原煙復烤前后細菌種群變化研究

葉建斌，閆 記，劉向真，楊宗燦，申洪濤，劉茂林，楊雪鵬，王根發(fā)，彭玉富，盧昶彤

（1.鄭州輕工業(yè)學院食品與生物工程學院，河南鄭州450001；2.河南中煙工業(yè)有限責任公司技術中心，河南鄭州450000）

原煙復烤前后細菌種群變化研究

葉建斌1，閆 記1，劉向真2*，楊宗燦2，申洪濤2，劉茂林2，楊雪鵬1，王根發(fā)2，彭玉富2，盧昶彤2

（1.鄭州輕工業(yè)學院食品與生物工程學院，河南鄭州450001；2.河南中煙工業(yè)有限責任公司技術中心，河南鄭州450000）

為明確原煙復烤前后表面細菌種群變化情況及其對煙葉發(fā)酵的影響，考察了3種不同煙葉（自然狀態(tài)下的原煙、施加微生物的原煙、復烤后片煙）經(jīng)發(fā)酵后微生物及化學成分的變化情況。不同煙葉發(fā)酵1個月后，利用變性梯度凝膠電泳（DGGE）方法研究表面細菌的變化情況，并采用連續(xù)流動分析法檢測化學成分的變化規(guī)律。結果表明：與原煙相比，復烤后煙葉表面的細菌發(fā)生明顯變化，其中降解蛋白質(zhì)菌（Bacillus cereus）、降解淀粉菌（Bacillus amyloliquefaciens、Bacillus subtilis）、產(chǎn)香菌（Erwinia、Pantoeadispersa）等細菌的數(shù)量均明顯低于復烤前的原煙。發(fā)酵后，原煙表面富集上述幾類細菌，而復烤后煙葉表面細菌則未得到明顯富集，部分細菌已檢測不到。煙葉發(fā)酵1個月后，淀粉、蛋白質(zhì)、氮含量均降低，還原糖含量顯著增加，且原煙的化學成分變化幅度顯著高于復烤后煙葉。表明復烤工藝可造成煙葉表面細菌種類和數(shù)量減少，由此影響煙葉發(fā)酵過程。

原煙；發(fā)酵；細菌群落；細菌種群；化學成分

初烤后的原煙經(jīng)打葉復烤工藝后進入醇化階段，而醇化一般需要2～3 a的時間。截止目前，普遍認為煙葉醇化是復雜化學轉(zhuǎn)化及微生物促進轉(zhuǎn)化協(xié)同作用的過程［1-2］。醇化前，利用煙葉表面微生物對煙葉進行發(fā)酵可有效改善煙葉香味品質(zhì)，適宜的發(fā)酵工藝對煙葉品質(zhì)的提升具有重要意義。

微生物在煙葉發(fā)酵過程中占有重要地位。煙葉表面微生物或其產(chǎn)生的酶可降解煙葉中淀粉、蛋白質(zhì)、木質(zhì)素等大分子物質(zhì)，并形成對應的致香前體物或致香化合物，從而有效改善煙葉品質(zhì)［3］。已有文獻報道，煙葉表面存在一些優(yōu)勢微生物，并在煙葉發(fā)酵過程中發(fā)揮一定作用［4-7］。在此基礎上，研究人員從煙葉表面分離到了部分優(yōu)勢微生物并用于提升煙葉質(zhì)量［7-11］。

傳統(tǒng)的煙葉發(fā)酵研究以復烤后的片煙為對象，忽視了復烤工藝對原煙表面微生態(tài)環(huán)境的破壞及對后續(xù)發(fā)酵過程的影響，可能是導致烤煙發(fā)酵時間較長、品質(zhì)提升較慢的一個重要因素。煙葉復烤包含復雜的處理工藝，其中高溫高濕處理、劇烈的物理剪切等都可能使表面微生物失活或破壞微生物群落結構，從而影響后續(xù)的發(fā)酵進程。因此，有必要考察復烤前后煙葉表面微生物的差異及其導致的發(fā)酵后煙葉質(zhì)量差異。目前，關于發(fā)酵后原煙與烤后煙葉間的差異研究尚未見有文獻報道。據(jù)此，以復烤前后煙葉為對象，考察不同煙葉表面細菌種群的差異，并對比發(fā)酵后煙葉化學成分變化的差異，旨在闡明復烤工藝對原煙表面微生物種群和結構的影響及其對后續(xù)煙葉發(fā)酵的影響，為利用微生物建立合適的原煙發(fā)酵工藝提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料、試劑與儀器

