雞新城疫病毒中和單克隆抗體的制備及鑒定

李青梅，王 麗，馮麗麗，張雨杭，趙 東，楊艷艷，邢廣旭，柴書軍，李賽賽，張麗萍，郭軍慶*，張改平，，4*

（1.河南省農業(yè)科學院動物免疫學重點實驗室，河南鄭州450002；2.河南省農業(yè)科學院農業(yè)經(jīng)濟與信息研究所，河南鄭州450002；3.河南農業(yè)大學牧醫(yī)工程學院，河南鄭州450002；4.江蘇高校動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇揚州225009）

雞新城疫病毒中和單克隆抗體的制備及鑒定

李青梅1，王 麗1，馮麗麗2，張雨杭3，趙 東1，楊艷艷1，邢廣旭1，柴書軍1，李賽賽1，張麗萍1，郭軍慶1*，張改平1，3，4*

（1.河南省農業(yè)科學院動物免疫學重點實驗室，河南鄭州450002；2.河南省農業(yè)科學院農業(yè)經(jīng)濟與信息研究所，河南鄭州450002；3.河南農業(yè)大學牧醫(yī)工程學院，河南鄭州450002；4.江蘇高校動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇揚州225009）

采用差速離心法純化雞新城疫病毒（NDV）標準毒株F48E8，免疫Balb/c小鼠，應用雜交瘤細胞技術制備抗NDV單克隆抗體，旨在為NDV中和抗原表位分析奠定基礎。將NDV感染BHK-21細胞，建立異源免疫過氧化物酶單層細胞試驗（IPMA）的單克隆抗體檢測方法，篩選獲得14株分泌抗NDV單克隆抗體雜交瘤細胞株，其單克隆抗體腹水IPMA效價均在0.50×10-2～2.56×10-5（F48E8株和LaSota株）。血凝抑制試驗（HI）結果表明，單克隆抗體1G6、2C1、4D2、5F2和13A5具有血凝抑制活性，其HI效價在（6～12）log2（F48E8株）和（9～11）log2（LaSota株）。病毒中和試驗結果表明，單克隆抗體5F2和13A 5對F48E8株和LaSota株均有明顯的病毒中和活性，中和效價分別為1∶400～1∶800和1∶25。夾心ELISA結果表明，單克隆抗體5F2識別NDV HN蛋白，13A5識別F蛋白。綜上，成功制備了具有中和活性的NDV單克隆抗體（5F2和13A5）。

雞新城疫病毒；單克隆抗體；免疫過氧化物酶單層細胞試驗；血凝抑制試驗；中和試驗；中和活性

雞新城疫（Newcastle disease，ND）又稱亞洲雞瘟，是由雞新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）引起的一種以呼吸道、消化道黏膜出血為典型病變的高度接觸性、急性敗血性禽類傳染病，世界衛(wèi)生組織（OIE）將其列為應呈報疫病，我國將其列為一類動物傳染?。?-2］。我國采用弱毒疫苗預防控制了ND的大規(guī)模流行，但ND的流行和發(fā)病特點又發(fā)生新變化，多表現(xiàn)為非典型和慢性感染，出現(xiàn)了所謂“非典型新城疫”和“溫和型新城疫”，同時NDV與禽流感病毒等其他呼吸道病原混合感染也十分普遍，使得ND的臨床診斷和防制更加困難。

