)一個片段的富集，對多種特異性片段的種屬則無法實現(xiàn)；第三，菌株基因提取純度不高，即未能富集純化菌株基因，非純化的基因在經(jīng)過多次擴(kuò)增后產(chǎn)生非特異性片段，對結(jié)果的鑒定產(chǎn)生干擾。

綜上所述，宏基因組測序能實現(xiàn)對菌株種屬信息的準(zhǔn)確區(qū)分、鑒定；常規(guī)生化可鑒定特異性種屬的菌株，但對種屬特異性不高的菌株鑒定尚顯不足；一代測序可實現(xiàn)菌株的基因測序，但對種屬的特異性區(qū)分能力低于生化鑒定。

[1] 鄭小玲,王知堅,李玨,等.多種測序技術(shù)在藥品檢測環(huán)境微生物鑒定分析中的應(yīng)用研究[J].藥物分析雜志,2016,36(1):46-52.

[2] 房蕊,蔣波,范一靈,等.ITS序列分析在藥品微生物檢驗中真菌鑒定與控制中的應(yīng)用研究[J].藥物分析雜志,2011,31(2):302-305.

[3] 范一靈,蔣波,房蕊,等.藥品無菌檢查中微生物污染的鑒定和污染溯源分析[J].藥物分析雜志,2011,31(6):1067-1072.

[4] 陳曉光,張娟,徐翩飛,等.新一代高通量測序技術(shù)在衛(wèi)生檢驗檢疫的應(yīng)用[J].中國國境衛(wèi)生檢疫雜志,2011,34(4):284-288.

[5] 朱詩應(yīng),戚中田.16S rDNA擴(kuò)增及測序在細(xì)菌鑒定與分類中的應(yīng)用[J].微生物與感染,2013,8(2):104-109.

[6] 曹榮,張井,孟輝輝,等.高通量測序與傳統(tǒng)純培養(yǎng)方法在牡蠣微生物群落分析中的應(yīng)用對比[J].食品科學(xué),2016,37(24):137-141.

[7] 楊寶霞,李虹,孔凡芳,等.16SrDNA測序技術(shù)對細(xì)菌性眼內(nèi)炎房水和玻璃體標(biāo)本中細(xì)菌的鑒別作用[J].中華實驗眼科雜志,2016,34(10):883-887.

[8] 許穎,馬德勝,宋文楓,等.采用16SrDNA高通量測序技術(shù)分析油藏微生物多樣性[J].應(yīng)用于環(huán)境生物學(xué)報,2016,21(3):409-414.