供試煙葉來自3個不同產(chǎn)地：河南襄縣B3F、云南臨滄B3F、云南文山C3F，煙葉年份為2014年，全部為初烤后的原煙，試驗前保存于4℃冰箱內(nèi)。

試劑主要有乙醇、乙酸、色譜甲醇、氯化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、瓊脂糖、牛血清蛋白溶液（BSA）、DNA Marker（Takara）、丙稀酰胺、雙丙稀酰胺、尿素、Tris（Promega）、EDTA（Promega）、GelRed染料（Biotium），以及各種煙葉化學成分測定所需的化學試劑（采用連續(xù)流動分析儀，所需化學試劑參考YC/T 161—2002、YC/T 246—2008、YC/T 216—2007、YC/T 159—2002、YC/T249—2008準備）。

主要儀器：變性梯度凝膠電泳儀以及瓊脂糖凝膠電泳儀（Bio-Red）、連續(xù)流動分析儀、氣相色譜儀、PCR儀、凝膠成像儀、超純水儀，其他儀器參考YC/T 161—2002、YC/T 246—2008、YC/T 216—2007、YC/T 159—2002、YC/T 249—2008準備。

1.2 方法

1.2.1 原煙發(fā)酵過程 每個樣品各取2 400 g原煙，平均分成4個部分：一部分直接進入恒溫恒濕控制箱（自然狀態(tài)下的原煙，記為Raw）；一部分經(jīng)過70℃高溫處理15 m in后，采用模擬復烤方式去梗后打成片煙，然后進入恒溫恒濕控制箱（打葉復烤后片煙，記為Redry）；另一部分施加實驗室前期從煙葉表面分離獲得的微生物［包括巨大芽孢桿菌（降解淀粉）、短小芽孢桿菌（降解蛋白質(zhì)）及厄文氏菌（Erwinia，產(chǎn)香）］，將微生物于50 m L的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)后，離心去掉上清液，用無菌水洗凈培養(yǎng)基，并將3種微生物按照質(zhì)量1∶1∶1混合后重新溶解于50 m L的無菌水中，并以煙葉質(zhì)量的10%施加到煙葉表面，然后進入恒溫恒濕控制箱（施加微生物的原煙，記為M icro）；剩余部分作為空白對照（記為CK）直接放入4℃冰箱保存。所有煙葉表面都施加無菌去離子水，施加量與施加微生物的體積一樣，同時恒溫恒濕箱中控制溫度37℃、濕度65%條件下進行發(fā)酵，30 d后結束發(fā)酵過程。發(fā)酵結束后取各樣品煙葉測定化學成分和表面細菌群落結構。

1.2.2 煙葉表面微生物收集 取20 g煙葉置于滅菌的搖瓶中，加入200 m L磷酸鉀緩沖液（pH值7.0，0.02 mol/L），在30℃的搖床上以200 r/min的轉(zhuǎn)速搖勻30 min，用雙層紗布過濾掉煙葉，收集濾液，濾液在6 000 r/m in下離心30 min，倒掉上清保留沉淀。煙葉表面微生物包含在沉淀當中，收集好沉淀后用于基因組DNA的提取。

1.2.3 微生物種群結構鑒定 煙葉表面微生物全基因組DNA的提取采用Fast DNA Spin kit for soil（MP Biomedicals，Santa Ana，CA），依照說明書優(yōu)化后操作，獲得全基因組DNA，取其中的10μL進行瓊脂糖凝膠電泳，剩余保存于-20℃。

