一種快速檢測(cè)小麥赤霉病菌種類的方法

張 林，張夢(mèng)雅，康 健，閆紅飛，劉大群

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院/國(guó)家北方山區(qū)農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究中心/河北省農(nóng)作物病蟲害生物防治工程技術(shù)研究中心，河北保定071000）

一種快速檢測(cè)小麥赤霉病菌種類的方法

張 林，張夢(mèng)雅，康 健，閆紅飛*，劉大群*

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院/國(guó)家北方山區(qū)農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究中心/河北省農(nóng)作物病蟲害生物防治工程技術(shù)研究中心，河北保定071000）

為建立一種能夠快速、簡(jiǎn)便和準(zhǔn)確檢測(cè)我國(guó)小麥赤霉病菌種類的方法，直接采用發(fā)病麥穗快速提取DNA，并結(jié)合特異性分子標(biāo)記對(duì)采自我國(guó)的小麥赤霉病菌種類進(jìn)行快速檢測(cè)。該檢測(cè)方法成功實(shí)現(xiàn)了對(duì)小麥赤霉病菌基因組DNA的快速提取和特異性分子標(biāo)記檢測(cè)，通過對(duì)河北、河南、江蘇、安徽四省41份樣本的檢測(cè)驗(yàn)證，結(jié)果顯示，安徽合肥與江蘇南京地區(qū)的18份材料均為亞洲鐮刀菌（Fusarium asiaticum），河北安新與趙縣地區(qū)的12份材料均為禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum），而河南地區(qū)的11份材料中2種致病菌株均有出現(xiàn)，檢測(cè)結(jié)果與已經(jīng)報(bào)道的這2種致病菌的地區(qū)分布情況一致。該方法不僅可以達(dá)到傳統(tǒng)方法（CTAB法提取DNA）的效果，而且與之相比還具有快速、簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn)，可用于小麥赤霉病菌群體結(jié)構(gòu)和地區(qū)分布情況的研究。

小麥；赤霉病菌；快速檢測(cè)；禾谷鐮刀菌；亞洲鐮刀菌

小麥赤霉病是一種世界性病害，在各小麥生產(chǎn)國(guó)普遍發(fā)生，尤其是在氣候潮濕多雨地區(qū)危害嚴(yán)重［1］，且目前缺少免疫或高抗的小麥品種［2］。我國(guó)小麥赤霉病發(fā)生頻率高且危害嚴(yán)重，其在小麥各生育期均可危害，以穗部危害為主［3］，一般發(fā)病年份引起減產(chǎn)10%～15%，嚴(yán)重時(shí)損失可達(dá)20%～40%［4-5］；在其危害過程中還會(huì)產(chǎn)生DON毒素（脫氧雪腐鐮刀菌烯醇）并積累于籽粒中［6］，不僅降低了小麥品質(zhì)［7］，食用后還會(huì)引起人畜中毒［8-9］。我國(guó)歷史上小麥赤霉病的首次暴發(fā)流行發(fā)生在1936年［10］，之后2003年和2012年為2個(gè)特大流行年份。2000年以來，江蘇［11-12］和安徽［13-15］兩省在2003、2010、2012、2014、2015年發(fā)生均非常嚴(yán)重，流行頻率日趨增加，發(fā)生區(qū)域也逐漸向北蔓延擴(kuò)展［16-18］。

據(jù)報(bào)道，我國(guó)冬小麥主產(chǎn)區(qū)小麥赤霉病的主要致病菌為禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum）和亞洲鐮刀菌（Fusarium asiaticum），且黃淮流域及以北地區(qū)以F.graminearum為主，長(zhǎng)江中下游的南方地區(qū)以F.asiaticum為主［19］，不同種類赤霉病菌的致病力與產(chǎn)生的毒素類型存在差異［20-21］。因此，研究致病菌種群組成及結(jié)構(gòu)的變化，可為小麥赤霉病的預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)、綜合防治與抗病育種提供依據(jù)［22］。目前，分子檢測(cè)技術(shù)已應(yīng)用于小麥赤霉病菌種群組成與結(jié)構(gòu)的分析［23］，尤其是特異分子標(biāo)記的開發(fā)［24］，使得小麥赤霉病菌種類檢測(cè)鑒定較之以往形態(tài)鑒定更為快速準(zhǔn)確。但目前小麥赤霉病菌種類的分子檢測(cè)鑒定方法仍較為繁瑣，主要體現(xiàn)在需對(duì)病菌進(jìn)行分離培養(yǎng)，菌株DNA的提取一般采用CTAB法或SDS提取法［3-4，8，16-17，19-20，25-27］，整個(gè)檢測(cè)鑒定過程費(fèi)時(shí)費(fèi)工。