NDV為有囊膜、不分節(jié)段、單股負鏈RNA病毒，屬于副黏病毒科（Paramyxoviridae）副黏病毒亞科（Paramyxovirinae）禽腮腺炎病毒屬（Avulaviruss），其血清型為禽副黏病毒1型（APMV-1）［1］。NDV基因組長度為15 186、15 192或15 198個核苷酸（nt），含有6個開放閱讀框（ORF），依次編碼核衣殼蛋白（Nucleocapsid，N）、磷蛋白（Phosphoprotein，P）、基質蛋白（Matrix，M）、融合蛋白（Fusion，F(xiàn)）、血凝素-神經(jīng)氨酸酶蛋白（Heamagglutinin-Neuram inidase，HN）和大RNA依賴RNA聚合酶（Large RNA dependent RNA-polymerase，L）6個結構蛋白，其中F和HN蛋白是NDV表面重要的2個囊膜糖蛋白，為病毒的中和抗原，負責病毒吸附和細胞膜融合，在病毒感染過程中起到重要的作用［3］。NDV根據(jù)其基因組長度和F基因序列分為ClassⅠ和ClassⅡ2大系譜，后者包含大多數(shù)強毒株和弱毒株，主要分布于家禽和野鳥，根據(jù)F基因序列又分為10個基因型（Ⅰ—Ⅹ）：基因Ⅰ型NDV除1998—2000年澳大利亞強毒株外，其余均為弱毒株；基因Ⅱ型NDV除廣泛用于活疫苗的弱毒株（如LaSota株等），還有中等毒力毒株和高致病力的強毒株；而Ⅲ—Ⅹ型NDV均為強毒株［4］。流行病學數(shù)據(jù)表明，20世紀90年代中期，我國出現(xiàn)了NDV基因Ⅶ型，并且其成為我國NDV流行的優(yōu)勢基因型，當前Ⅶd亞型在我國流行強毒株中已占有絕對優(yōu)勢［2，5］。在NDV單克隆抗體方面，Panshin等［6-7］利用抗NDV HN、F、M、N蛋白等系列單克隆抗體對NDV分離毒株的抗原表位進行分析發(fā)現(xiàn)，分離毒株的病毒蛋白與疫苗株均存在抗原差異，而M蛋白的抗原表位差異最顯著。Hu等［8］利用5株具血凝抑制（HI）活性單克隆抗體對15株NDV強毒株進行分析發(fā)現(xiàn)，HN蛋白347位氨基酸殘基的E/G→K的突變導致抗原表位（345—353位）缺失。然而，目前對NDV抗原表位特別是中和抗原表位特征及其變異規(guī)律尚缺乏系統(tǒng)分析。

本研究利用NDV感染BHK-21細胞建立異源免疫過氧化物酶單層細胞試驗（IPMA）單克隆抗體檢測方法，篩選具有中和活性的NDV單克隆抗體，以期為NDV中和抗原表位分析奠定基礎，為NDV新型疫苗的分子設計和免疫評價提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 毒株與細胞

雞新城疫病毒標準毒株F48E8和疫苗毒株Lasota均購自中國獸藥監(jiān)察所，分離毒株G1、G2、ND1、ND6、ND7、XX-08由本實驗室分離鑒定；小鼠漿細胞瘤細胞系NS0由英國國家動物健康研究院惠贈，以含10%胎牛血清1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，用于細胞融合；乳倉鼠腎細胞BHK-21由本實驗室保存，以含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，用于NDV感染試驗。

1.2 供試動物

SPF級Balb/c小鼠購自鄭州大學醫(yī)學院實驗動物中心，在SPF級IVC籠中飼養(yǎng)，用于動物免疫；SPF雞胚購自北京梅里亞維通實驗技術有限公司，用孵化器孵育至9～10日齡，用于NDV增殖。

1.3 抗原制備

以9～10日齡SPF雞胚培養(yǎng)NDV標準毒株F48E8與疫苗毒株Lasota，收集尿囊液，以差速離心純化培養(yǎng)病毒。取尿囊液200 m L，4℃、3 000 r/min離心30 min，取上清；凍融3次后，4℃、8 000 r/min離心15 min，取上清；4℃、60 000 r/min離心60 min，棄上清；以5 m L PBS緩沖液（pH值7.2）充分重懸沉淀，測量蛋白質含量和血凝（HA）效價。

1.4 動物免疫

選取5只6周齡Balb/c小鼠，免疫劑量為100 μg/只。首次免疫以等量弗氏完全佐劑乳化抗原，皮下多點注射，每只100μL；加強免疫以弗氏不完全佐劑乳化抗原，每次間隔21 d加強免疫1次，第3、4次免疫后20 d斷尾分離血清，以HI試驗測定血清效價；超強免疫在融合前3～5 d小鼠腹腔注射50μg NDV抗原。