以微生物的全基因組DNA為模板，采用微生物的16S rDNA可變區(qū)V3的通用引物進行PCR擴增，所采用的通用引物為341F（5′-CCTACGGGAGGCAGCAG-3′）和518R（5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′），其中341F的5′端帶有GC發(fā)夾結構（5′-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGG-3′）。采用降落PCR進行擴增（touch down PCR）：95℃預變性5 min；94℃變性1 min，65～56℃下30 s（每個循環(huán)降1℃，共10個循環(huán)），72℃延伸1 min，后20個循環(huán)用55℃退火30 s，最后72℃下延伸10 min。結束后進行復原條件PCR（reconditioning PCR）去除引物二聚體；以此次2.5μL PCR產(chǎn)物為模板，以相同的反應體系和反應條件再次進行PCR擴增，把循環(huán)數(shù)減少到3個循環(huán)。

采用Bio-Rad電泳裝置，將擴增獲得的PCR產(chǎn)物進行變性梯度凝膠電泳（DGGE）。電泳膠采用8%的聚丙稀酰胺凝膠，并制成40%～60%的梯度變性膠（100%變性劑為7 mol/L尿素和40%去離子甲酰胺的混合物），電泳液為0.5×TAE電泳緩沖液（20 mmol/L Tris-HCl，pH值8.3，10 mmol/L醋酸，0.5 mmol/L EDTA），樣品在60℃、75 V電壓下電泳16 h。電泳結束后用Gelred染色，再用凝膠成像儀拍照。

1.2.4 微生物分子鑒定 從DGGE膠上割下具有代表性的條帶，置于EP管中，然后加入30μL滅菌去離子水，于4℃下放置過夜，使DNA慢慢溶解出來。取2μL該DNA溶液，進行PCR擴增。PCR引物仍為518R和341F，但341F的5′端不帶GC發(fā)夾結構，反應條件為：94℃變性1 min，30個循環(huán)的擴增（94℃30 s，50℃30 s，72℃2 min），最后72℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物進行電泳驗證，直到所有目的條帶都擴增成功，送往測序公司進行測序。測序獲得的序列與NCBI（http：//www.ncbi.Dlin.nih.gov/ blastA）上的數(shù)據(jù)庫進行比對，找出進化關系最近的物種，并采用鄰接法（Neighbor-Joining，NJ）構建進化樹。

1.2.5 煙葉化學成分測定 對3個不同產(chǎn)地來源各4組處理方式的煙葉進行了化學成分測定，具體包括總氮、煙堿、淀粉、水溶性糖和還原糖、蛋白質(zhì)含量。具體測定方法分別依照YC/T 161—2002、YC/ T 246—2008、YC/T 216—2013、YC/T 159—2002、YC/T 249—2008進行操作。

2 結果與分析

2.1 不同處理煙葉表面微生物種群含量

提取發(fā)酵30 d后4組煙葉表面的微生物總DNA，進行瓊脂糖凝膠電泳，所獲得DNA片段大于2 000 bp（圖1）。從圖1可以看出，4組不同煙葉中，復烤后煙葉（Redry）表面微生物含量最少，甚至少于CK，初步表明原煙經(jīng)打葉復烤后表面微生物有所減少，這可能與打葉復烤工藝造成的微生物失活有所關聯(lián)。原煙表面微生物在經(jīng)過一段時間的發(fā)酵后有所增加，其中施加微生物的原煙表面微生物含量增加最多，自然狀態(tài)下原煙次之，經(jīng)發(fā)酵后復烤煙葉表面微生物量仍少于原煙。不同產(chǎn)地煙葉表面微生物含量有所差異，云南文山C3F原煙表面微生物含量略多于云南臨滄B3F，而河南襄縣B3F原煙表面的微生物含量則相對較少。

2.2 不同處理煙葉表面微生物種群分析

為確定煙葉表面微生物種群數(shù)量的變化情況，利用通用引物擴增16S rDNA，擴增后的片段在200 bp左右（圖2），將PCR擴增后的產(chǎn)物進行DGGE電泳，結果如圖3，每個泳道中條帶數(shù)量可以代表其中的微