鑒于上述檢測(cè)小麥赤霉病菌種類方法的不足，本試驗(yàn)旨在建立一種更為簡(jiǎn)便、快速和準(zhǔn)確的檢測(cè)小麥赤霉病菌種類的方法。通過摸索，初步確定了Chelex-100法直接從病穗上提取病原菌DNA，并與特異性分子標(biāo)記檢測(cè)相結(jié)合的方法，將為簡(jiǎn)便、快速檢測(cè)鑒定小麥赤霉病菌種類，并明確其群體組成、結(jié)構(gòu)變化和地區(qū)分布提供幫助。

1 材料和方法

1.1 小麥赤霉病標(biāo)樣材料的采集

檢測(cè)材料要求采集帶有粉紅色霉層的小麥病穗，可根據(jù)病穗上產(chǎn)生粉紅色霉層情況進(jìn)行采集，若一個(gè)病穗上有1～2個(gè)小穗發(fā)病且產(chǎn)生粉紅色霉層，則采集病穗2～3穗即可。本研究所用材料為2015年采自于河北省、河南省、安徽省和江蘇省符合以上標(biāo)準(zhǔn)的41份赤霉病穗材料和2014年采自安徽白湖農(nóng)場(chǎng)、河北安新2份材料的分離菌株（由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)分子植物病理和生物防治實(shí)驗(yàn)室分離、鑒定并保存）與所保存的病穗。

1.2 小麥赤霉病菌基因組DNA提取

2份已鑒定菌株材料DNA的提取采用2種方法：CTAB法［3］提取培養(yǎng)菌株的菌絲DNA和Chelex-100法［28］從已知菌株所保存的病穗提取DNA；41份樣本的DNA提取采用Chelex-100法。用紫外分光光度儀檢測(cè)樣品DNA的濃度和純度。Chelex-100法具體操作如下：（1）用刮刀直接刮取小麥赤霉病穗上2～3個(gè)發(fā)病小穗穎殼上粉紅色霉?fàn)钗铮⒅糜?.5 m L滅菌的離心管中；（2）用移液器加入30～40μL 20%的Chelex-100，混勻；（3）沸水浴2～3 min，取出后，渦旋振蕩10 s，再沸水浴5 min；（4）取出離心管，8 000 r/min離心3 m in，上清液即可作為PCR模板。

1.3 小麥赤霉病菌的PCR檢測(cè)體系

以2個(gè)已知小麥赤霉病菌基因組DNA為模板，利用赤霉病菌特異引物Fg11（F：5′-CTCCGGGATATGTTGCGTCAA-3′；R：5′-GGTAGGTATCCGACATGGCAA-3′）［29］進(jìn)行PCR擴(kuò)增，該引物在F.asiaticum中可擴(kuò)增出497 bp片段，在F.graminearum中可擴(kuò)增出410 bp片段。

PCR反應(yīng)體系（10μL）：模板DNA（30 ng/μL）1μL，Taq酶（2.5 U/μL）0.1μL，上、下游引物（10μmol/L）各0.2μL，dNTPs（10mmol/L）0.2μL，10 ×PCR Buffer 1μL，用無菌超純水補(bǔ)充反應(yīng)體系至10μL。反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min，4℃保存。以上PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.4 小麥赤霉病菌檢測(cè)效果驗(yàn)證

利用特異引物Fg11對(duì)41份樣本進(jìn)行擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增體系與程序同上，驗(yàn)證該檢測(cè)方法的準(zhǔn)確性。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥赤霉病菌檢測(cè)方法的確立