1.5 細胞融合

取超強免疫后4 d的小鼠進行細胞融合，無菌手術取出脾臟，研磨分離成單個脾細胞，與NS0細胞按常規(guī)方法進行融合［9］。用HAT培養(yǎng)基對融合細胞進行選擇性培養(yǎng)，第10～12天取細胞上清進行陽性克隆篩選，選擇強陽性細胞孔以有限稀釋法進行克隆，建立穩(wěn)定分泌抗NDV單克隆抗體的雜交瘤細胞株。

1.6 單克隆抗體制備

以體內誘生腹水法制備抗NDV單克隆抗體，將（2～5）×106個細胞腹腔注射經(jīng)液體石蠟致敏的8周齡Balb/c小鼠，10～15 d后抽取小鼠腹水，分別以H I試驗、IPMA試驗和夾心ELISA法測定腹水的抗體效價。

1.7 HA與H I試驗

在96孔“V”型微量反應板倍比稀釋NDV尿囊液，50μL/孔，每孔加入等量0.5%雞紅細胞，室溫靜置30 min，觀察紅細胞凝集，以100%凝集的最大稀釋度為尿囊液HA效價。在微量反應板加4×HA單位NDV尿囊液（第1列8×HA單位），50μL/孔；在第1列加入待檢等量腹水，并進行倍比稀釋，最后1列設PBS對照，室溫作用30 min；每孔加入等量0.5%雞紅細胞，室溫靜置30 min，觀察紅細胞凝集，以100%抑制凝集的最大稀釋度為腹水HI效價。

1.8 IPM A試驗

利用NDV F48E8株和LaSota株感染BHK-21細胞，建立NDV單克隆抗體的異源IPMA檢測方法。在96孔細胞培養(yǎng)板培養(yǎng)BHK-21細胞至80%，分別接種NDV毒株，感染12 h后，棄去培養(yǎng)上清，每孔加入含0.1%H2O2的甲醇溶液，室溫固定15 min；5%脫脂奶37℃封閉1 h；將待檢雜交瘤細胞上清或梯度稀釋腹水分別加入NDV感染孔中，37℃反應30 m in；每孔加入羊抗鼠酶標二抗，37℃反應30 min；上述每步均以含0.05%Tween-20的PBS充分洗滌；加入AEC顯色液室溫顯色10～15 min，在顯微鏡下觀察顯色。

1.9 病毒中和試驗

應用Reed-Muench方法測定NDV F48E8株和LaSota株對BHK-21的半數(shù)細胞感染量（TCID50）。將不同稀釋度的單克隆抗體腹水與100 TCID50NDV混合，37℃反應30 min，然后感染BHK-21細胞，感染24 h后，利用雞NDV陽性血清以IPMA法檢測NDV的感染，以100%抑制NDV感染的稀釋度為腹水中和效價。

1.10 夾心ELISA試驗

用0.05 mol/L碳酸鹽緩沖液（pH值9.6）1∶200稀釋NDV IgG，包被96孔酶標板，50μL/孔，4℃過夜；經(jīng)5%脫脂奶37℃封閉1 h后，加入適當稀釋的HN和F轉基因水稻重組蛋白，37℃反應30 min；每孔加入待檢雜交瘤細胞上清或梯度稀釋腹水，50μL/孔，37℃反應30 min；每孔加入羊抗鼠酶標二抗，37℃反應30 min；上述每步均以含0.05% Tween-20的PBS充分洗滌；加入TMB顯色液室溫顯色5～10 min，2 mol/L H2SO4終止顯色，酶標儀讀取OD450值，計算待檢抗體S/N值（S/N=ODmAb/ ODPBS），并進行統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 NDV培養(yǎng)與純化結果

用SPF雞胚培養(yǎng)NDV標準毒株F48E8，尿囊液經(jīng)差速離心后，獲得初步純化病毒，其蛋白質含量為5.3 mg/m L，HA效價為12log2。