生物種類數(shù)量，而亮度可代表微生物的含量。由圖3可知，與CK相比，復烤后煙葉表面微生物種類有所減少，部分微生物甚至無法檢測到。如河南襄縣B3F煙葉，條帶3、4在復烤后煙葉表面均未檢測到；云南文山C3F煙葉中多個條帶在復烤煙葉表面亮度較低，表明其微生物含量低。因此，部分微生物在經(jīng)過高溫處理后已經(jīng)失活，在發(fā)酵過程中難以得到有效富集。相反，原煙經(jīng)過一段時間發(fā)酵后表面部分微生物得到富集，3個不同產(chǎn)地的自然狀態(tài)下的原煙（Raw）與對應產(chǎn)地的CK相比，部分條帶亮度明顯加強，暗示對應微生物含量增加。如河南襄縣B3F的條帶1、3、4；云南臨滄B3F的條帶5、6、10；云南文山C3F的條帶11、13、15。施加微生物的原煙表面微生物富集更多，其DNA條帶數(shù)量比同一產(chǎn)地的其他煙葉要多，部分條帶亮度也更強，暗示種群數(shù)量和微生物含量均有所增加。結果顯示，原煙表面所攜帶的微生物在發(fā)酵過程中得到有效富集，而經(jīng)復烤后的煙葉表面部分微生物失活，在發(fā)酵過程中難以富集。

2.3 不同處理煙葉表面微生物種類變化規(guī)律

為了進一步確定這些煙葉表面微生物種類的變化情況，將圖3中變化較為明顯的條帶（1—16及S1、S2、S3）進行割膠后測序，將序列與GenBank中已有數(shù)據(jù)庫進行比對，尋找最為相近的微生物種群，并構建進化樹（圖4）。

與報道文獻［12-18］相比，這些在煙葉表面具有明顯差異的細菌根據(jù)功能不同可分為產(chǎn)香、降解淀粉、降解蛋白質(zhì)及降解煙堿4類細菌以及部分不可培養(yǎng)的細菌。經(jīng)測序，條帶1、4、5、9、15與之前在煙葉表面發(fā)現(xiàn)的產(chǎn)香微生物厄文氏菌（Erwinia）以及泛菌屬（Pantoea dispersa）在分子進化上類似，其中厄文氏菌是一類降解類胡蘿卜素生成香味物質(zhì)的重要微生物［12］，而泛菌屬微生物也已被報道可降解類胡蘿卜素生成煙草中重要香味物質(zhì)［13］。條帶3和6與枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）在分子進化上接近；條帶7和11與解淀粉類芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）類似，這2類微生物已被證實屬于可降解淀粉的微生物［14-15］。條帶2、8、14、16與蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）類似，是一類被廣泛證實可降解蛋白質(zhì)的微生物［16］。另外，條帶S1—S3屬于實驗室前期從煙葉表面富集分離到的微生物，進化樹確定S1為厄文氏菌（產(chǎn)香類細菌），S2為巨大芽孢桿菌（降解煙堿類細菌）［17］，而S3則為短小芽孢桿菌（降解蛋白質(zhì)類細菌）［18］。除此之外，還發(fā)現(xiàn)了一些不可培養(yǎng)的細菌，包括條帶10、12、13。結合圖3分析，與CK相比，復烤后煙葉表面產(chǎn)香、降解淀粉、降解蛋白質(zhì)及降解煙堿4類細菌種類和數(shù)量減少較為明顯，而原煙經(jīng)發(fā)酵后則有所增加。例如Bacillus subtilis（條帶3）、Bacillus cereus（條帶2）、Pantoea dispersa（條帶4）在河南襄縣B3F原煙中均有檢出，而在復烤后煙葉中卻無法檢測到，其中原煙發(fā)酵后表面微生物含量多于CK，說明其在發(fā)酵過程得到了富集；同樣在發(fā)酵后的云南臨滄B3F原煙表面檢測到大量Bacillus subtilis（條帶6）、Bacillus cereus（條帶8）、Erwinia（條帶5、9），而這些微生物的含量在復烤后的煙葉表面則明顯較少；云南文山C3F呈現(xiàn)出了同樣的趨勢。外源添加的3類微生物在發(fā)酵一段時間后也得到了一定的富集。圖3中，條帶S1、S2、S3在3個產(chǎn)地的施加微生物原煙（Micro）表面都有檢出，并且微生物含量較多。因此推斷，這幾類分離于煙葉表面的微生物通過合適的外源培養(yǎng)后再施加到煙葉表面，可得到富集。結果證明，復烤前后煙葉表面微生物種類和數(shù)量存在較大的差異，這種差異在后續(xù)的發(fā)酵過程中越發(fā)明顯，由此可能影響煙葉發(fā)酵過程。