采用CTAB法和Chelex-100法提取已知小麥赤霉病菌株的基因組DNA，前者提取過程要經(jīng)分離培養(yǎng)、研磨、抽提、水浴、離心、沉淀、洗滌和干燥等步驟，且提取過程中需使用7～9種試劑，需時(shí)5～7 d；Chelex-100法提取DNA僅需直接刮取病穗霉層、水浴、渦旋振蕩和離心4個(gè)主要步驟，所用試劑僅有20%Chelex-100，整個(gè)提取過程大約需12 min。通過整體比較表明，采用Chelex-100法提取小麥赤霉病菌基因組DNA的過程更為快速、簡(jiǎn)便。

經(jīng)檢測(cè)，Chelex-100法提取的DNA質(zhì)量濃度平均為1 200 ng/μL，OD260/OD280值介于1.75～1.95；CTAB法提取的DNA質(zhì)量濃度平均為1 500 ng/μL，OD260/OD280值介于1.70～1.90。2種方法提取的基因組DNA均滿足PCR的要求。利用特異引物Fg11對(duì)2種方法提取的DNA進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)，結(jié)果顯示，2種方法提取的DNA樣本均能擴(kuò)增出穩(wěn)定清晰的目的條帶（圖1），表明Chelex-100法提取小麥赤霉病菌基因組DNA是可行的，其結(jié)果能達(dá)到CTAB法的效果。特異引物從安徽白湖菌株擴(kuò)增出497 bp的片段，為F.asiaticum；從河北安新菌株擴(kuò)增出410 bp的片段，為F.graminearum（圖1）。該結(jié)果與已知菌株的鑒定結(jié)果一致，表明本試驗(yàn)建立的PCR檢測(cè)體系具有準(zhǔn)確性。

上述結(jié)果表明，本研究確立的由改進(jìn)Chelex-100法快速提取DNA和PCR鑒定體系相結(jié)合來檢測(cè)小麥赤霉病菌種類的方法是可行的，而且具有快速、簡(jiǎn)便和準(zhǔn)確的特點(diǎn)。

2.2 小麥赤霉病菌樣本檢測(cè)驗(yàn)證結(jié)果

采用快速檢測(cè)方法對(duì)41份樣本進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，41份材料均能擴(kuò)增出穩(wěn)定且清晰的條帶，其中22個(gè)小麥赤霉病菌樣本擴(kuò)增出大小為497 bp的條帶，19個(gè)小麥赤霉病菌樣本擴(kuò)增出大小為410 bp的條帶（圖2）。

根據(jù)以上檢測(cè)結(jié)果，在所鑒定的41份樣本中，安徽合肥與江蘇南京地區(qū)小麥赤霉病菌均為F.asiaticum，河北安新與趙縣地區(qū)小麥赤霉病菌均為F.graminearum，河南地區(qū)2種菌株均有出現(xiàn)（表1）。

3 結(jié)論與討論

小麥赤霉病菌種類的檢測(cè)鑒定是研究小麥赤霉病發(fā)生發(fā)展及其致病菌群體分布的基礎(chǔ)。已報(bào)道的赤霉菌檢測(cè)鑒定方法［3-4，8，16-17，19-20，25-27］，大多首先分離、培養(yǎng)、純化病原菌菌種，而后采用CTAB法或SDS法提取菌種DNA，操作繁瑣，費(fèi)工費(fèi)時(shí)，僅該過程需耗時(shí)5～7 d。Chelex-100法作為一種快速高效提取基因組DNA的方法，已成功應(yīng)用于植物炭疽病菌、枯萎病菌和鐮刀菌等真菌菌絲DNA的提取［30-31］，在白粉病菌分生孢子、小麥條銹菌和葉銹菌夏孢子的基因組DNA提取上也有很好的效果［28，32-33］。為了更為簡(jiǎn)便、快速和準(zhǔn)確地檢測(cè)赤霉病菌，本研究建立了采用Chelex-100法從標(biāo)樣材料上直接快速提取DNA與特異性分子標(biāo)記檢測(cè)相結(jié)合的方法，無需分離培養(yǎng)菌株、操作步驟簡(jiǎn)單、耗時(shí)很短，整個(gè)檢測(cè)過程用時(shí)僅需3～5 h。但該方法尚存在需改進(jìn)的地方，如對(duì)于檢測(cè)材料的要求，需采集帶有粉紅色霉層的病穗，而對(duì)于發(fā)病癥狀不典型的材料該方法可能存在一定的不足。若對(duì)病菌進(jìn)行分離培養(yǎng)后再應(yīng)用該方法，則可簡(jiǎn)化后期的DNA提取過程，亦能節(jié)省一些時(shí)間并可避免繁雜的操作過程。