2.2 抗NDV單克隆抗體雜交瘤細胞篩選結果

以NDV F48E8株和LaSota株感染BHK-21細胞對NDV雜交瘤細胞上清進行異源IPMA檢測，篩選抗體陽性雜交瘤細胞50余株，經(jīng)連續(xù)3次亞克隆，獲得分泌抗NDV單克隆抗體的雜交瘤細胞14株（1B3、1G6、2A5、2C1、3C2、3D10、4D2、5D6、5D7、5E10、5F2、13A5、15H6、16G2），并制備了相應的單克隆抗體腹水，單克隆抗體的IPMA結果見圖1。

2.3 抗NDV單克隆抗體效價

分別以IPMA和HI試驗測定抗NDV單克隆抗體腹水的抗體效價，結果見表1。14株單克隆抗體對NDA標準毒株F48E8和疫苗毒株LaSota的IPMA效價均在0.50×10-2～2.56×10-5；HI試驗結果顯示，單克隆抗體1G6、2C1、4D2、5F2和13A5具有HI活性，其對NDV標準毒株F48E8和疫苗毒株LaSota的HI效價分別在（6～12）log2和（9～11）log2。值得注意的是，單克隆抗體2C1在IPMA和HI試驗中均識別強毒株F48E8，但均不識別疫苗毒株LaSota。

2.4 抗NDV單克隆抗體識別NDV的反應譜

分別以NDV標準毒株、流行毒株和疫苗毒株感染BHK-21細胞，檢測抗NDV單克隆抗體識別NDV的反應圖譜，IPMA結果顯示，除單克隆抗體2C1只識別NDV標準毒株F48E8外，其他單克隆抗體均識別NDV標準毒株、流行毒株和疫苗毒株，具有較廣的NDV反應譜（表2）。

2.5 抗NDV單克隆抗體中和活性

分別以不同稀釋度抗NDV單克隆抗體腹水處理適當稀釋的NDV毒株，然后接種BHK-21細胞，利用雞NDV陽性血清、以IPMA法測定病毒對細胞的感染情況，評估抗NDV單克隆抗體對NDV的中和活性，結果顯示，單克隆抗體5F2和13A5能抑制NDV標準毒株F48E8和疫苗毒株LaSota對細胞的感染，具有病毒中和活性。2株單克隆抗體腹水對F48E8株的中和效價分別為1∶800和1∶25，對LaSota株的中和效價分別為1∶400和1∶25。

2.6 抗NDV單克隆抗體識別病毒蛋白

分別利用轉基因水稻表達的NDV HN和F重組蛋白以夾心ELISA測定抗NDV單克隆抗體所識別的病毒蛋白，根據(jù)待檢抗體的OD450計算S/N值，并設定臨界值為2.5。由圖2可知，單克隆抗體1G6、4D2、5D6、5F2、15H6和16G2檢測HN重組蛋白的S/N值顯著高于F重組蛋白和臨界值，表明其識別NDV HN蛋白；單克隆抗體1B3、2A 5、2C1、3C2、3D10、5E10和13A5檢測F重組蛋白的S/N值高于HN重組蛋白和臨界值，表明其識別NDV F蛋白；單克隆抗體5D7對HN和F重組蛋白的S/N值低于2.5，提示其可能識別NDV其他病毒蛋白。值得注意的是，具有病毒中和活性的單克隆抗體5F2和13A5分別識別HN蛋白和F蛋白。

3 結論與討論

NDV為囊膜病毒，HN和F蛋白等病毒蛋白鑲嵌在病毒囊膜中，在病毒感染和免疫識別中發(fā)揮重要作用，也是疫苗設計和免疫檢測的重要靶標蛋白。病毒密度梯度離心是病毒純化的常用方法，能夠獲得較高純度的病毒粒子，然而在長時間的超速離心過程中，病毒囊膜容易受損，導致囊膜蛋白脫落和丟失。本試驗采用低速和中高速離心去除尿囊液雜質后，通過超速短時離心純化病毒粒子，既獲得較高純度的病毒，又最大限度降低超速離心對病毒囊膜的損害，保證純化病毒具有良好感染毒力和血凝活性，為獲得病毒囊膜蛋白單克隆抗體提供基礎保障。