2.4 不同處理煙葉的化學成分

為了探討煙葉表面微生物菌群變化對煙葉發(fā)酵過程的影響，利用連續(xù)流動法測定了各化學成分含量，包括淀粉、蛋白質(zhì)、還原糖、煙堿、總氮以及水溶性總糖。表1顯示，與CK相比，經(jīng)發(fā)酵后，所有原煙和復烤后片煙的淀粉含量均有所降低，還原糖含量增加。其中，施加微生物的原煙變幅最為顯著，其次是自然發(fā)酵后的原煙，復烤后片煙變幅最少，這與煙葉表面降解淀粉的微生物含量明顯多于復烤后片煙（圖3，條帶3、6、7、11、S3）表現(xiàn)一致。云南文山C3F原煙施加微生物發(fā)酵1個月后淀粉含量降低了20.2%，而還原糖含量增加了11.1%；云南臨滄B3F次之，淀粉含量降低18.0%，還原糖含量則增加了11.0%；河南襄縣B3F變幅相對較少，淀粉含量降低13.7%，而還原糖含量增加了9.8%。還原糖增加可能與淀粉的降解有一定的關系。與CK相比，經(jīng)發(fā)酵后的煙葉蛋白質(zhì)和總氮含量均有所降低，且變化量明顯。3個產(chǎn)地的煙葉蛋白質(zhì)降解率均表現(xiàn)為施加微生物的原煙＞自然狀態(tài)下的原煙＞復烤后的片煙。其中，云南文山C3F施加微生物的原煙蛋白質(zhì)和氮含量分別降低了17.9%和18.2%；自然狀態(tài)下的原煙則分別降低了15.4%和13.6%；而復烤后片煙只減少了6.5%和9.1%。原煙表面降解蛋白質(zhì)類微生物的富集可能會加速煙葉蛋白質(zhì)和總氮的降解。經(jīng)發(fā)酵1個月后，原煙表面此類微生物（圖3，條帶2、8、14、16）的富集明顯優(yōu)于復烤后片煙。發(fā)酵過程中總糖含量總體上呈減少趨勢，但變化規(guī)律不明顯，部分煙葉經(jīng)發(fā)酵后還有所增加?？偺呛康臏y定包括了所有還原糖以及其他一些多糖，因此在本研究中無法利用微生物種群的變化來解釋，需要后期進一步跟蹤檢測。

在發(fā)酵過程中，煙堿含量也有不同程度的降低，其中復烤后片煙中煙堿含量降低最為明顯，而施加微生物的原煙次之，自然狀態(tài)下的原煙降解最少。推斷高溫可能是導致煙堿含量減少的主要因素之一，這部分減少的煙堿可能是原煙中游離態(tài)的煙堿。復烤前后煙葉化學成分變化的差異證明，對應微生物的種群和結構變化可影響發(fā)酵后的煙葉質(zhì)量。因此，復烤中高溫處理工藝對原煙表面微生物的影響是導致煙葉化學成分變化的重要因素。

3 結論與討論

與原煙相比，復烤后煙葉表面的微生物發(fā)生顯著變化，降解蛋白質(zhì)菌（Bacillus cereus）、降解淀粉菌（Bacillus amyloliquefaciens，Bacillus subtilis）、產(chǎn)香菌（Erwinia，Pantoea dispersa）等微生物的數(shù)量均明顯低于復烤前的原煙。由此可以預期，煙葉經(jīng)復烤后表面微生物的種群和結構會出現(xiàn)一定的變化。這可能是因為復烤過程中高溫高濕工藝條件破壞了煙葉表面的微生物群落結構。本研究利用DGGE手段鑒定了在此過程中變化的微生物種類，特別是對一些降解大分子物質(zhì)的微生物進行了分子鑒定，為原煙生物發(fā)酵提供一定的理論參考價值。