我國(guó)小麥赤霉病的致病菌北方地區(qū)以F.gram inearum為主，南方地區(qū)以F.asiaticum為主，其分布具有很強(qiáng)的區(qū)域性。Qu等［34］對(duì)1999年分離的小麥赤霉菌組成進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)我國(guó)小麥赤霉菌中95%的F.asiaticum菌株分布在年均氣溫大于15℃的溫暖地區(qū)，59%的F.gram inearum菌株分布在年均氣溫小于15℃的寒冷地區(qū)。胡迎春等［19］對(duì)2008年和2009年分離自我國(guó)冬小麥上的291株赤霉菌株進(jìn)行了分析鑒定，發(fā)現(xiàn)我國(guó)小麥主產(chǎn)區(qū)赤霉菌主要由F.gram inearum和F.asiaticum組成，且江蘇宿遷市、安徽阜陽市和河南駐馬店市是二者分界線，該線以南地區(qū)主要為F.asiaticum，該線以北的河北省以及河南省部分地區(qū)只有F.graminearum菌株。為驗(yàn)證本研究所確立方法的準(zhǔn)確性，對(duì)采自河南、河北、安徽、江蘇四省的41份樣本進(jìn)行了快速檢測(cè)，結(jié)果與上述情況及其他已報(bào)道的小麥赤霉菌種類分布情況一致［8，16-17，19，23-24，26，34-36］，表明該方法在小麥赤霉病菌種類的檢測(cè)鑒定上具有很高的準(zhǔn)確性。

綜上，本研究建立的方法可以用于小麥赤霉病菌種類的快速檢測(cè)，對(duì)明確不同地區(qū)或某一地區(qū)小麥赤霉病菌的群體組成、結(jié)構(gòu)變化及地區(qū)分布具有重要作用，并將對(duì)小麥赤霉病的田間防治起到一定的指導(dǎo)作用。

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A Rapid Detection Method for Gibberella saubinetii

ZHANG Lin，ZHANG Mengya，KANG Jian，YAN Hongfei*，LIU Daqun*
（College of Plant Protection，Agricultural University of Hebei/National Engineering Research Center for Agriculture in Northern Mountainous Areas/Biological Control Center of Plant Diseases and Plant Pests of Hebei Province，Baoding 071000，China）

To establish a rapid，simp le and exactmethod for detection of Gibberella saubinetii in China，this study extracted DNA by using diseased ear directly，and combined with specific molecularmarker for the rapid detection of Gibberella saubinetii.The genom ic DNA of Gibberella saubinetii could be rapid ly extracted and successfully detected by specificmolecularmarkerwith this detection method.Through the detection and verification of 41 samp les from four provinces（Hebei，Henan，Jiangsu and Anhui provinces），the results showed that18 samples from Anhuiand Jiangsu were Fusarium asiaticum，12 samples from Hebei were Fusarium gram inearum，and two pathogenic strains existed in the 11 samp les from Henan.The detection result consisted with the situation of regional distribution of two pathogenic strains.The method can not only achieve the effect of traditionalmethods（DNA is extracted by CTAB method），but also have the advantages of rapidness and simplicity.It can be used in the study of population structure and regional distribution of Gibberella saubinetii.

wheat；Gibberella saubinetii；rapid detection；Fusarium gram inearum；Fusarium asiaticum

S435.121.4+5

A

1004-3268（2017）01-0088-05

2016-07-30

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（2013CB127700）；河北省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（C2015204105）

張 林（1989-），男，河北石家莊人，在讀碩士研究生，研究方向：分子植物病理學(xué)。E-mail：772458080@qq.com

*通訊作者：閆紅飛（1975-），男，河北保定人，副教授，博士，主要從事植物病害生物防治與分子植物病理學(xué)研究。E-mail：hongfeiyan2006@163.com劉大群（1958-），男，河北石家莊人，教授，博士，主要從事植物病害生物防治與分子植物病理學(xué)研究。