陽性雜交瘤細胞的篩選是單克隆抗體生產(chǎn)鑒定的關鍵。NDV免疫抗原中的雞胚尿囊液成分誘導產(chǎn)生的抗體是單克隆抗體篩選的最大障礙，本試驗前期嘗試H I試驗、間接ELISA和夾心ELISA等篩選方法，均不能有效區(qū)分針對病毒與雞胚成分的抗體。鑒于NDV不僅能在雞胚成纖維細胞（CEF）增殖，而且可以感染多種哺乳動物細胞［10］，本試驗以NDV感染BHK-21細胞建立了異源IPMA抗體篩選方法，NDV感染的BHK-21細胞只能被NDV陽性血清或抗體特異識別，不與其他抗體發(fā)生非特異反應，有效屏蔽了抗雞胚成分抗體的干擾，實現(xiàn)了NDV單克隆抗體的高效篩選，切實提高了單克隆抗體的生產(chǎn)鑒定效率。

本試驗獲得了2株具有病毒中和活性的單克隆抗體5F2和13A5，且對NDV標準毒株和疫苗毒株均顯示良好中和作用，其中，5F2識別NDV HN蛋白，而13A5識別F蛋白，提示上述2株單克隆抗體識別NDV的中和抗原表位保守性強，對其識別抗原表位的分析鑒定，將為NDV新型疫苗和免疫評價技術研究奠定良好基礎。

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Production and Characterization of Neutralizing Monoclonal Antibodies against Newcastle Disease Virus

LIQingmei1，WANG Li1，F(xiàn)ENG Lili2，ZHANG Yuhang3，ZHAO Dong1，YANG Yanyan1，XING Guangxu1，CHAIShujun1，LISaisai1，ZHANG Liping1，GUO Junqing1*，ZHANG Gaiping1，3，4*
（1.Key Laboratory of Animal Immunology，Henan Academy of Agricultural Sciences，Zhengzhou 450002，China；2.Institute of Agricultural Economics and Information，Henan Academy of Agricultural Sciences，Zhengzhou 450002，China；3.College of Animal Husbandry and Veterinary Medicine，Henan Agricultural University，Zhengzhou 450002，China；4.Jiangsu Co-innovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infectious Diseases and Zoonoses，Yangzhou 225009，China）

Balb/c mice were immunized by the Newcastle disease virus（NDV）reference strain F48E8 purified by differential centrifugation，and used formonoclonal antibodies（m Abs）production using hybridoma technology.After screened by a heterologous immunoperoxidase monolayer assay（IPMA）based on the NDV-infected BHK-21 cells，fourteen hybridoma cell lines secreting mAbs specific for NDV were obtained，whose antibody titers of ascites were determ ined to be 0.50×10-2—2.56×10-5to F48E8 and to La-Sotain by IPMA respectively.In hemagglutination inhibition（H I）assay，mAbs 1G6，2C1，4D2，5F2 and 13A5 showed hemagglutination-inhibitory activity with the HI titers of 6—12log2（F48E8）and 9—11 log2（LaSota），of which mAbs 5F2 and 13A5 showed significant neutralizing activity to both NDV virulent and vaccine strains in the virus neutralization（VN）testw ith the titers of 1∶400—1∶800 and 1∶25 respectively.Furthermore，sandwich ELISA using the recombinant proteins showed that mAb 5F2 reacted with HN protein of NDV，whilem Ab 13A5 recognized the F protein.In conclusion，the NDV m Abs of 5F2 and 13A5 with neutralization activity were obtained successfully.

Newcastle disease virus；monoclonal antibodies；immunoperoxidase monolayer assay；hemagglutination inhibition assay；neutralization assay；neutralization activity

S855.3

A

1004-3268（2017）01-0127-05

2016-09-20

國家重點研發(fā)計劃項目（2016YFD0500800）；公益性行業(yè)（農業(yè)）科研專項（201303033）；河南省科技攻關項目（162102110051）

李青梅（1972-），女，河南鄭州人，副研究員，主要從事快速檢測技術研究。E-mail：350164155@qq.com

*通訊作者：張改平（1960-），男，河南內黃人，研究員，博士，主要從事動物免疫學研究。E-mail：zhanggaiping2003@163.com郭軍慶（1970-），男，河南林州人，研究員，博士，主要從事動物免疫學研究。E-mail：13838248132@163.com