經(jīng)1個月發(fā)酵，上述幾類微生物隨著發(fā)酵的進行可在原煙表面得到富集，而復烤后煙葉表面微生物則未得到明顯富集。這些微生物在復烤工藝后可能已經(jīng)失活，難以重新成為優(yōu)勢菌群。另一方面，復烤后的片煙表面微生物種類已經(jīng)有所減少，群落結構可能已遭到破壞，新的微生物種群和結構需要一定時間來完成恢復過程。已有文獻報道，復烤后片煙表面微生物在陳化過程會出現(xiàn)一定的變化［16］，且隨著陳化的進行，表面微生物種類有所減少，但未闡明其中的原因。根據(jù)本研究結果推測，原煙表面微生物在經(jīng)打葉復烤后出現(xiàn)種群及結構上的劇烈變化，進入陳化階段后，新的微生物群落結構會以煙葉表面的營養(yǎng)物質(zhì)作為微生物培養(yǎng)基質(zhì)進行一定的繁殖，同時部分微生物可能難以適應自然醇化下的條件改變而最終失活或消失。

煙葉的化學成分比較驗證了上述結論，經(jīng)發(fā)酵后淀粉含量均降低，還原糖含量均顯著增加，蛋白質(zhì)和氮含量均有所降低。其中微生物種類和數(shù)量越多的煙葉樣品中，這幾類化學成分的變化趨勢越明顯，同一產(chǎn)地的原煙均高于復烤后的煙葉。本研究通過16S rRNA分子鑒定確定了降解淀粉菌、降解蛋白質(zhì)菌及部分產(chǎn)香菌。這些微生物可以利用對應底物作為生長基質(zhì)，在發(fā)酵過程中得到一定的富集。淀粉、蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)本身對于卷煙工業(yè)是不利的，因此，通過發(fā)酵后其含量減少將可能對煙葉內(nèi)在品質(zhì)有一定的改變，后期還將通過更為專業(yè)的煙草評吸人員進行感官評吸驗證。

本研究結果表明，復烤過程可造成煙葉表面降解大分子物質(zhì)的微生物種類和數(shù)量減少，因此，傳統(tǒng)的復烤后片煙發(fā)酵工藝并未完全發(fā)揮微生物改善煙葉質(zhì)量的重要作用，后續(xù)的煙葉發(fā)酵工藝及煙葉質(zhì)量有待進一步改善?？傊?，在煙葉發(fā)酵過程中，應正確考慮原煙表面微生物對煙葉發(fā)酵的影響，為發(fā)揮這些微生物作用可考慮在復烤前引入相應的原煙發(fā)酵工藝。

［1］ 宮長榮，于建軍.煙草原料初加工［M］.北京：中國輕工業(yè)出版社，1993.

［2］ 朱大恒，王浩，韓錦峰，等.烤煙發(fā)酵過程中氧氣條件對煙葉化學成分的影響［J］.河南農(nóng)業(yè)科學，1999（9）：12-14.

［3］ 陳福星.煙葉微生物發(fā)酵的探討［J］.微生物學通訊，1990（2）：37-38.

［4］ 羅家基，朱子高，羅毅，等.微生物在煙葉發(fā)酵過程中的作用［J］.煙草科技，1998（1）：6.

［5］ Dawson R F.Talk on the cigarette filler symposium［M］. Kansas：Philip Morris Tobacco Com pany，1965.

［6］ 朱大恒，陳銳，陳再根，等.烤煙自然醇化和人工發(fā)酵過程中微生物變化及其與酶活性關系的研究［J］.中國煙草學報，2001，7（2）：26-30.

［7］ Gong X W，Yang JK，Duan Y Q，et al.Isolation and characterization of Rhodococcus sp.Y22 and its potential application to tobacco processing［J］.Research Microbiology，2009，160：200-204.

［8］ 高文霞，程祖鋅，王峰吉.烤煙發(fā)酵有益細菌的分離篩選及優(yōu)良菌株的鑒定［J］.基因組學與應用生物學，2011，30（5）：608-613.

［9］ Reid J J，Mckinstry D W，Haley E E.Studies on the fermentation of tobaccoⅠ.The microflora of cured and fermenting cigar-leaf tobacco［J］.Pennsylvania Agricultural Experiment Station Bulletin，1933，356：1-17.

［10］ Tamayo A I，Cancho F G.Microbiology of the fermentation of Spanish tobacco［J］.International Congress of Microbiology，1953（6）：48-50.

［11］ English C F，Bell E J，Berger A J.Isolation of Thermophiles from broadleaf tobacco and effect of pure culture inoculation on cigar aroma and mildness［J］. Applied M icrobiology，1967，15（1）：117-119.

［12］ 提婕，張蕾，劉敏，等.噬夏孢歐文氏菌GGPP合成酶與八氫番茄紅素合成酶相互作用的研究［J］.青島大學學報（工程技術版），2011，26（1）：66-70.

［13］ Zhao Y，Zhong G F，Yang X P，et al.Bioconversion of lutein to form aroma compounds by Pantoea dispersa［J］.Biotechnology Letters，2015，37（8）：1687-1692.

［14］ 馮志珍.解淀粉芽孢桿菌FB-16的篩選及其對作物疫霉菌的抑制作用［D］.楊凌：西北農(nóng)林科技大學，2012.

［15］ Quan C S，Wang J H，Xu H T，et al.Identification and characterization of a Bacillus amyloliquefaciens with high antifungal activity［J］.Wei Sheng Wu Xue Bao，2006，46（1）：7-12.

［16］ 伍雪蓮.陳化烤煙煙葉細菌群落鑒定及應用研究［D］.廣州：華南理工大學，2014.

［17］ 蘇玉龍，王倩，張成省，等.降解烤煙秸稈和煙堿菌株的篩選及其產(chǎn)酶特性［J］.微生物學報，2015，55（12）：1543-1550.

［18］ 王繼蓮.煙用蛋白酶制劑的研發(fā)及其作用機制研究［D］.昆明：昆明理工大學，2012.

Study on Change of Bacteria Populations of Raw Tobacco Leaves before and after Redrying

YE Jianbin1，YAN Ji1，LIU Xiangzhen2*，YANG Zongcan2，SHEN Hongtao2，LIU Maolin2，YANG Xuepeng1，WANG Genfa2，PENG Yufu2，LU Changtong2
（1.College of Food and Biological Engineering，Zhengzhou University of Light Industry，Zhengzhou 450001，China；2.Technology Center，China Tobacco Henan Industrial Co.，Ltd.，Zhengzhou 450000，China）

In order to study the changing of bacterial populations on the leaf surface of tobacco before and after redrying，three different kinds of tobacco leaves were investigated，including raw tobacco leaves，raw tobacco leaves adding microbes and flue-cured tobacco leaves.After fermentation for one month，the change of bacterial populations on the leaf surface of tobacco were studied by DGGE（denaturing gel gradient electrophoresis），the change of chemical compositions of tobacco leaves were detected by the continuous flow method.The results showed that the bacterial populations on the leaf surface of tobacco changed largely after redrying.The numbers of protein degrading bacteria（Bacillus cereus），starch degrading bacteria（Bacillus amyloliquefaciens，Bacillus subtilis）and aroma producing bacteria（Erwinia，Pantoeadispersa）were obviously lowered after redrying.These kinds of bacteria were increased in raw tobacco leaves after onemonth fermentation，while they almost disappeared in the flue-cured tobacco leaves.For chemical compositions，contents of starch，protein and total nitrogen declined，sugar content increased.Likewise，the change amp litude of these chemical compositions was relatively larger in raw tobacco leaves than that in the flue-cured tobacco leaves.Study here indicated that the redrying process could reduce the bacterial population on the surface of tobacco leaves，which may effect the fermentation process.

raw tobacco；fermentation；bacterial communities；bacteria populations；chemical compositions

Q939.9；TS44+3；TS44+4

A

1004-3268（2017）01-0154-06

2016-07-15

河南中煙科技創(chuàng)新項目（YN2014046）；鄭州輕工業(yè)學院博士基金項目（BSJJ2014066）

葉建斌（1986-），福建莆田人，講師，博士，主要從事煙草生物技術、煙草原料學研究。E-mail：happye1986@163.com

*通訊作者：劉向真（1982-），河南濮陽人，工程師，本科，主要從事煙草原料學研究。E-mail：30623504@qq.com